0. 2 (邸2, 19-C)，42. 3 (CH， 20-C)，10.8(CH3, 21-C)，70. 2 (CH，22-C)，33. 9 (邸2, 23-C)，37. 5 (CH，24-C)，148. 3 (C，25-C)， 109.6(邸2, 26-C)，19.8(細3, 27-C)，17. 0 (CH3, 28-C)，23. 0 (CH3, 29-C)，23. 2 (CH3, 30-C)， 16. 5(0?, 31-C);碳原子標記參見圖1。IhNMR譜顯示五個甲基單峰，兩個甲基雙峰，一對順 式二取代的雙鍵氨質(zhì)子，一個末端雙鍵，W及兩個含氧次甲基。"CNMR譜顯示31個碳信號， 分別為屯個甲基，八個亞甲基（一個為締控碳），八個次甲基（兩個含氧次甲基，兩個締控 碳）和八個季碳（一個酬幾基，一個含氧季碳，立個締控碳）。HMBC譜中，細3-29(細3-30)與 C-3,C-4和C-5W及H-2與C-1，C-4和C-IO的相關(guān)性表明，環(huán)A是1，2-二取代-4, 4-二 甲基-2,5-二締酬部分。歷8(：譜中，&-19與(：-1，(：-10，(：-5，(：-9和(：-8訊-6與(：-4，(：-5， C-7,C-8和C-IO的相關(guān)性，W及邸2化)-邸2 (7) -CH(S)自旋系統(tǒng)，表明B環(huán)為取代的環(huán)庚燒。 通過HMBC譜中邸3-31與C-23,C-24和C-25的相關(guān)性可知C-24位連有一個甲基。HMBC譜 中，C&-21與C-22W及H-22與C-21，C-23,和C-24的相關(guān)性表明C-22位連有一個徑基。 此外，邸3-27與C-24,C-25和C-26的相關(guān)性表明C-25和C-26之間存在雙鍵。綜合氨譜、 碳譜、HMBC譜和NOESY譜，W及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所 示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致（圖2)。
[0026] 實施例2:化合物（I)藥理作用試驗
[0027] 一、材料和儀器
[0028] 人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞株SK0V3由蘭州大學(xué)的醫(yī)學(xué)實驗中屯、提供。通用 RPMI-1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清）培養(yǎng)?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于98%。 RPMI-1640培養(yǎng)液、四甲基偶氮挫藍（MTT)、二甲基亞諷值MS0)、心谷氨酷胺科吳生物工程 有限公司。膜蛋白酶購于美國Sigma公司。胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公 司。十二院基橫酸鋼（SD巧購于西安周鼎生物技術(shù)有限責(zé)任公司。肥R2 (FITC標記）購于 北京博奧森生物技術(shù)有限公司。酸化肥R2 (門TC標記）購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。 青霉素、鏈霉素購于華北制藥廠。
[0029]C〇2培養(yǎng)箱Oferaeus,BB5060UV)，德國倒置相差顯微鏡（OLYMPUS,CK-40)，日本巧 光顯微鏡（OLYMPUSOPTICALAXSO,日本），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），酶標分 析儀度IO-T邸公司，美國），低溫高速離屯、機度eckman-Coulter公司，德國），Epics化流 式細胞儀度eckman-Coulter公司，德國），R-3850型自動臺式滅火器（山東新華醫(yī)療器械 股份有限公司），畑G-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科技有限公司），KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴箱（上海梅香儀器有限公 司），BS400S電子分子天平（北京賽多利斯天平有限公司），08-2恒溫磁力攬拌器（上海天 平儀器廠），lDL-5普通離屯、機（上海安亭科學(xué)儀器廠），低溫冰箱（日本S洋公司），電子 制冰箱（日本=洋公司），細胞凍存管（上海生工生物工程有限公司），96孔板（科吳生物 工程有限公司）。
[0030] 二、試驗方法 陽0川 1、細胞培養(yǎng)
[0032] 1. 1細胞復(fù)蘇
[0033] 將凍存管迅速從液氮中取出后立即放入37°C溫水中，輕輕晃動凍存管，使凍存物 盡快溶解，將其放入超凈工作臺中，將其內(nèi)的細胞懸液移入離屯、管，再向離屯、管中加入10 倍1?^1-1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清），離屯、，800巧111/111111，離屯、5~10111111，棄上清，細胞 沉淀中加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，輕搖均勻，置37°C、5%C〇2濃度的培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。并注明細胞名稱及日期。
[0034] 1. 2細胞傳代培養(yǎng)
[0035] 待SK0V3細胞長至80~90%培養(yǎng)瓶時，棄去原有的培養(yǎng)液，并用配好的PBS洗兩 遍；用0. 25%的膜酶消化，放在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)見細胞回縮、細胞間隙增大、形態(tài)變 圓時棄去消化液，加入一定量的培養(yǎng)液中和膜酶消化液，并用吸管輕輕吹打已經(jīng)消化過的 細胞.，使其脫離培養(yǎng)瓶，800rpm/min離屯、5min，棄上清；顯微鏡下在計數(shù)板上進行細胞計 數(shù)，按1:3比例傳代，分裝至培養(yǎng)瓶中，再次補充適量培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。注意嚴格無菌操 作，每天觀察細胞生長情況。
[0036] 1. 3細胞凍存
[0037] 取對數(shù)生長期的細胞W0. 25 %的膜蛋白酶消化后離心PBS洗2次，在低速離屯、機 上1000巧m離屯、5min，棄上清液，加入1血于-20°c下預(yù)冷的含DMSO的細胞凍存液，用吸管 吹打均勻后移入凍存管中，用封口膜封口標記后放入4°C靜置30min，之后-20°C放置化后 轉(zhuǎn)入-80°C。一個月內(nèi)使用的細胞可保存于-80°C中，長期保存者24h后應(yīng)由-80°C移入液 氮中。細胞的復(fù)蘇與凍存應(yīng)遵循的原則為慢凍快融。 陽03引 2、四甲基偶氮藍（MTT)實驗
[0039] (1)選擇對數(shù)生長期的細胞（生長80-90% )時，用配好的0. 25%膜酶將細胞消。 化好W后，輕輕地吹打制成單細胞懸液，調(diào)整的最終的細胞濃度為8XIO4AiL;似取3個96 孔板，每個時間點1板，100yL/孔，每孔細胞數(shù)為IO4做好分組標志；做細胞貼壁后分組， 設(shè)空白組（不接種細胞）、對照組（只含等量溶劑）及實驗組（加不同濃度的化合物（I)， 其終濃度分別為0. 1、1、10、20、30和60ymo1/L)，每組設(shè)6個復(fù)孔；（4) 37°C、5 %C〇2條件下 分別培養(yǎng)24、48和72h; (5)時間到后，吸去上清液后每孔加5g/L的MTT10yL; (6)培養(yǎng) 地后加入10yLDMS0,在多功能微板測試系統(tǒng)上W490nm波長測定各孔光密度OD值；（7) 藥物對細胞抑制率的計算：
[0040] 抑制率（％ )=(對照組細胞數(shù)-實驗組細胞數(shù)）/對照組細胞數(shù)X100%。
[0041] 實驗至少重復(fù)S次。 陽0創(chuàng) 3、PI染色法流式細胞術(shù)（FCM)檢測細胞周期及調(diào)亡
[0043] (1)取對數(shù)生長期的SK0V3細胞，先用配好的膜酶消化后輕輕吹打制成單細胞懸 液，調(diào)整細胞濃度為6Xl〇5/mL;似W6Xl〇5/mL的密度接種于50血的培養(yǎng)瓶中，于37°C、 5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;(3)24h后將原來的培養(yǎng)液吸出，加入同等量（7. 5mL)的、含不 同濃度（0、10、20和30ymol/L)的化合物（I)的培養(yǎng)液，繼續(xù)于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)4她；（4) 4化后收集細胞，用0. 25 %膜酶消化后輕輕吹打制成單細胞懸液，將其移入離 屯、管后，WlOOOr/min離屯、，離屯、lOmin，棄去上清液，并用4°C的70%的冰乙醇固定，放置 4°C的冰箱過夜；(5)次日用憐酸鹽緩沖液PBS清洗、離屯、，棄上清后檢測加入核糖核酸酶 (RNAase) 150yL和艦化丙晚（PI)染液150y以在室溫條件下避光染色30min，運用流式細 胞儀檢測細胞的周期分布及調(diào)亡情況。實驗重復(fù)=次，并應(yīng)用軟件進行分析。
[0044] 4、PI染色法流式細胞術(shù)（FCM)檢測肥R2、P-HER2蛋白的表達率
[0045] (1)取對數(shù)生長期的SK0V3細胞，先用0.25%膜酶消化后輕輕吹打制成單細胞懸 液，調(diào)整細胞濃度為1Xl〇6/mL;似W1Xl〇6/mL的密度接種于50血的培養(yǎng)瓶中，于37°C、 5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地；（3)24h后吸出原有的培養(yǎng)液，加入同等量（12. 5mL)的、含濃度 為20ymol/L的化合物（I)的培養(yǎng)液（實驗組）和不含藥物的培養(yǎng)液（對照組），繼續(xù) 于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4她；(4) 4她后收集細胞，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液先移入離屯、管 內(nèi)，再用0. 25 %的膜蛋白酶消化，保證培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞及營養(yǎng)液都移入離屯、管，按1000 r/ min離心IOmin; (5)再加入PBS按1000轉(zhuǎn)/min離屯、lOmin，重復(fù)兩次；(6)待測管內(nèi)有 100yL樣品，向?qū)嶒灲M和對照組分別加入30yLFITC標記的肥R2、P-HER2抗體受體（用 PH= 7. 4、0.OlM的PBS溶解，并按1:60稀釋），4°C解育30min; (7)加入細胞洗液，1200轉(zhuǎn) /min,IO