C〇2培養(yǎng)箱 中解育12h，按分組給予不同處理：空白對(duì)照組（等量完全培養(yǎng)基），化合物（I)組設(shè)1、 2、4mmol/l，置于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，將原有培養(yǎng)液洗至5血離屯、 管中，PBS洗涂貼壁細(xì)胞2次，加入含有邸TA的適量膜酶消化細(xì)胞。室溫解育至輕輕吹打 可W使貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)時(shí)，盡量吸盡膜酶細(xì)胞消化液。加入收集的原有細(xì)胞培養(yǎng)液，稍 混勻，轉(zhuǎn)移到5血離屯、管內(nèi)，1000 g離屯、5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并 計(jì)數(shù)。取5萬(wàn)個(gè)重懸的細(xì)胞，1000 g離屯、5分鐘，棄上清，加入100yLAimexinV-門(mén)TC結(jié)合 液輕輕重懸細(xì)胞。加2mLAnnexinV-門(mén)TC,輕輕混勾。室溫避光輝育10分鐘。1000 g離屯、 5分鐘，棄上清，加入2yL艦化丙唆染色液，輕輕混勾，冰浴避光放置15min。隨即進(jìn)行流 式細(xì)胞儀檢測(cè)，AmexinV-FITC為綠色巧光，PI為紅色巧光。記錄AnnexinV-門(mén)TC+PI+和 AnnexinV-門(mén)TC+PI-作為調(diào)亡細(xì)胞，每次計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各組調(diào)亡率。
[0041] 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0042] 采用SPSS16.O進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，W均 數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。生存率的組間比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，細(xì)胞調(diào)亡率的組間比 較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a= 0. 05,P<0. 05為有顯著性差異，P<0.Ol為極有顯 著性差異。
[0043]S、結(jié)果及結(jié)論
[0044] 1、化合物（I)對(duì)U251細(xì)胞生存率的影響
[0045] 化合物（I)抑制U251細(xì)胞存活生長(zhǎng)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度化合物（I) 作用U251細(xì)胞后，隨著作用濃度増高，作用時(shí)間加長(zhǎng)，U251細(xì)胞生存率明顯下降，方差分 析顯示化合物（I)濃度因素的主效應(yīng)F= 945.8 (P<0. 01);作用時(shí)間因素的主效應(yīng)F= 302. 67 (P<0. 01)，濃度、時(shí)間因素的交互作用F= 45. 7 (P<0. 01)。結(jié)合表1，可發(fā)現(xiàn)化合物 (I)對(duì)U251細(xì)胞生存率的抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性，即化合物（I)濃度越高，作用 時(shí)間越長(zhǎng)，其抑制作用越強(qiáng)。通過(guò)計(jì)算得出化合物（I)作用24h、4她、72h的ICs。值分別 為，3. 67mmol/L、1. 37mmol/L、I.OQmmoI/I…
[0046] 2、化合物（I)對(duì)U251細(xì)胞稠亡形態(tài)學(xué)的影響
[0047] 正常組及化合物（I)處理組細(xì)胞經(jīng)化chest33258染色，巧光顯微鏡下觀察可見(jiàn) 對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，且呈淡藍(lán)色均勻著色；而經(jīng)2mmol/L化合物（I)處理48小時(shí)后， 與對(duì)照組相比，細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的固縮，顏色較為明亮，染色致密濃染，核碎裂明顯，且 可見(jiàn)典型的調(diào)亡小體。W上細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的改變提示化合物（I)有誘導(dǎo)U251細(xì)胞調(diào)亡 作用。
[004引 3、化合物（I)對(duì)U251細(xì)胞調(diào)亡率的影響
[0049] 對(duì)照組及各處理組經(jīng)AnnexinV-門(mén)TC/PI染色后行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示： 對(duì)照組、Immol/L化合物（I)、2mmol/L化合物（I)和4mol/L化合物（I)處理48小時(shí) 組細(xì)胞調(diào)亡率分別為3. 30 + 0. 98、14. 97 + 2. 67、27. 53 + 5. 51和55. 90 + 5. 1%。與對(duì)照組 相比，各處理組細(xì)胞的調(diào)亡率顯著增加（P<〇. 01)。結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0050] 結(jié)論：化合物（I)通過(guò)抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡發(fā)揮對(duì)人腦惡性膠質(zhì)母細(xì) 胞瘤U251細(xì)胞的抑制作用。運(yùn)些發(fā)現(xiàn)為化合物（I)治療膠質(zhì)瘤的臨床藥物研究提供依 據(jù)。
[0051] 表1不同濃度化合物（I)處理作用24~7化后U251細(xì)胞生存率（均數(shù)+標(biāo) 準(zhǔn)差）
[0053] 實(shí)施例3
[0054] 片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[00財(cái)實(shí)施例4
[0056] 口服液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制 成口服液。
[0057] 實(shí)施例5
[0058] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0059] 實(shí)施例6
[0060] 注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[00川實(shí)施例7
[0062] 無(wú)菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無(wú)菌注射 用水中，攬拌使溶，用無(wú)菌抽濾漏斗過(guò)濾，再無(wú)菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌 烙封得粉針劑。
[0063] 上述實(shí)施例的作用在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a)將 夏枯草的干燥成熟果穗粉碎，用75~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個(gè) 柱體積，再用75 %乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫 物浸膏；（c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、 25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4用正 相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3 個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合 物（I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：步驟（a)中，用80% 乙醇熱回流提取，合并提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述大孔樹(shù)脂為AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物 (I)和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新的三萜類(lèi)化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途，提供了該化合物結(jié)構(gòu)，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。該化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的三萜類(lèi)化合物，可以從夏枯草的干燥成熟果穗中提取、分離純化得到。體外試驗(yàn)證明該化合物通過(guò)抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)人腦惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)為化合物(Ⅰ)治療膠質(zhì)瘤的臨床藥物研究提供依據(jù)，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)成治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物。
【IPC分類(lèi)】A61P35/00, C07J71/00, A61K31/585
【公開(kāi)號(hào)】CN105294818
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510887421
【發(fā)明人】楊輝
【申請(qǐng)人】西寧意格知識(shí)產(chǎn)權(quán)咨詢(xún)服務(wù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日