一種聚酮化合物及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及從一株刺囊殼屬真菌（Ascotricha sp.）中分離得到的一個具有抗腫瘤活性的聚酮化合物及其制備方法。本發(fā)明所涉及的化合物結(jié)構(gòu)新穎，對人急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞株和人白血病K562細(xì)胞株具有顯著的生長抑制作用，并且其發(fā)酵工藝和提取分離方法簡便，有利于對其進(jìn)行進(jìn)一步的藥理和臨床研究，開發(fā)其在制備抗白血病藥物中的應(yīng)用。CGMCC No.827820130927
【專利說明】
一種聚酮化合物及其制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及從一株刺囊殼屬（Ascotricha sp. ZJ-M-5)真菌發(fā) 酵所得菌絲體中分離得到的一種具有抑制人白血病細(xì)胞株生長的聚酮化合物及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎并具有抗腫瘤、抗感染等多樣生物活性的次級代謝產(chǎn) 物，因此從微生物中尋找藥物先導(dǎo)化合物一直是創(chuàng)新藥物研究的熱點。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng) 采用提供豐富營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)其生產(chǎn)的方式，然而在此條件下，大多數(shù)微生物的合成次級代 謝產(chǎn)物的基因處于沉默狀態(tài)，導(dǎo)致產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物數(shù)量較少，含量較低，并且往往產(chǎn) 生很多諸如脂肪酸、環(huán)二肽等非活性物質(zhì)干擾提取分離。有鑒于此，Axel Zeeck等人提出 OSMAC (one strain many compounds，單菌多物）策略（ChemBioChem，2002, 3 :619_627)，即 通過改變培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及添加酶抑制劑等方法，激活在傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下微生物次 級代謝的"沉默途徑"，從而獲取結(jié)構(gòu)更為新穎、活性更為多樣和產(chǎn)量更為豐富的微生物來 源活性天然產(chǎn)物。
[0003] 刺囊殼屬真菌（Ascotricha sp. ZJ-M-5)是通過化學(xué)和生物活性篩選，從浙江奉化 市莼湖鎮(zhèn)桐照村黃灘涂地的海泥樣品中分離得到的一株能夠產(chǎn)生抗腫瘤化合物的微生物。 發(fā)明人前期工作中，從該菌株含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中獲得了環(huán)橙花二醇類 衍生物（Natural Product Research，2013,27 :847-850)和一個 C3,4 位裂環(huán)的羊毛脂烷 型三萜類化合物（藥學(xué)學(xué)報，2013,48 :89-93)。然而，采用0SMAC策略，通過改變培養(yǎng)基組 成，發(fā)現(xiàn)該菌株在寡營養(yǎng)條件下的次級代謝與在含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基條件下的次級代 謝存在顯著的差異。從其寡營養(yǎng)培養(yǎng)物的菌絲體中，通過簡單的提取分離工藝，得到了一個 新的具有28元大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的聚酮化合物。
[0004] 大環(huán)多聚內(nèi)酯類化合物在自然界非常罕見，僅由真菌產(chǎn)生，從生合成角度考慮為 醋酸-丙二酸途徑合成的不同片段之間相互縮合而成。目前報道的該類結(jié)構(gòu)主要由2, 4-二 羥基-6- (2-羥基丙基）-苯甲酸片段和3-羥基丁酸或3, 4-二羥基丁酸片段組成，如NG-011 和 NG012 (The Journal of Antibiotics，1992,45:1559-1565)，BK223-B 和 BK223-C (The Journal of Antibiotics，1993,46:1101_1108)，以及從Hypoxylon oceanicum LL-15G256 菌株中分離得到的 15G156a 系列衍生物（The Journal of Antibiotics，1998, 51: 296-302 ;Tetrahedron，2002, 58 :6825-6835)。但如式 I 結(jié)構(gòu)中，含有 2, 4-二羥基-6- (4-羥 基-2-酮-戊基）_苯甲酸片段的大環(huán)多聚內(nèi)酯類化合物國內(nèi)外均未見報道。大環(huán)多聚內(nèi) 酯類化合物目前報道具有抗真菌和神經(jīng)生長因子促進(jìn)作用，但其抗腫瘤活性，尤其是對白 血病細(xì)胞株的生長抑制作用國內(nèi)外均未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種從刺囊殼屬真菌Ascotricha sp. ZJ-M-5中分離得到的對人白血 病細(xì)胞株具有顯著生長抑制作用的聚酮化合物。本發(fā)明所述化合物的結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0006]
[0007] 本發(fā)明的制備技術(shù)方案包括如下步驟：
[0008] 挑取刺囊殼屬真菌（Ascotricha sp. ZJ-M-5,保藏號CGMCC No. 8278)的孢子，直 接接種到液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)7~56天，其中培養(yǎng)基由蒸餾水配制，包含蔗糖2~4%， NaN0 30. 2 ~0? 4 %，CaCl2 0? 12 ~0? 92 %，K2HP04 0? 05 ~0? 15 %，KC1 0? 03 ~0? 07 %， FeS04 WHW0.00 05~0. 0015%，培養(yǎng)溫度為20~30°C。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過濾除去發(fā)酵液后，菌 絲體采用丙酮超聲提取1~3次，將提取物合并后經(jīng)1~20倍量200~300目硅膠柱色譜 分離，以體積配比為5 :1-1 :1的石油醚-丙酮混合溶劑梯度洗脫，其中體積配比為3 :1的 石油醚-丙酮混合溶劑洗脫部分得到式I化合物。
[0009] 所得化合物經(jīng)過系統(tǒng)結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果如下：主要利用高分辨電噴霧質(zhì)譜、二級低分 辨電噴霧質(zhì)譜、核磁共振譜（ :H NMR，13C NMR，2D-NMR)。
[0010] 式I化合物為白色粉末（甲醇），[a ]2°D-52. 0° (c 0. 25, CH30H)，易溶于甲醇。
[0011] HRESI-MS (圖 1)給出準(zhǔn)分子離子峰 m/z :819. 2465[M+Na]+，795. 2501[M-H]確定 化合物分子式為c4〇h44o17。
[0012] 蟲 NMR(600MHz，DMS0-d6)譜（圖 2)中給出 6 個酚羥基質(zhì)子信號：S 10.80(lH，s)、 10. 36 (1H，s)、10. 28 (1H，s)、10. 19 (1H，s)、9. 90 (1H，s)、9. 86 (1H，s)，在 S 6. 23 (1H，d，J = 2. 3Hz)和6. 14 (1H，d，J = 2. 3Hz)處給出一組間位偶合的芳香質(zhì)子信號，在S 6. 16~6. 18 范圍內(nèi)給出4個呈單峰的芳香質(zhì)子信號，在S5. 35(2H，m)、5. 30(1H，m)和4. 99(2H，m)處 給出5個sp3雜化的連氧次甲基質(zhì)子信號，在S 3. 89(1H，d，J = 17. 4Hz)和3. 78(1H，d，J =17. 4Hz)處給出sp3雜化亞甲基上一組偕偶的質(zhì)子信號，在S 2. 61~3. 03處給出10個 sp3雜化碳上質(zhì)子信號，在高場區(qū)給出5個甲基雙峰質(zhì)子信號：S 1. 30 (3H，d，J = 6. 2Hz)、 1. 25 (3H，d，J = 6. 2Hz)、1. 19 (3H，d，J = 6. 2Hz)、1. 11 (3H，d，J = 6. 2Hz)和 1. 08 (3H，d，J =6. 2Hz)。13C NMR(150MHz，DMS0-d6)譜（圖3)中共給出40個碳信號，其中包括1個酮羰 基碳信號：S 204. 3, 5個酯羰基碳信號：S 169. 3、169. 2、168. 6、168. 3和168. 2,18個苯環(huán) 上的碳信號，5個sp3雜化的連氧次甲基碳信號：S 71. 3、71. 2、68. 2、68. 1和67. 6,6個sp3雜 化的亞甲基碳信號：S 49. 4、46. 9、40. 2、40. 0、39. 6和39. 4,以及5個甲基碳信號：S 19. 8、 19. 4、19. 3、19. 2和19. 2。通過HSQC (圖4)圖譜將以上碳?xì)湫盘枤w屬，進(jìn)一步通過HMBC (圖 5)圖譜推導(dǎo)出式I化合物結(jié)構(gòu)中存在兩個3-羥基丁酸片段，兩個2, 4-二羥基-6-(2-羥 基丙基）-苯甲酸片段和一個2, 4-二羥基-6- (4-羥基-2-酮-戊基）-苯甲酸片段，并通 過HMBC譜（圖5)歸屬了上述5個片段中的碳?xì)湫盘?。從上述片段中連氧次甲基質(zhì)子信號 位于較低場區(qū)及酯羰基碳信號化學(xué)位移大小，結(jié)合化合物分子式判斷，以上各片段中羧基 均和另一個片段的醇羥基形成酯，即式I化合物結(jié)構(gòu)中不存在游離的羧基和醇羥基，而是 一個大環(huán)多聚內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。由于在HMBC(圖5)譜圖中沒有觀察到各片段之間連氧次甲基質(zhì) 子信號和相應(yīng)酯羰基之間的遠(yuǎn)程相關(guān)，片段之間的連接方式借助低分辨ESI-MS (圖6)二級 碎片離子（圖7)的結(jié)構(gòu)歸屬來完成。在負(fù)離子模式下，對m/z 795. 4[M-H]進(jìn)行裂解（圖 8)，可以觀察到其發(fā)生麥?zhǔn)现嘏藕竺撊?個2, 4-二羥基-6- (2-羥基丙基）-苯甲酸片段后 形成的m/z 601. 1碎片（圖8)，該碎片繼續(xù)脫去1個3-羥基丁酸片段后形成的m/z 515. 1 碎片（圖8)，以及m/z 515. 1碎片脫去1個2, 4-二羥基-6- (2-羥基丙基）-苯甲酸片段后 形成的m/z 320. 9碎片（圖8)，m/z 515. 1碎片發(fā)生麥?zhǔn)现嘏判纬傻膍/z 279. 0碎片（圖 8)，m/z 515. 1碎片脫去[2, 4-二羥基-6-(2-羥基丙基）-苯甲酸-3-羥基丁酸酯]形成 的m/z 234. 9碎片（圖8)，以及m/z 515. 1碎片脫去1個2, 4-二羥基-6-(2-酮-3-戊烯 基）_苯甲醛形成的m/z 296. 9碎片（圖8)。以上碎片可以很明確地將式I化合物各個片 段的連接順序確定為[2, 4-二羥基-6-(4-羥基-2-酮-戊基）-苯甲酸]-[2, 4-二羥 基-6- (2-羥基丙基）-苯甲酸]-[3-羥基丁酸]-[2, 4-二羥基-6- (2-羥基丙基）-苯 甲酸]-[3-羥基丁酸]，然后末端的3-羥基丁酸片段的醇羥基又與2, 4-二羥基-6-(4-羥 基-2-酮-戊基）_苯甲酸的羧基成酯，從而形成式I化合物的28元大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。其各 結(jié)構(gòu)片段 1H NMR和13C NMR信號歸屬于表1中。
[0013]
[0014] 表1.式I化合物的1H NMR和13C NMR信號歸屬
[0015]
[0016] 式I化合物結(jié)構(gòu)中手性碳原子的絕對構(gòu)型通過對其生合成片段測試比旋光度 或圓二色譜（CD)進(jìn)行確定。其中從該菌株的發(fā)酵液中，分離得到比旋光度為-54.4°的 orthosporin，而文獻(xiàn)[Tetrahedron，1996, 52 :7159_7162]中該化合物結(jié)構(gòu)中手性碳為S 構(gòu)型時其旋光方向為右旋，由于orthosporin應(yīng)該為2, 4-二羥基-6-(4_羥基-2-酮-戊 基）_苯甲酸通過分子內(nèi)烯醇化和酯化反應(yīng)而得，因此確定式I化合物結(jié)構(gòu)中2, 4-二羥 基-6-(4-羥基-2-酮-戊基）-苯甲酸片段的C-11位手性碳為R構(gòu)型。此外，從該菌株發(fā) 酵液中，分離得到6-hydroxymellein，測得其⑶圖譜（圖9)與文獻(xiàn)[Tetrahedron，2002， 58 :6825-6835]中報道的手性碳為R構(gòu)型，且旋光方向為左旋的該化合物的⑶圖譜一致， 即在267nm呈負(fù)的Cotton效應(yīng)，由于6-hydroxymellein應(yīng)該為2, 4-二羥基_6-(2_羥基丙 基）-苯甲酸通過分子內(nèi)酯化反應(yīng)而得，因此確定式I化合物結(jié)構(gòu)中2, 4-二羥基-6- (2-羥 基丙基）-苯甲酸片段的手性中心，即C-21和C-35位為R構(gòu)型。根據(jù)生合成途徑中3-羥 基丁酸片段應(yīng)該與2, 4-二羥基-6-(4-羥基-2-酮-戊基）-苯甲酸片段和2, 4-二羥 基-6-(2-羥基丙基）-苯甲酸片段共用相同的酮基還原酶，以及式I化合物比旋光度也為 左旋，確定3-羥基丁酸片段中手性中心，即C-25和C-39位手性碳為R構(gòu)型。綜上，確定了 式I化合物的平面結(jié)構(gòu)及絕對構(gòu)型。
[0017] 對所得到的式I化合物進(jìn)行人白血病細(xì)胞株生長抑制活性的測試。實驗結(jié)果表明 式I化合物在體外對人急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞株和人白血病K562細(xì)胞株具有顯著 的生長抑制作用，GI5。值為6. 7~7. 7 y M，且作用強(qiáng)度均高于陽性對照藥順鉑數(shù)倍，因此，本 發(fā)明所述的新聚酮化合物具有制備臨床白血病預(yù)防和治療藥物的前景。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點在于，所得到的化合物結(jié)構(gòu)新穎，在國內(nèi)外未見其結(jié)構(gòu)類似物的報 道，且其具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性。其發(fā)酵培養(yǎng)基組成簡單，提取分離方法簡易，發(fā)酵 產(chǎn)量高，便于對其進(jìn)行進(jìn)一步的藥理和臨床研究，為開發(fā)療效好且毒副作用小的新型抗白 血病藥物提供先導(dǎo)化合物。
[0019] 本發(fā)明所用的菌種ZJ-M-5由中國科學(xué)院微生物研究所鑒定為刺囊殼屬真菌 (Ascotricha sp.)，檢驗鑒定報告編號：（2011)微檢字第227號，并于2013年9月27日由 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)保藏，地址：北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No. 8278。
【附圖說明】：
[0020] 圖1 :式I化合物的高分辨ESI-MS譜；
[0021] 圖2 :式I化合物的1H NMR譜；
[0022] 圖3 :式I化合物的13C NMR譜；
[0023] 圖4 :式I化合物的HSQC譜；
[0024] 圖5 :式I化合物的HMBC譜；
[0025] 圖6 :式I化合物的低分辨ESI-MS -級譜；
[0026] 圖7 :式I化合物的低分辨負(fù)離子ESI-MS二級譜；
[0027] 圖8 :式I化合物的低分辨負(fù)離子ESI-MS二級譜中主要碎片離子結(jié)構(gòu)歸屬；
[0028] 圖9 :由式I化合物中2, 4-二羥基-6-(2_羥基丙基）_苯甲酸片段形成的 6-hydroxymellein 的 CD 圖譜。
【具體實施方式】：
[0029] 下面所列實施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。實施例1:式I化合物的制備：
[0030] 挑取刺囊殼屬真菌（Ascotricha sp. ZJ-M-5,保藏號為CGMCC No. 8278)的孢 子，直接接種到液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)28天，其中培養(yǎng)基由蒸餾水配制，含有蔗糖3%， NaN030. 3 %，CaCl20. 46 %，KC1 0? 05 %，F(xiàn)eS04 ? 7H20 0? 001 %，K2HP040. 1 %，培養(yǎng)溫度為 25°C。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過濾除去發(fā)酵液后，菌絲體采用丙酮超聲提取3次，將提取液合并回收溶 劑后經(jīng)3倍量200~300目硅膠柱色譜分離，以體積配比為5 :1-1 :1的石油醚-丙酮混合 溶劑梯度洗脫，其中體積配比為3 :1的石油醚-丙酮混合溶劑洗脫部分，經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，甲醇為洗脫劑純化后得到式I化合物，收率為12mg/L。
[0031] 實施例2 :式I化合物在體外對人急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞株和人白血病 K562細(xì)胞株的生長抑制實驗：
[0032] HL-60或K562細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%經(jīng)加熱滅活的胎牛血清、100IU/mL青霉素、 100 y g/mL鏈霉素及l(fā)mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37°C、5% 0)2的飽和濕 度培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞70% -80%融合使用。稱取臺盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水 稀釋到4%的儲存濃度，用濾紙過濾，4°C保存。使用時，將該儲存液用PBS稀釋至0. 4%工 作濃度。取HL-60或K562細(xì)胞以3X 104個/mL密度，每孔lmL接種于24孔板中后，隨即加 入不同濃度藥物或陽性對照藥（終濃度為〇. l、〇. 5、1、3、10、30、100 yM)，對照組加入等容 積DMS0。孵育72小時后制備單個細(xì)胞懸液，取50 y L細(xì)胞懸液加入50 y L的0. 4%臺盼藍(lán) 溶液，混勻，在3分鐘內(nèi)，于顯微鏡下觀察，用血球計數(shù)板分別計數(shù)各組活細(xì)胞和死細(xì)胞（死 細(xì)胞被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染）。利用下列公式求得細(xì)胞生長抑制率并計算GI 5。，結(jié)果如 表2所示。抑制率=[1 -(加藥孔細(xì)胞數(shù)/對照孔細(xì)胞數(shù)）]X 100%。
[0033] 表2式I化合物對HL-60和K562細(xì)胞的生長抑制作用[GI5Q±SE ( y M)，n = 6]
[0034]
[0035] 體外實驗結(jié)果表明式I化合物在體外對人急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞株和人白 血病K562細(xì)胞株表現(xiàn)出顯著的生長抑制作用，其作用均強(qiáng)于陽性對照藥順鉑，因此具有開 發(fā)成為抗白血病藥物的前景。
【主權(quán)項】
1. 具有如式I結(jié)構(gòu)的聚酬化合物：2. -種制備如權(quán)利要求1所述聚酬化合物的方法，其特征在于，挑取刺囊殼屬真菌 Usco皆icAs SP. ZJ-M-5)的抱子，直接接種到液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)7~56天，其中培養(yǎng) 基由蒸饋水配制，包含薦糖2~4%，NaN〇3 0. 2~0. 4%，CaClz 0. 12~0. 92%，K2HPO4 0. 05~ 0. 15%，KCl 0. 03 ~0. 07%，F(xiàn)eS〇4 ? 7&0 0. 0005 ~0. 0015%，培養(yǎng)溫度為 20 ~30。C，發(fā) 酵產(chǎn)物經(jīng)過濾除去發(fā)酵液后，菌絲體采用丙酬超聲提取1~3次，將提取物合并后經(jīng)1~20 倍量200~300目硅膠柱色譜分離，W體積配比為5 :1-1 :1的石油酸-丙酬混合溶劑梯度 洗脫，其中體積配比為3 :1的石油酸-丙酬混合溶劑洗脫部分得到式I化合物。3. -種藥物組合物，包括權(quán)利要求1所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。4. 權(quán)利要求1所述的化合物或權(quán)利要求3所述的組合物在制備抗白血病藥物中的應(yīng) 用。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的刺囊殼屬真菌保藏編號為 CGMCC No. 8278O
【文檔編號】C12R1/645GK106032368SQ201510122517
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月19日
【發(fā)明人】李占林, 華會明, 王文靜, 張金玲, 李丹毅
【申請人】沈陽藥科大學(xué)