min低溫離屯、，反復(fù)2次，去除上清后送檢；（8)流式細(xì)胞儀檢測SKOV3細(xì)胞的肥R2、 P-HER2蛋白的表達(dá)率。上述實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)=次。
[0046] 5、數(shù)據(jù)分析
[0047] 采用SPSS17.0的軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，W均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差狂±s)來表示。采用 單因素方差分析對計(jì)量資料進(jìn)行比較，而組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，率的比較采用卡方 檢驗(yàn)，WP<〇. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0048]S、結(jié)果及結(jié)論 W例 UMTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0050] 不同濃度的化合物（I)作用于人卵巢腺癌SK0V3細(xì)胞24、48和7化后均出現(xiàn) 明顯的細(xì)胞增殖抑制作用，表現(xiàn)為OD值（吸光度值A(chǔ)570)降低，抑制率升高；不同濃度 組之間的結(jié)果有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<〇. 05)，不同的作用時(shí)間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0. 05)，表明化合物（I)對卵巢癌SK0V3細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且其抑制率呈濃度 和時(shí)間依賴性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，濃度為20ymol/L時(shí)效果比較理想。結(jié)果見表1。
[0051] 2、PI染色法流式細(xì)胞術(shù)（FCM)檢測細(xì)胞周期的結(jié)果
[0052] 選取不同濃度（l〇、20、30ymol/L)的化合物（I)作用于SK0V34化，實(shí)驗(yàn)組較對 照組相比Ge/Gi的細(xì)胞數(shù)量呈增多趨勢，而S期和Gz/M細(xì)胞數(shù)量呈減少趨勢，W化合物（I) 濃度為20ymol/L時(shí)效果最明顯。與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0. 05)。各 實(shí)驗(yàn)組作用4化后G〇/Gi的細(xì)胞數(shù)量分別為10ymol/L組化0. 707 + 2. 382)、20ymol/L組 (69. 611 ±2. 366)、30ymol/L組化 1. 099 + 1. 577)，經(jīng)分析得知 30ymol/L組與 10ymol/ L相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.809)，其余各濃度組之間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0. 05)。各實(shí)驗(yàn)組作用4化后S期的細(xì)胞數(shù)量分別為10ymol/L組（24. 254 + 3. 244)、 20ymol/L組（19. 468 + 0. 580)、30ymol/L組（17. 743 + 1.311)，其中 30ymol/L組與 20ymol/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0. 305)，其余各濃度組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0. 05)。各實(shí)驗(yàn)組作用4化后Gz/M期的細(xì)胞數(shù)量分別為10ymol/L組（13. 276 + 0. 658)、 20ymol/L組（10. 624 + 0. 483)、30ymol/L(21. 147 + 2. 865)，其余的各濃度組之間相比差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<〇. 05)。由此可知20ymol/L的化合物（I)作用于SK0V34化的效果 是最好的，將細(xì)胞周期阻滯于Ge/Gi期，使其不能進(jìn)入S期。結(jié)果見表2(注：與對照組相比， 均P<0. 05 ;*G〇/Gi期時(shí)30ymol/L組與10ymol/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0. 809)， S期時(shí)30ymol/L與20ymol/L相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0. 305);其余G〇/Gi、S、Gz/M 各期組間相比，均P<〇.〇5。）。
[0053] 3、PI染色法流式細(xì)胞術(shù)（FCM)檢測肥R2、P-HER2的表達(dá)
[0054] 流式細(xì)胞儀檢測SK0V3細(xì)胞在應(yīng)用化合物（I)前后其表面的肥R2及P-肥R2的 表達(dá)情況，從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知20ymol/L的化合物（I)作用效果較為理想，因此本步 驟采用化合物（I) (20ymol/L)作用于SK0V3細(xì)胞4她，結(jié)果顯示應(yīng)用化合物（I)前后 肥R2蛋白表達(dá)的變化不明顯（P= 0. 13)，而P-HER2蛋白的表達(dá)有明顯不同（P<0. 05)。結(jié) 果見表3 (注：與對照組相比，沖=0. 13, #P<0. 05)。 陽05引結(jié)論，化合物（I)可抑制卵巢癌SK0V3細(xì)胞的增殖活力，本實(shí)驗(yàn)MTT的結(jié)果已經(jīng) 顯示，它影響細(xì)胞周期的分布，將腫瘤細(xì)胞阻滯在Ge/Gi期，同時(shí)可通過與EGFR/肥R2受體的 酪氨酸激酶憐酸化ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制其憐酸化，進(jìn)而下調(diào)HER2、P-HER2蛋白的表達(dá)來 誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。
[0056]表1不同濃度、不同作用時(shí)間的化合物（I)對SK0V3細(xì)胞的影響
[0058]表2不同濃度的化合物（I)作用于SK0V3細(xì)胞4化對細(xì)胞周期分布的影響(x±;s)
柳6〇] 表3 20ymol/L的化合物（I)作用于SK0V3細(xì)胞4化后肥R2、P-肥R2的表達(dá)
陽0創(chuàng)實(shí)施例3
[0063] 片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:7的比例加入賦形劑，制粒壓片。 W64] 實(shí)施例4 W65] 口服液制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成 口服液。
[0066] 實(shí)施例5
[0067] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:7的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。 W側(cè)實(shí)施例6
[0069] 注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[0070] 實(shí)施例7
[0071] 無菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無菌 烙封得粉針劑。
[0072] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含W下操作步驟：(a) 將茅替的干燥根粉碎，用70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石 油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇 萃取物；化）步驟（a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個(gè)柱體積， 再用80 %乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集80 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得80 %乙醇洗脫物浸膏； (C)步驟化）中80 %乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45:1、25:1、15:1 和1:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一 步分離，依次用體積比為20:1、15:1和8:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e) 步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水 溶液等度洗脫，收集10~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為D101 大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述用乙醇熱回流 提取采用的乙醇濃度為75%。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物 (I)和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療卵巢癌的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療卵巢癌的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于治療卵巢癌的三萜化合物及其制備方法。該化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的三萜類化合物，可以從茅莓的干燥根中提取、分離純化得到。體外試驗(yàn)證明該化合物可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖活力，影響細(xì)胞周期的分布，將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，同時(shí)可通過與EGFR/HER2受體的酪氨酸激酶磷酸化ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制其磷酸化，進(jìn)而下調(diào)HER2、P-HER2蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可以進(jìn)一步用來開發(fā)成治療卵巢癌的藥物。
【IPC分類】C07C49/743, A61K31/122, A61P35/00, C07C45/78
【公開號】CN105237380
【申請?zhí)枴緾N201510686332
【發(fā)明人】高忠青
【申請人】淄博夸克醫(yī)藥技術(shù)有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月20日