-(4-甲氧基苯基）-2H_苯并三唑 (RS049)的制備
[0224] 將苯乙酸置換成4-三氟甲基苯甲酸，按制備化合物RS042的方法制備RS049。1H NMR(DMS0, 300MHz) : δ 8. 06-8. 03 (m，2H)，7. 71-7. 60 (m，5H)，7. 11-6. 96 (m，4H)，6. 42-6. 41 ( m, 1H), 4. 47-4. 45 (m, 2H), 3. 80 (s, 3H).
[0225] 實(shí)施例l-50、5-(N-3-溴芐基氨基）-2-(4-甲氧基苯基）-2H-苯并三唑（RS050) 的制備
[0226] 將苯乙酸置換成3-溴苯甲酸，按制備化合物RS042的方法制備RS050。1H 匪R (DMSO, 300MHz) : δ 8. 07 (s，J = 9. 0Hz，2H)，7. 70 (d，J = 8. 7Hz，1H)，7. 62 (s，1H) ，7· 45-7. 28 (m，3H)，7· 13-7. 07 (m，2H)，6· 91-6. 87 (m，1H)，6· 48 (s，1H)，4· 38 (d，J = 0. 6Ηζ, 2Η), 3. 83 (s, 3Η).
[0227] 實(shí)施例1-51、5-(^2-(3,4,5-三甲氧基苯基）乙基氨基）-2_(4-甲氧基苯 基）-2Η-苯并三唑（RS051)的制備
[0228] 將苯乙酸置換成3,4, 5-三甲氧基苯乙酸，按制備化合物RS042的方法制備RS051。 1H NMR (DMS0, 300ΜΗζ): δ 8.11 (d，J = 9·0Ηζ，2Η)，7.69 (d，J = 9.3Hz，1Η)，7.14 (d，J = 9. 3Hz, 2H), 7. 03 (dd, J= 1.81. 8Hz, 1H), 6. 63 (s, 3H), 6. 32-6. 28 (m, 1H), 3. 38 (s, 2H), 3. 78 (s, 9H), 2. 87-2. 86 (m, 2H).
[0229] 實(shí)施例l-52、5-(N_(2-呋喃甲基）氨基）-2-(4-甲氧基苯基）-2H_苯并三唑 (RS052)的制備
[0230] 將苯乙酸置換成2-呋喃甲酸，按制備化合物RS042的方法制 備 RSO52 〇 1H NMR (DMSO, 300MHz) : δ 8. 10 (d, J = 8. 7Hz, 2H) , 7. 68 (d, J = 9. 3Hz, 1H), 7. 60 (s, 1H), 7. 13 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 05 (d, J = 9. 0Hz, 1H), 6. 67 (s, 2H), 6. 41 (s, 1H), 4. 33 (d, J = 5. 4Hz, 2H) 3. 83 (s, 3H).
[0231] 實(shí)施例1-53、1_氯-N-[2_(4-甲氧基苯基）-2H_苯并三唑-5-基]-乙酰胺 (RS053)的制備
[0232] 將2-(4-甲氧基苯基）-5-氨基-2H-苯并三氮唑（0. 16g，0. 67mmol)和三乙胺 (0.5ml)溶解于二氯甲烷（IOml)中，在冰浴條件下滴加的氯乙酰氯（0.2ml)，用TLC進(jìn)行 檢測直至反應(yīng)完全。減壓蒸餾除去溶劑，用水和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，合并有機(jī)相，減壓蒸 餾得到粗品，用柱色譜進(jìn)行分離得到純的產(chǎn)物1-氯-N_[2-(4-甲氧基苯基）-2H-苯并三 唑-5-基]-乙酰胺（0· 17g，產(chǎn)率 75 % )。1H NMR (DMSO, 300MHz) : δ 10. 62 (s, 1H)，8. 43 (s, 1Η), 8. 20 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 99-7. 96 (m, 1H), 7. 48 (dd, J = I. 51. 5Hz, 1H), 7. 17 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 4. 34 (s, 2H), 3. 85 (s, 3H).
[0233] 實(shí)施例l-54、3-氯-N-[2_(4-甲氧基苯基）-2H_苯并三唑-5-基]-丁酰胺 (RS054)的制備
[0234] 將氯乙酰氯置換成3-氯丙酰氯，按制備化合物RS053的方法制備RS054。1H NMR (DMSO, 300MHz) : δ 10. 27 (s，1H)，8. 44 (s，1H)，8. 18 (d，J = 9. 0Hz，2H)，7. 94 (d，J = 9. 3Hz, 1H), 7. 47 (dd, J = I. 8, I. 8Hz, 1H), 7. 17 (d, J = 9Hz, 2H), 3. 85 (s, 3H), 3. 73 (t, J = 6. 4Hz, 2H), 2. 59-2. 50 (m, 2H), 2. 13-2. 01 (m, 2H).
[0235] 實(shí)施例l-55、3-[2_(4-甲氧基苯基）-2H_苯并三唑-5-基氨基甲?；鵠-丙烯酸 (RS055)的制備
[0236] 將氯乙酰氯置換成馬來酸酐，按制備化合物RS053的方法制備RS055。1H匪 R(DMS0, 300MHz) : δ 10. 44(s, 1H), 8. 56(s, 1H), 8. 20(d, J = 9. 0Hz, 2H), 7. 97 (d, J = 9. 0Hz, 1H), 7. 53 (dd, J = I. 51. 5Hz, 1H), 7. 17 (d, J = 9. 0Hz, 2H), 6. 55-6. 30 (m, 2H), 5. 82 (d d, J = 1.51. 8Hz, 1H), 3. 85 (s, 3H).
[0237] 實(shí)施例1-56、三氟甲基-N-[2-(4-甲氧基苯基）-2H_苯并三唑-5-基]-乙酰胺 (RS056)的制備
[0238] 將氯乙酰氯置換成三氟甲基乙酰氯，按制備化合物RS053的方法制備RS056。1H NMR(DMS0, 300MHz) : δ 11. 52(s, 1H), 8. 40(s, 1H), 8. 21 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 8. 04 (d, J = 8. 7Hz, 1H), 7. 70 (d, J = 9. 0Hz, 1H), 7. 17 (t, J = 7. 8Hz, 2H), 3. 86 (s, 3H).
[0239] 實(shí)施例1-57、硝酸2-((2-(4-甲氧基苯基）-2H_苯并三唑-5-基）氨基-2-氧代 乙基酯（RS057)的制備
[0240] 將2-溴-N- [2- (4-甲氧基苯基）-2H-苯并三唑-5-基]-乙酰胺（0· 18g， 0. 50mmol)溶解于丙酮（IOml)中，加硝酸銀（0. 23g, I. 35mmol)，進(jìn)行攪拌，直至反應(yīng)完 全。減壓蒸餾丙酮，用水和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，合并有機(jī)相，減壓蒸餾，得到粗品，經(jīng)柱色 譜進(jìn)行分離，得到純的產(chǎn)物 0. 16g，產(chǎn)率 96 %。1H NMR(DMSO, 300MHz) : δ 10. 60 (s, 1H)， 8. 41(d, J = 9. 0Hz, 1H) ,8. 20(d, J = 9. 3Hz, 2H), 7. 97 (d, J = 9. 0Hz, 1H), 7. 47 (dd, J = 1. 51. 5Hz, 1H), 7. 17 (d, J = 9Hz, 2H), 4. 32 (s, 2H), 3. 84 (s, 3H).
[0241] 實(shí)施例二：本發(fā)明化合物對RAS突變細(xì)胞增殖的抑制作用
[0242] 本發(fā)明化合物首先在T29細(xì)胞系（RAS野生型）以及T29KT1P細(xì)胞系（RAS突變型） 上進(jìn)行活性評價。對這兩株細(xì)胞的具體描述為：在人卵巢表層上原代皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)入SV40病 毒的早期區(qū)段得到I0SE-29細(xì)胞系，該病毒的早期區(qū)段編碼表達(dá)大T和小T抗原，能抑制 p53和pRb信號通路并延長細(xì)胞周期，可以使I0SE-29在第10代還能保持著正常上皮細(xì)胞 的絕大多數(shù)特性。隨后，應(yīng)用包含全長hTERT cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染I0SE-29細(xì)胞得到永 生化的T29細(xì)胞株，同時再感染包含pBabe-pur〇-KRASV12的病毒得到T29KT1P細(xì)胞。這兩 種逆轉(zhuǎn)錄病毒的構(gòu)建是應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法在雙嗜性的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系Phoenix細(xì) 胞中分別轉(zhuǎn)入pBabe-hygro-hTERT或pBabe-puro_KRASV12的質(zhì)粒得到，然后收集病毒上清， 分別感染I0SE-29細(xì)胞得到相應(yīng)的細(xì)胞系。病毒感染后的細(xì)胞系，經(jīng)過潮霉素（100微克/ 毫升，7天）和嘌呤霉素（0. 5微克/毫升，5天）進(jìn)行篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)的永生化正常上 皮細(xì)胞（T29)以及高表達(dá)KRAS蛋白（T29KT1P)上皮細(xì)胞，其中攜有KRAS v12質(zhì)粒的T29KT1P 細(xì)胞具有癌細(xì)胞特性，可在小鼠皮下成瘤。培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基是由MCDB105和M199培 養(yǎng)基1:1混合之后加入10%滅活的胎牛血清、1 %的青/鏈霉素，細(xì)胞置于37°C含5% C02， 95 %空氣飽和濕度恒溫溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0243] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
[0244] 除做特殊說明，所有結(jié)果均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)表示。應(yīng)用Microsoft Excel或GraphPad Prism Software version 5.0.軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。兩樣本間的比 較采用"雙尾非成對的Student' s T檢驗(yàn)；多樣本間的比較采用單因素方差分析（One-way AN0VA)。顯著性差異以P值表示，P〈0. 05即認(rèn)為組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P〈0. 05(*)， P〈0. 01 (**)，P〈0. 001 (***)。其他特殊的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析詳見相關(guān)部分說明。
[0245] 本論文篩選化合物的方法為5-[3-(羧基甲氧基）苯基]-3-(4, 5-二甲基-2-噻 唑基）-2-(4-磺基苯基）-2!1-四唑內(nèi)鹽（10'3)實(shí)驗(yàn)方法：將了29和了291(1'1?細(xì)胞鋪到96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個孔的細(xì)胞數(shù)為4000,待細(xì)胞貼壁24小時后，用不同化合物以及同一化 合物不同濃度處理兩種細(xì)胞，48小時之后加入MTS測定細(xì)胞的存活率。
[0246] 細(xì)胞相對存活率如表2所示：
[0247] 表2本發(fā)明化合物（RS001-RS057)對T29KT1P和T29細(xì)胞的增殖抑制結(jié)果
[0248]

[0250] 由表2中結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，相對于RAS野生型的T29細(xì)胞系的抑制效果，目標(biāo)化合物 RS001-RS057對RAS突變的T29KT1P細(xì)胞都具有非常優(yōu)異的活性和選擇性（表2和圖1)， RAS突變T29KT1P的半數(shù)抑制率濃度為3微摩爾/升，RAS野生型T29的半數(shù)抑制率濃度為 23微摩爾/升。說明這類化合物具有特異性抑制RAS突變細(xì)胞增殖活性的能力。
[0251] 實(shí)施例三：本發(fā)明化合物對K-RAS突變的腫瘤細(xì)胞增殖的抑制實(shí)驗(yàn)
[0252] 為考察本發(fā)明化合物對K-RAS突變腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果，我們選取了 K-RAS 突變的肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓癌細(xì)胞、胃 癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與K-RAS野 生型的腫瘤細(xì)胞（包括K-RAS野生型的肺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞等）（表3)并對化合物的 抑制活性進(jìn)行測試?；緶y試過程如下：取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接入 100微升含2, 000-5, 000個細(xì)胞的懸液，待細(xì)胞貼壁且處于對數(shù)生長期時（24小時后）加 入不同的藥物處理，每個濃度設(shè)置4-6個復(fù)孔；藥物作用48小時后，應(yīng)用CellTiter貨6齒 AQueous One Solution細(xì)胞增殖檢測試劑盒（MTS)進(jìn)行細(xì)胞存活率的檢測，每孔加入20微 升MTS試劑，37°C孵育1-2小時后，酶標(biāo)儀490納米波長下檢測各孔的吸光值。將對照組細(xì) 胞存活率作為100%，其他各組吸光值與對照組吸光值相比較，計(jì)算出相應(yīng)的存活率。
[0253] 試驗(yàn)中所選用K-RAS突變腫瘤細(xì)胞系與K-RAS野生型腫瘤細(xì)胞系如表3所示：
[0254] 表3 K-RAS突變腫瘤細(xì)胞系與K-RAS野生型腫瘤細(xì)胞系

[0257] 由圖 2 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明化合物 RS001-RS003、RS009-RS012、RS018、RS019、RS024、 RS026、RS029-RS031、RS038、RS048、RS051-RS057 等在 10 微摩爾 / 升濃度下顯著抑制了 K-RAS突變的腫瘤細(xì)胞（肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、多發(fā) 性骨髓癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì) 瘤細(xì)胞）的增殖活性，并且與K-RAS野生型腫瘤細(xì)胞的抑制活性相比呈現(xiàn)出明顯的選擇性， 差異具有顯著性。在5微摩爾/升濃度下表現(xiàn)出更好的選擇性，本發(fā)明化合物組對K-RAS 突變的腫瘤細(xì)胞（肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓 癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì) 胞）的相對抑制率都在50%以上，而對K-RAS野生型腫瘤細(xì)胞的抑制率在20%左右。其 它化合物 RS004-RS008、RS013-RS017、RS020-RS023、RS025、RS027、RS028、RS032-RS037、 RS039-RS047和RS049-RS050對K-RAS突變的腫瘤細(xì)胞包括肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì) 胞、乳腺癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、前列 腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制也都表現(xiàn)出相似的抑制效果。
[0258] 實(shí)施例四：本發(fā)明化合物對RAS突變腫瘤細(xì)胞克隆形成的抑制作用
[0259] 細(xì)胞存活率的檢測只表示了短期的貼壁細(xì)胞的個數(shù)，但貼壁的細(xì)胞不能保證每一 個都有繼續(xù)增殖和形成克隆的能力；而能形成克隆的細(xì)胞必須為貼壁的且具有增殖活力的 細(xì)胞，因此，克隆形成率更能反映腫瘤細(xì)胞持續(xù)生長的增殖能力以及群體依賴性。為了考察 本發(fā)明化合物對RAS突變腫瘤細(xì)胞是否具有不可逆的生長抑制作用，我們應(yīng)用A549 RAS突 變細(xì)胞來研究藥物組合對細(xì)胞2D和3D克隆形成的抑制作用。2D克隆形成實(shí)驗(yàn)的過程為： 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用胰酶消化并吹打成單個細(xì)胞，按每孔800-1000個細(xì)胞的密度 均勻接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的藥物處理，每2-3天更換一次新鮮的 培養(yǎng)基和藥物，置37°C、5% 0)2及飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)一周，可觀察到6孔板中出現(xiàn)肉 眼可見的克隆，棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加入4%的多聚甲醛固定15分鐘。然后 去固定液，加適量〇. 1 %結(jié)晶紫染色10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。 計(jì)數(shù)含50個細(xì)胞以上的克隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率。3D(軟瓊脂糖）克隆形成實(shí)驗(yàn)的過程 為：將I. 2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2X細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0. 6%的底層瓊脂，6 孔板中每個孔1. 4毫升溫室凝固，取對數(shù)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后吹散成單個細(xì)胞懸液，計(jì) 數(shù)，并稀釋細(xì)胞懸液至濃度為10000個/毫升，將〇. 7 %低熔點(diǎn)瓊脂糖與2 X細(xì)胞培養(yǎng)基以 1:1的體積比混合，制備0. 35%的上層瓊脂，每孔加1毫升上層瓊脂和100微升單細(xì)胞懸液 (約1000細(xì)胞每孔），混勻，室溫凝固。置于37°C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計(jì) 數(shù)含50個細(xì)胞以上得克隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率。同時在顯微鏡下拍照，放大倍數(shù)為40 X。
[0260] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3 所示，本發(fā)明化