明該化合物為三萜類化合物。13CNMR和DEPT譜顯示 30個碳信號，包括七個甲基，五個次甲基，九個亞甲基以及九個季碳。側(cè)鏈具有24(25)-雙 鍵（SC130. 2,123. 7和SH4. 96,tt，J= 7. 1，1. 4Hz)，說明該化合物為羊毛甾醇型三萜， HMBC譜中Me-26 和Me-27 與C-24 和C-25,Me-21 與C-17,C-20 和C-22，以及H-24 與 C-22,C-23,Me-26,Me-27的相關(guān)性驗證了上述推論。IR光譜顯示出酮基（1707cm1)和 T內(nèi)酯（1768cm3吸收帶。HMBC譜中，H2-2,H-5,Me-28和Me-29與C-3的交叉峰證明 了C-3(SC213.6)為酮羰基。此外，一個酯羰基信號[SC175.8(C-30)]和兩個碳信號 [SC84. 5(C-9)和58. 3(C-14)]說明該化合物存在一個y內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。HMBC譜中Me-18與 〇14出2-15與(：-30;11 2-11與(：-9;11-11€[與(：-8以及116-19與(：-9的相關(guān)性驗證了30,9-這 個官能團的連接。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)， 可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本 一致（圖2)。
[0026] 實施例2 :化合物（I)藥理作用試驗
[0027] -、材料和儀器
[0028] 786-0腎癌細胞株、0S-RC-2腎癌細胞株均購自中科院細胞庫?；衔铮↖)自 制，HPLC歸一化純度大于98%。RPMI-1640培養(yǎng)基、100U/mL青霉素及100yg/mL鏈霉素、 1XPBS緩沖液、胰酶-EDTA購于美國HyClone。胎牛血清購于美國Gibco。細胞增殖與毒性 檢測試劑盒（中國）?；|(zhì)膠購于美國BDBioscience。
[0029]HERAcell240i恒溫孵箱、GmbHD-37520低溫離心機、1510酶標儀為芬蘭Thermo公 司產(chǎn)品。頂T-2倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。DFC480正置顯微鏡為德國徠卡 公司產(chǎn)品。MDF-U53V-80°C超低溫冰箱為日本SANYO公司產(chǎn)品。YDS-50B-80液氮儲存罐購 自中國成都液氮容器廠。BC-185GE4°C冰箱為中國益友公司產(chǎn)品。Minispinplus小離心機 為Eppendorf公司產(chǎn)品。powerpac300電泳儀為美國Biorad公司產(chǎn)品。Las4000mini凝膠 成像儀為日本FUJIFILM公司。
[0030] 二、試驗方法
[0031] 1、細胞培養(yǎng)
[0032] (1)常規(guī)培養(yǎng)及細胞傳代：786-0及0S-RC-2腎癌細胞株均培養(yǎng)在改良型 RPMI-1640培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)時加入了 10%胎牛血清及1%青霉素和鏈霉素，構(gòu)成完全培 養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37°C、5%C02的恒溫培養(yǎng)箱。正常情況下786-0及0S-RC-2細胞均為貼 壁生長。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，一般隔天換液一次。換液時先吸去 培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，加PBS洗漆2次后再加入完全培養(yǎng)基。細胞密度達到80-90 %且 細胞形態(tài)仍保持良好時進行傳代，傳代周期一般為3天。細胞傳代步驟如下：1)先棄去培養(yǎng) 瓶內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗2次；2)培養(yǎng)瓶內(nèi)加lmL胰蛋白酶-EDTA，37°C孵育約3分鐘，倒置顯微 鏡下觀察細胞變圓并脫落后，加入3mL完全培養(yǎng)基終止消化，并用吸管將成團的細胞吹散； 3)細胞懸液移至15mL離心管中，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基吹散 細胞沉淀，分裝到3個培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0033] (2)細胞凍存：細胞處于對數(shù)生長期，狀態(tài)良好并且細胞密度達到80-90 %凍存細 胞，步驟如下：1)配制細胞凍存液：將改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMS0按7:2:1 比例混合、震蕩混勻；2)消化、離心細胞（具體見細胞傳代步驟）；3)離心后吸去上清液，加 入凍存液并吹勻，調(diào)整細胞計數(shù)約1X107mL，移至1. 2mL凍存管中。在凍存管標記凍存日期 及細胞株信息，用封口膜封口。置于4°C冰箱30分鐘，移至-20 °C冰箱2小時，再移至-80°C 冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中保存。
[0034] (3)細胞復(fù)蘇：1)水浴鍋預(yù)熱到37°C準備；2)從_80°C冰箱或液氮中取出細胞，迅 速放入37°C的水浴鍋中并搖動，使其內(nèi)液體在1-2分鐘內(nèi)融化；3)將融化后的細胞懸液移 置15mL離心管中，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心后棄去上清并加入完全培養(yǎng)基。4)將細 胞置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細胞狀態(tài)并換液。
[0035] (4)細胞計數(shù)：1)細胞消化，吹散制備細胞懸液，方法同細胞傳代。用加樣器吸取 20yL懸液沿蓋玻片邊緣燒靠外側(cè)滴加，使懸液由于氣壓影響均勻吸入計數(shù)察，健康活細胞 呈規(guī)則圓形、透明狀。計算計數(shù)板4個角的4大格內(nèi)細胞數(shù)（格子邊線上的細胞只記上邊、 不計下邊；只記左邊、不記右邊）。細胞密度=4大格細胞總數(shù)X0. 25X107mL。
[0036] 2、細胞增殖曲線繪制
[0037] (1)當786-0及0S-RC-2細胞處于對數(shù)生長期，密度80-90 %時，制備細胞懸液并 細胞計數(shù)，方法同上。調(diào)節(jié)細胞懸液濃度為1X105/mL; (2)接種細胞懸液lmL接種于于24 孔板上，然后再根據(jù)不同條件加藥，保證每孔細胞數(shù)基本一致。同一種細胞同一種加藥條件 設(shè)計計數(shù)6天，每天計數(shù)3個孔，即每種條件需設(shè)置18個孔；（3)將培養(yǎng)板置于37°C、5 %C02 中培養(yǎng)；(4)從接種次日開始計數(shù)，記為第1天（第0天細胞數(shù)記為接種細胞數(shù)，即1X105)。 每孔加200 yL胰酶-EDTA，消化、吹散、計數(shù)即可。每隔24小時取3個孔進行細胞計數(shù)；（5) 根據(jù)計數(shù)所得數(shù)據(jù)繪制細胞生長曲線。
[0038] 3、WST-8細胞活力實驗
[0039] (1)收集對數(shù)生長期的786-0及0S-RC-2細胞，制備細胞懸液、細胞計數(shù)，方法同 上。調(diào)節(jié)細胞懸液濃度為4X104mL; (2)每孔中加入50yL細胞懸液（即2000個細胞/ 孔），然后各逾加入含有設(shè)計值2倍濃度藥物的完全培養(yǎng)基50yL混勾，這樣使藥物終濃度 恰好為設(shè)計值，且保證了各孔細胞數(shù)的一致性。每個條件設(shè)置5個復(fù)孔；（3)將細胞置于 5%C02、37°C條件下的細胞培養(yǎng)箱中孵育；(4)分別在24小時和48小時后終止培養(yǎng)，吸取 孔內(nèi)培養(yǎng)基，更換新鮮完全培養(yǎng)基，每孔加入10yLWST-8溶液，用加了新鮮完全培養(yǎng)基和 WST-1溶液但沒有接種細胞的孔作為空白對照；（5)避光條件下置于搖床5分鐘搖勾，后繼 續(xù)放入37°C、5%C02條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時；(6)酶標儀下測定450nm吸光度值；(7) 細胞活性抑制率=(對照組吸光度值-實驗組吸光度值）八對照組吸光度值/空白組吸光 度值）X100%。
[0040] 4、劃痕細胞迀移實驗
[0041] (1)準備無菌6孔細胞培養(yǎng)板，marker筆在6孔板背面每隔1cm劃一道標線；（2) 取對數(shù)生長期細胞，PBS液洗漆2次，0. 25%胰蛋白酶消化、吹散，將細胞懸液離心，更換完 全培養(yǎng)基重懸。接種于標記好的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加5X105細胞；（3)37°(：、50)2培 養(yǎng)，待倒置相差顯微鏡下觀察各孔細胞密度約達到90 %時吸取完全培養(yǎng)基，換用無血清培 養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，以消除由于血清引起的增殖對迀移作用的干擾；(6)無血清培養(yǎng)到指定 時間后用高壓消毒的200yL槍頭垂直6孔板上的標記線劃痕。劃痕與孔板上mark筆上的 橫線交叉點即為觀察的固定點。（7)PBS清洗2次洗去劃下的細胞。更換新鮮的無血清培 養(yǎng)基，按照實驗條件在各組培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的藥物，同時設(shè)立對照組，置37°C、5C02 孵箱中培養(yǎng)；(6)每個孔取8個固定點觀察劃痕后12h、18h的細胞迀移情況并照相，使用 ImageJ圖像分析軟件測定每張圖片劃痕區(qū)的面積；(8)迀移率=(觀察時間固定點劃痕面 積-起始時間固定點劃痕面積）/起始時間固定點劃痕面積X100%。迀移抑制率=(實驗 組迀移率-對照組迀移率）/實驗組迀移率X100 %。
[0042] 5、Transwell細胞侵襲實驗
[0043] (1)取培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中的對數(shù)生長期786-0和0S-RC-2腎癌細胞株，PBS洗 漆2次，換用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時，以減少細胞增殖對侵襲實驗的影 響；（2)準備Transwell小室。小室可搭置于24孔細胞培養(yǎng)板上，底面為直徑6. 5mm、孔 徑5ym的膜。取40yL以1:5稀釋的lmg/mL基質(zhì)膠鋪在上室，并放入4°C過夜風干，該 操作需在冰上完成，因基質(zhì)膠在室溫下易迅速凝固；（3)786-0和0S-RC-2腎癌細胞株經(jīng) 無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)到12小時后，胰酶-EDTA消化、離心后吸去上清，加入無血 清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度至lX106/mL;(4)將準備好的帶有 Transwell小室的24孔板取出，下室（即24孔板的孔）中加入500yL含有10%胎牛血清的 完全培養(yǎng)基，以提供