對細胞的趨化作用。將上室搭在孔上，此時可見上室底面的膜剛好浸在 了下室中的培養(yǎng)基里。觀察下室的培養(yǎng)基與上室底面的膜之間沒有氣泡即可；（5)取50yL 細胞懸液加在各個孔的上室，再加入含有不同濃度藥物的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基50yL， 使各個孔上室藥物的濃度達到實驗設計濃度。觀察各孔中沒有氣泡；(6)將細胞放入37°C、 5C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，取出上室。用棉棒輕柔擦拭小室膜的上面，將沒有穿過 膜的細胞擦掉；（7)將小室用PBS輕柔沖洗，洗去表面的培養(yǎng)基；（8)將小室放入95%乙醇 中固定10分；(9)用PBS輕柔沖洗小室表面的固定液，再將小室放入蘇木素中染色5分鐘； (10)小室放入1 %鹽酸酒精中分化，自來水沖洗返藍5分鐘；（11)將小室放入伊紅中染色5 分鐘，然后自來水沖洗；（12)小室依次放入75%乙醇1分鐘、85%乙醇1中分鐘、95%乙醇 1中分鐘、100%乙醇4分鐘；（13)將小室風干，用刀片小心沿邊緣切下小室底面的膜。膜底 面朝上放在蓋玻片上，中性樹膠封片；（14)在正置顯微鏡下觀察，每張片在200X下取8個 隨機視野，數(shù)出每個視野中穿過的細胞數(shù)，進行統(tǒng)計分析，進行統(tǒng)計學分析。
[0044] 6、統(tǒng)計分析
[0045] '
[0046] 應用SPSS20. 0(IBMInc，USA)軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用x±s表示。多組間差異比 車父米用單因素方差分析，兩兩間比$父米用Dunnett-t檢驗，兩組間比$父差異米用student-t 檢驗。檢驗水準a= 0.05。
[0047] 三、結(jié)果及結(jié)論
[0048] 1、化合物（I)對腎癌細胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影響
[0049] 生長曲線顯示加入不同濃度的化合物（I)后，兩種腎癌細胞株的增殖都受到了 明顯的抑制。0.1mg/mL化合物（I)作用于786-0細胞24小時即出現(xiàn)顯著的抑制生長作 用（P〈0.035)。隨著培養(yǎng)時間的延長，O.lmg/mL化合物（I)及0.25mg/mL化合物（I) 對細胞增殖保持明顯的抑制作用，而〇.5mg/mL化合物（I)使786-0細胞的增殖停滯?；?合物（I)對0S-RC-2細胞的增殖同樣有抑制作用，在培養(yǎng)第3天0.lmg/mL、0. 25mg/mL、 0. 5mg/mL表現(xiàn)出對0S-RC-2細胞的顯著抑制（P分別為0. 026、0. 004、0. 002)。繪制的生長 曲線顯示化合物（I)對786-0細胞株的增殖抑制作用較對0S-RC-2細胞的增殖抑制作用 更為明顯。生長曲線周期中每天的細胞增殖情況見表1 (注：*在相應作用時間與對照組相 比有統(tǒng)計學差異（P〈〇. 05))。
[0050] WST-8細胞活力實驗結(jié)果顯示，化合物（I)對腎癌細胞株786-0細胞及0S-RC-2 細胞活力均有明顯的抑制作用，化合物（I)0.1mg/mL即在24小時對786-0及0S-RC-2細 胞的活力有顯著的抑制作用，且與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。藥物在24小時對兩種細 胞的半數(shù)抑制濃度（IC5。）分別為3. 5mg/mL和16. 45mg/mL，在48小時分別為為0. 165mg/mL 和1. 762mg/mL。對兩種細胞的活性抑制作用見表2(注：*在相應作用時間與對照組相比有 統(tǒng)計學差異（P〈〇.〇5))。
[0051] 2、化合物（I)抑制腎癌細胞株迀移和侵襲能力
[0052] 細胞劃痕迀移實驗結(jié)果顯示，化合物（I)對腎癌細胞株786-0和0S-RC-2的迀 移能力有抑制作用，化合物（I)〇.25mg/mL組在6h、12h、18h對786-0迀移的抑制率為 10. 95%、21. 96%和43. 02%，12h和18h的差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為0. 004和0. 000); 對0S-RC-2的抑制率為3. 81%、19. 67%、28. 44%，12h和18h的差異有統(tǒng)計學意義（P值 分別為0.009和0.000)?；衔铮?)0.511^/1^組在611、1211、1811對786-0的抑制率為 76. 82%、81. 18%、和82. 62%，差異均有統(tǒng)計學意義（P值分別為0. 001、0. 000和0. 000); 對0S-RC-2細胞的抑制率為22. 01 %、52. 95 %、和61. 50 %，12小時和18小時的差異均有統(tǒng) 計學意義（P值分別為0. 〇〇〇和0. 〇〇〇)。各組在對應時間的迀移率如表3。
[0053]Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過12小時后，786-0細胞株加藥組（0? 25mg/ mL化合物（I))和對照組每個200X視野穿過的細胞數(shù)分別為262. 38±22. 13和 74. 75±10. 50,差異有統(tǒng)計學意義（P= 0. 000) ;0S-RC-2細胞株則分別為102. 75±8. 75、 65. 13±9. 66,且差異有統(tǒng)計學意義（P= 0. 000)。
[0054] 結(jié)論，本研究結(jié)果表明一定濃度的化合物（I)對腎癌細胞的增殖、迀移、侵襲、死 亡都有顯著地影響，且在這些實驗中對786-0細胞系的作用明顯比對0S-RC-2細胞系更為 明顯。表明這種藥物也有可能通過這一機制對控制腎癌的進展和轉(zhuǎn)移發(fā)揮一定的作用。
[0055] 表1化合物（I)對腎癌細胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影響
[0056]
[0062] 實施例3
[0063] 片劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7 的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0064] 實施例4
[0065] 口服液的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成 口服液。
[0066]實施例5
[0067]膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0068]實施例6
[0069]注射液的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[0070]實施例7
[0071]無菌粉針的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用 水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔 封得粉針劑。
【主權項】
1?具有下述結(jié)構式的化合物（I):2. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a) 將川芎的干燥根莖粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用 石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁 醇萃取物；(b)步驟（a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再 用70 %乙醇洗脫8個柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物；（c)步 驟（b)中70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1和5:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依 次用體積比為8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟（d)中 組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水溶液等度洗 脫，收集8~12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。3. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：步驟（a)中，用75% 乙醇熱回流提取，合并提取液。4. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為D101 型大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權利要求1所述的化合物 (I)和藥學上可接受的載體。6. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療腎癌的藥物中的應用。7. 權利要求5所述的藥物組合物在制備治療腎癌的藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的三萜化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途，屬于藥物技術領域。該化合物為首次報道，是一種結(jié)構新穎的三萜類化合物，可以從川芎的干燥根莖中提取、分離純化得到。體外試驗證明該化合物對腎癌細胞的增殖、遷移、侵襲、死亡都有顯著地影響，可以用來開發(fā)成治療腎癌的藥物。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/585, C07J71/00
【公開號】CN105111275
【申請?zhí)枴緾N201510590360
【發(fā)明人】張利文
【申請人】張利文
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年9月16日