昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用，所述昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體包括含人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)序列的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I以及含人抗體重鏈IgG1保守區(qū)的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II，所述表達(dá)載體I的序列如序列表SEQ ID 1所示，所述表達(dá)載體II的序列如序列表SEQ ID 2所示；還包括含α?2，3?唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體III，所述表達(dá)載體III的序列如序列表SEQ ID 3所示。所述昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體可高效表達(dá)含重鏈和輕鏈的人源化抗體。
【專利說(shuō)明】
昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]抗體分子具備四聚體糖蛋白的復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)，其胞外表達(dá)遵循著〃分泌蛋白〃的一般規(guī)律:全抗體分子的輕、重鏈各自翻譯后，經(jīng)折疊、組裝，糖基化修飾后才具生物活性。通過對(duì)已上市抗體的臨床研究發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞對(duì)重組抗體的〃翻譯后修飾〃，直接影響到抗體藥物的臨床療效和免疫原性，所有IgG分子僅在每個(gè)Cy 2區(qū)域Asn-297存在一個(gè)保守的N-糖基化修飾位點(diǎn)。連接在該位點(diǎn)的糖鏈有助于維持IgG的四級(jí)結(jié)構(gòu)和Fe穩(wěn)定性，并為IgG與外源凝集素的結(jié)合提供糖基化修飾位點(diǎn)。正常人IgG的Fe寡糖主要是核心巖藻糖基化的復(fù)雜雙天線型，多因末端糖的半乳糖基化和唾液酸化產(chǎn)生異質(zhì)性。根據(jù)末端半乳糖數(shù)量，可將Asn-297連接的雙天線32聚糖糖鏈分成三個(gè)不同亞型IgG-GO，-Gl，-G2，分別占整個(gè)人血清IgG糖鏈的35 %、35 %和16 % ;其他的14 %為唾液酸化的GI和G2型的糖鏈。此外，人類I gG中還存在少量有(或無(wú))二等分乙酰葡糖胺的無(wú)巖藻糖Fe糖鏈。
[0003]昆蟲產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白的N-糖鏈?zhǔn)抢ハx糖生物學(xué)和利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)比較矛盾的一個(gè)問題。很多證據(jù)表明，在昆蟲細(xì)胞株中沒有唾液酸和唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶的活性，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組糖蛋白的糖鏈末端沒有唾液酸化。所有在標(biāo)準(zhǔn)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，其中以sf21、sf9和BT1-Tn-5Bl-4(High Five)細(xì)胞作為宿主，重組N-糖蛋白的糖鏈?zhǔn)呛?jiǎn)單的、沒有唾液酸化的低甘露糖型，而不是哺乳動(dòng)物在相同糖基化位置產(chǎn)生的唾液酸化的復(fù)合型糖鏈。
[0004]細(xì)胞系3€3胃1'-1(含有6111'1，61^2，6&11'，3了3，3了6等5個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞糖基轉(zhuǎn)移酶基因)具有能夠很好地使重組糖蛋白的糖鏈唾液酸化的能力。我們知道Sf9細(xì)胞系不具有CMP-sialic acid，而這種物質(zhì)是sialyl transferase酶活性的底物。隨后發(fā)現(xiàn)Sf SWT-1中表達(dá)的重組糖蛋白的糖鏈唾液酸化，需要將該細(xì)胞放在含有外加唾液酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，就像要添加FBS—樣，表明這些昆蟲細(xì)胞具有補(bǔ)償型營(yíng)養(yǎng)途徑。不過這個(gè)問題很快得到了解決，那就是將編碼唾液酸合酶和CMP-唾液酸合成酶的哺乳動(dòng)物基因插入Sf SWT-1細(xì)胞內(nèi)，得到的SfSWT-3細(xì)胞株，就能夠在細(xì)胞內(nèi)合成CMP-唾液酸，形成的糖鏈為雙天線、末端單唾液酸化的復(fù)合型N-糖鏈，但該細(xì)胞要在含有N-乙酰甘露糖胺唾液酸前體物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。這里要特別強(qiáng)調(diào)的是，到目前為止所有由轉(zhuǎn)基因昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的糖鏈都在末端的α_1，6支鏈上沒有唾液酸。這是因?yàn)楸M管在SfSWT-1和SfSWT-3細(xì)胞株中引入老鼠ST3GalIV基因，但檢測(cè)不到唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性，說(shuō)明雖然從mRNA水平上能夠檢測(cè)到該基因的表達(dá)，但它不能編碼一個(gè)具有活性的基因產(chǎn)物，這可能解釋了目前為什么由這些細(xì)胞株表達(dá)的重組糖蛋白的糖鏈的末端沒有兩個(gè)唾液酸的原因。因此目前的工作重點(diǎn)是向SfSWT-1和SfSWT-3細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入能表達(dá)具有活性的ST3酶基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用，所述昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體可高效表達(dá)含重鏈和輕鏈的人源化抗體。
[0006]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，包括含人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)序列的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I以及含人抗體重鏈IgGl保守區(qū)的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II，所述表達(dá)載體I的序列如序列表SEQ ID I所示，所述表達(dá)載體II的序列如序列表SEQ ID 2所示；
[0008]還包括含α-2，3_唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體III，所述表達(dá)載體III的序列如序列表SEQ ID 3所示。
[0009]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述表達(dá)載體Ι、ΙΙ、ΙΙΙ為pFAST Bacl載體。
[0010]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述表達(dá)載體III的啟動(dòng)子為桿狀病毒極早期弱啟動(dòng)子iel。[0011 ]昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0012]所述載體I的構(gòu)建方法為:設(shè)計(jì)引物從pFUSE2ss-CLIg-hk載體上克隆人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)片段，并連接到pFAST Bacl載體上；
[0013]所述載體II的構(gòu)建方法為:設(shè)計(jì)引物從pFUSEss-CHIg-hGl載體上克隆人抗體重鏈IgGl保守區(qū)片段，并連接到pFAST Bacl載體上；
[0014]所述載體III的構(gòu)建方法為:將pFASTBacI載體的PH啟動(dòng)子置換成病毒極早期弱啟動(dòng)子iel，以及克隆人α-2，3-唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3基因到含啟動(dòng)子iel的所述pFASTBac I載體上。
[0015]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體I的構(gòu)建方法中，所述人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)片段和pFAST BacI載體各自經(jīng)雙酶切后，以3:1的摩爾比例混合后通過連接酶連接。
[0016]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體I的構(gòu)建方法中，克隆的方法包括:以pFUSE2ss-CLIg-hk載體為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增pFUSE2ss-CLIg-hk載體的IgKappa輕鏈保守區(qū)。
[0017]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體I的構(gòu)建方法中，所述引物為上游引物L(fēng)I和下游引物L(fēng)2，所述上游引物L(fēng)I的序列如SEQ ID 4所示，所述下游引物L(fēng)2的序列如SEQ ID 5所示。
[0018]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體II的構(gòu)建方法中，所述人抗體重鏈IgGl保守區(qū)片段和pFAST BacI載體各自經(jīng)雙酶切后，以3:1的摩爾比例混合后通過連接酶連接。
[0019]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體11的構(gòu)建方法中，克隆的方法包括:以pFUSEsS-CHIg-hG I載體為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增pFUSEs s-CHI g-hG I載體的I gG I重鏈保守區(qū)。
[0020]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體II的構(gòu)建方法中，所述引物為上游引物Hl和下游引物H2，所述上游引物Hl的序列如SEQ ID 6所示，所述下游引物H2的序列如SEQ ID 7所示。
[0021]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體I和載體II的構(gòu)建方法中采用的擴(kuò)增反應(yīng)體系為:94°(:預(yù)變性5111丨11，941€458，58°(:1111丨11，721€458，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72°(:延伸1011^11。
[0022]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體III的構(gòu)建方法中，所述置換包括如下=WpFASTBacl載體質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增pFAST Bacl載體不含pPH啟動(dòng)子的部分;合成桿狀病毒極早期弱啟動(dòng)子iel，將所述啟動(dòng)子iel與擴(kuò)增后的所述pFAST Bacl載體連接，得到含桿狀病毒極早期弱啟動(dòng)子iel的病毒表達(dá)載體。
[0023]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體III的構(gòu)建方法中，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系包括如下:采用？作酶，擴(kuò)增條件為:941€2111丨11，94°(:158，601€308，721€908，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，721€7111丨11，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為4647bp。
[0024]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述人α-2，3_唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3基因片段和含啟動(dòng)子iel的pFAST BacI載體各自經(jīng)雙酶切后，以2:1的摩爾比例混合后通過連接酶連接。
[0025]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述人α-2，3_唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3基因序列如SEQ ID 8所不O
[0026]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述載體1、載體II和載體III的構(gòu)建方法中，所述雙酶切為BamHI 和 HindII I 雙酶切。
[0027]所述昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體在制備全長(zhǎng)抗體中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括如下方法:
[0028]分別克隆分泌鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列；
[0029]將所述輕鏈可變區(qū)核酸序列連接到含人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)序列的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I，將所述重鏈可變區(qū)核酸序列連接到含人抗體重鏈IgGl保守區(qū)的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II;
[0030]分別采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I和昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II轉(zhuǎn)染構(gòu)建重組桿狀病毒粒子，得到兩種病毒；
[0031]所述兩種病毒混合感染昆蟲細(xì)胞，得到重組人鼠嵌合抗體。
[0032]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID 9所示，所述重鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID 10所不。
[0033]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，克隆時(shí)，采用引物L(fēng)3和L4擴(kuò)增鼠單抗輕鏈可變區(qū)基因序列，采用引物Η3和Η4擴(kuò)增鼠單抗重鏈可變區(qū)基因序列，所述引物序列L3、L4、H3、H4分別如SEQ ID
11、12、13、14 所示。
[0034]所述昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體在表達(dá)人源糖蛋白中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括如下方法:將特征蛋白基因構(gòu)建到表達(dá)載體III上，利用表達(dá)載體1、II及III分別轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，得到三種病毒，所述三種病毒混合共同感染昆蟲細(xì)胞SfSWT-3細(xì)胞。
[0035]作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述感染方法為把病毒液加到培養(yǎng)好的SfSWT-3細(xì)胞里。
[0036]本發(fā)明的有益效果是:
[0037](I)經(jīng)抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體可以高效表達(dá)含重鏈和輕鏈的人源化抗體。
[0038](2)本發(fā)明得到的重組抗體的糖基化修飾方式和人體內(nèi)的糖基化修飾方式一致。
[0039 ] (3)本發(fā)明的抗體制備方法表達(dá)量大，成本低，效率高。
[0040](4)本發(fā)明制備的抗體干粉可作為血清學(xué)檢查的診斷原料。
[0041 ] (5)本發(fā)明能在Sf SWT-3細(xì)胞系中表達(dá)具有活性的ST3酶基因。
【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為本發(fā)明實(shí)施例制備的重組全長(zhǎng)抗體的Western Blot圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]本申請(qǐng)通過提供昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用，得到的所述表達(dá)載體可高效表達(dá)含重鏈和輕鏈的人源化抗體。
[0044]本申請(qǐng)實(shí)施例昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，包括含人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)序列的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I以及含人抗體重鏈IgGl保守區(qū)的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II，所述表達(dá)載體I的序列如序列表SEQ ID I所示，所述表達(dá)載體II的序列如序列表SEQ ID 2所示；
[0045]還包括含α-2，3_唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體III，所述表達(dá)載體III的序列如序列表SEQ ID 3所示；
[0046]所述表達(dá)載體Ι、ΙΙ、ΙΙΙ為pFAST Bacl載體。
[0047]所述載體I的表達(dá)元件包括:PH啟動(dòng)子，SV40pA，Tn7L，flori，ampici 11 in，pUC01"；[，1'1171?，661^3111；[(3；[11，1^口口3保守區(qū)，多克隆位點(diǎn)等。
[0048]所述載體II的表達(dá)元件包括:PH啟動(dòng)子，SV40pA，Tn7L，f1ri，ampicillin，pUCori，Tn7R,Gentamicin，IgGl重鏈保守區(qū)，多克隆位點(diǎn)等。
[0049]所述表達(dá)載體III的啟動(dòng)子為桿狀病毒極早期弱啟動(dòng)子iel。
[0050]本申請(qǐng)實(shí)施例昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0051 ]所述載體I的構(gòu)建方法為:設(shè)計(jì)引物從pFUSE2ss-CLIg-hk載體上克隆人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)片段，并連接到pFAST Bacl載體上；
[0052]所述載體II的構(gòu)建方法為:設(shè)計(jì)引物從pFUSEss-CHIg-hGl載體上克隆人抗體重鏈IgGl保守區(qū)片段，并連接到pFAST Bacl載體上；
[0053]所述載體III的構(gòu)建方法為:將pFASTBacI載體的PH啟動(dòng)子置換成病毒極早期弱啟動(dòng)子iel，以及克隆人α-2，3-唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3基因到含啟動(dòng)子iel的所述pFASTBacl載體上。所述人α-2，3-唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3基因序列如SEQ ID 8所示。
[0054]本申請(qǐng)實(shí)施例昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體在制備全長(zhǎng)抗體中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括采用如下方法制備抗體:
[0055]分別克隆分泌鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列；
[0056]將所述輕鏈可變區(qū)核酸序列連接到含人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)序列的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I，將所述重鏈可變區(qū)核酸序列連接到含人抗體重鏈IgGl保守區(qū)的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II;
[0057]分別采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I和昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II轉(zhuǎn)染構(gòu)建重組桿狀病毒粒子，得到兩種病毒；
[0058]所述兩種病毒混合感染昆蟲細(xì)胞，得到重組人鼠嵌合抗體。
[0059]所述輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID 9所示，所述重鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID1所示。
[0060]本申請(qǐng)實(shí)施例昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體在表達(dá)人源糖蛋白中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括采用如下方法表達(dá)糖蛋白:將特征蛋白基因構(gòu)建到表達(dá)載體III上，利用表達(dá)載體Ι、Π及III分別轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，得到三種病毒，所述三種病毒混合共同感染昆蟲細(xì)胞Sf SWT-3細(xì)胞。
[0061]為了更好的理解上述技術(shù)方案，下面將結(jié)合說(shuō)明書附圖以及具體的實(shí)施方式對(duì)上述技術(shù)方案做詳細(xì)的說(shuō)明。
[0062]實(shí)施例1
[0063]以下以小鼠HER2單克隆抗體為例進(jìn)行人源化抗體的表達(dá)。
[0064]重組抗體輕鏈可變區(qū)融合表達(dá)載體I的構(gòu)建
[0065]以pFUSE2ss-CLIg-hk載體為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增該載體的IgKappa Light保守區(qū)，具體步驟如下:以上游引物L(fēng)I:CGGGCGCGGATCCGAATTCACCGGTCACCATGG和下游引物L(fēng)2:TTCTCGACAAGCTTCTCCCTCTAACACTCTCC，以pFUSE2ss-CLIg-hk載體質(zhì)粒為模板，94°C預(yù)變性511^11，941€458，58°(:1111丨11，721€458，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72°(:延伸10111丨11。？0?產(chǎn)物電泳回收，BamH I和Hind III雙酶切得到含多克隆位點(diǎn)的人源化抗體輕鏈Kappa保守區(qū)片段。培養(yǎng)含pFAST Bacl載體在大腸桿菌，提取質(zhì)粒，同樣BamH I和Hind III雙酶切，回收酶切片段，以輕鏈Kappa保守區(qū)片段:pFAST Bacl載體比例3:1，混合，加T4DNA連接酶鏈接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac，挑取抗氨芐青霉素的菌株，為構(gòu)建成功的載體。
[0066]融合蛋白構(gòu)建和表達(dá)(制備抗體時(shí)):1.雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞培養(yǎng)以及cDNA的合成，采用常規(guī)方法從分泌抗HER2單抗的雜交瘤細(xì)胞株中提取mRNA，并以其為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化(RT-PCR)，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用可變區(qū)兩頭的通用混合引物擴(kuò)增，然后連接到克隆載體PMD18-T，隨機(jī)挑選一些克隆測(cè)序驗(yàn)證正確的抗體基因，得到鼠單抗輕鏈可變區(qū)基因序列，以弓I 物 L3:AGTCC GAATTCGACATCCAGATGACCCAGTC和L4:TGACTGCCATGGACGCTTGATCTCCACCTTGG擴(kuò)增該基因可變區(qū)序列，EcoRI和NcoI雙酶切插入上述構(gòu)建好的表達(dá)載體。
[0067]重組抗體重鏈可變區(qū)融合表達(dá)載體II的構(gòu)建
[0068]以pFUSEss-CHIg-hGl載體為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增該載體的IgGl重鏈保守區(qū)。具體步驟如下:以上游引物Hl: GCGCGGATCCGAATTCGATATCTCGAGTGCTAG和下游引物H2:CTCGACAAGCTTCCAGCTAGGACTCATTTAC，以pFUSE2ss-CLIg-hk載體質(zhì)粒為模板，94°C預(yù)變性5!!^11，941€458，58°(:11^11，721€458，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72°(:延伸101^11。？0?產(chǎn)物電泳回收，雙酶切得到含多克隆位點(diǎn)的人源化抗體IgGl重鏈保守區(qū)片段。培養(yǎng)含pFAST Bacl載體在大腸桿菌，提取質(zhì)粒，同樣BamHI和HindIII雙酶切，回收酶切片段，以IgGl重鏈保守區(qū):pFASTBacI載體比例3:1，混合，加T4DNA連接酶鏈接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac，挑取抗氨芐青霉素的菌株，為構(gòu)建成功的載體。
[0069]融合蛋白構(gòu)建和表達(dá)(制備抗體時(shí)):1.雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞培養(yǎng)以及cDNA的合成，采用常規(guī)方法從分泌抗HER2單抗的雜交瘤細(xì)胞株中提取mRNA，并以其為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化(RT-PCR)，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用可變區(qū)兩頭的通用混合引物擴(kuò)增，然后連接到克隆載體PMD18-T，隨機(jī)挑選一些克隆測(cè)序驗(yàn)證正確的抗體基因，得到鼠單抗重鏈可變區(qū)基因序列，以弓I 物 H3:AGTCC GAATTCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC和H4:GCTAAGATATCCACGGTCACCAGGTACC擴(kuò)增改抗體基因重鏈可變區(qū)序列，EcoRI和EcoRV雙酶切插入上述構(gòu)建好的表達(dá)載體。
[0070]含桿狀病毒極早期啟動(dòng)子iel和人α-2，3_唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3的載體III的構(gòu)建
[0071]換啟動(dòng)子:以pFASTBacl載體質(zhì)粒為模板，以引物擴(kuò)增該載體不含pPH啟動(dòng)子的部分，用口如酶，擴(kuò)增條件為:941€2111丨11，94°(:158，601€308，721€908，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，721€71^11，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為4647bp。同時(shí)合成桿狀病毒極早期啟動(dòng)子iel，和載體平端連接，挑克隆，PCR和測(cè)序驗(yàn)證，得到含桿狀病毒極早期弱啟動(dòng)子iel的病毒表達(dá)載體。
[0072]表達(dá)載體III的構(gòu)建:將人α-2，3_唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3基因克隆到該載體上，人α-2，3-唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3蛋白質(zhì)序列，根據(jù)密碼子偏好轉(zhuǎn)化為適合在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的基因序列，合成該序列，合成的時(shí)候兩端分別帶上酶切位點(diǎn)BamH I和Hind III，合成的ST3基因片段和含ieI啟動(dòng)子的載體分別以BamH I和Hind III雙酶切，以2:1的比例混合，加T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac，挑克隆，PCR驗(yàn)證，得到表達(dá)ST3基因的表達(dá)載體。提取質(zhì)粒備用。
[0073 ]上述三種病毒載體1、I1、III的分別轉(zhuǎn)染(表達(dá)人源糖蛋白時(shí))
[0074]取sf9細(xì)胞，用Grace’s培養(yǎng)液于27°C無(wú)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用Cellfectin在6孔培養(yǎng)板中將三種重組桿狀病毒DNA即重鏈表達(dá)載體，輕鏈表達(dá)載體，ST3表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即融合率80%以上的sf9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法如下:分別配置A液(LR反應(yīng)物8μI，無(wú)血清無(wú)抗生素Grace’s培養(yǎng)基ΙΟΟμΙ)和B液(6μ1 Cellfectin，Grace’ s無(wú)血清無(wú)抗生素Grace ’ s培養(yǎng)基ΙΟΟμΙ)，并輕柔混勾兩液，室溫放置35min后，加入800μ1無(wú)血清無(wú)抗生素Grace，s培養(yǎng)基輕柔混勾；移棄六孔板中培養(yǎng)基，用無(wú)血清無(wú)抗生素Grace，s培養(yǎng)基潤(rùn)洗，以去除殘留血清，加入AB混合物，27°C孵育5小時(shí)，移棄培養(yǎng)上清，于各孔中加入2ml含有50單位/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素的Grace，s完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h后4500rpm離心lOmin，收集培養(yǎng)上清，即獲得重組抗體的桿狀病毒，這是Pl毒株，分裝后，-80°C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0075]病毒的擴(kuò)增:感染當(dāng)天，準(zhǔn)備Sf9和Sf21細(xì)胞上清和細(xì)胞板，2X106細(xì)胞/孔。接觸培養(yǎng)細(xì)胞室溫I小時(shí)，I小時(shí)后倒差顯微鏡檢查細(xì)胞的吸附情況，每孔加入合適數(shù)量的Pl毒株，27度潮濕培養(yǎng)箱撫育細(xì)胞96小時(shí)，感染后72小時(shí)，從每個(gè)孔收集2ml含有病毒的上清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)到15ml的管子。500Xg離心5分鐘棄去細(xì)胞和碎片。將上清轉(zhuǎn)到15ml管子。這是P2毒株，4度避光保存。長(zhǎng)期保存需要整株在-80度。檢測(cè)你的P2毒株的滴度，同樣方法制備P3病毒株。分別收集重鏈載體，輕鏈載體，和ST3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后的P3病毒，再混合感染由SfO細(xì)胞株改良后的Sf SWT-3細(xì)胞，感染方法為把毒液加到培養(yǎng)好的細(xì)胞里面。
[0076]檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
[0077]抗體的檢測(cè)和糖基化方式檢測(cè)檢測(cè)人源化抗體
[0078]a，分別取I X 16重組桿狀病毒感染96h后的SfSWT-3細(xì)胞，未感染SfSWT-3細(xì)胞為陰性對(duì)照和感染PFastBac1-Gus桿狀病毒的SfSWT-3細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞分別裂解后用等量的2 X凝膠加樣緩沖液混勻，各取20μ1上樣電泳，并分別電泳3組細(xì)胞裂解液，利用B1-Rad蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)印3張PVDF膜，以便各種抗體和蛋白檢測(cè)重組人源化抗體蛋白的存在。5 %脫脂奶粉室溫封閉Ih，用1:5000的抗-人Kappa鏈-HRP單克隆抗體，I: 200兔抗Kappa鏈多克隆抗體，以及1:2000鼠抗人Kappa鏈單克隆抗體分別孵育3張PVDF膜，4 V過夜。PBST洗膜后分別用相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育PVDF膜，PBST洗膜，DAB顯色，結(jié)果見附圖1。圖1中，從左至右，泳道I為全長(zhǎng)抗體的加熱還原后的電泳，泳道2，3為非加熱非還原的電泳，通過分子量對(duì)照，可以看出本申請(qǐng)實(shí)施例1制備的全長(zhǎng)抗體結(jié)構(gòu)是完整的，重鏈和輕鏈成功組裝。
[0079]b.通過ELISA檢測(cè)昆蟲細(xì)胞株。以抗人KAPPA鏈抗體用包被酶標(biāo)板，4°C包被過夜，5%牛奶封閉液封閉2h;，分別加入正常轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞上清(-)和人IgG標(biāo)準(zhǔn)品(100ng/ml—+ )和昆蟲細(xì)胞表達(dá)上清，各ΙΟΟμΙ，37°C孵育30min，用ELISA洗滌液洗5次，3min/次;將HRP標(biāo)記的重組HER2蛋白用ELISA稀釋液稀釋后，分別加入孔中，37°C孵育30min，用ELISA洗滌液洗5次，3min/次;加入顯色液10ul/孔，37°C避光顯色1()111；[11，最后加入5(^1/孔21]101凡硫酸終止，用酶標(biāo)儀上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果確定抗生素雙篩選的昆蟲細(xì)胞株的抗體表達(dá)能力。結(jié)果顯示抗體有明顯結(jié)合。
[0080]c.ProteinA親和純化抗HER2蛋白的人源化抗體。從昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞破碎液中可以分離純化人源化的人鼠雜交抗體。主要步驟如下收集培養(yǎng)上清，4°C離心，12000rpmX1min，棄沉淀。用0.45μηι濾膜過濾進(jìn)一步除去細(xì)胞雜質(zhì)，以避免堵塞層析柱；用10倍體積的binding buffer
[0081 ] (20mM PBS，pH7.0)平衡Hitrap Protein A預(yù)裝柱:上樣，完畢后用10倍體積的binding buffer洗去未結(jié)合的蛋白，至Bradford檢測(cè)溶液不顯色；用5倍體積的elut1nbuffer (0.1M檸檬酸溶液，pH3.6)洗脫，用Bradford檢測(cè)溶液檢測(cè)洗脫過程，收集洗脫峰，并用IM Tris-HCI (pH9.0)調(diào)整PH值至7.0 ；從收集產(chǎn)物中取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，其余純化產(chǎn)物經(jīng)PBS液4 0C透析過夜后，分裝，_80°C保存。
[0082]d.用木瓜蛋白酶酶解收集到的IgG，通過HPLC純化，采用MALD1-TOF技術(shù)分析了 IgG的兩種糖苷類型及其特異性N-糖基化位點(diǎn)。并用質(zhì)譜檢測(cè)了糖鏈結(jié)構(gòu):經(jīng)酶切并干燥的樣品用A相溶液(5%ACN，0.1%甲酸)充分溶解，高速離心后取上部溶液加入進(jìn)樣瓶，進(jìn)行在線液質(zhì)聯(lián)用分析。液相色譜為反相高效液相色譜并直接與質(zhì)譜的離子源接口連接。流動(dòng)相相溶液95 % ACN，0.1 %甲酸。將進(jìn)樣瓶置于自動(dòng)進(jìn)樣器樣品以25μ!7分鐘的流速進(jìn)樣，進(jìn)樣后，以500nL/min的流速梯度分離。質(zhì)譜分析在nanoES1-LTQ-Orbitrap上進(jìn)行。采用正離子模式掃描。一級(jí)Orbitrap分析，離子采集范圍m/z400-2000，分辨率為m/z400處60000以DDA模式取強(qiáng)度前十位的離子進(jìn)行二級(jí)分析。二級(jí)LTQ分析，全掃描選定的離子進(jìn)入LTQ進(jìn)行CID碎裂，并掃描獲得二級(jí)碎裂譜圖。
[0083]分析顯示在重鏈的FC段的CH2區(qū)域內(nèi)有一個(gè)保守的N-連接糖基化位點(diǎn)Asn297。該位點(diǎn)的糖基化結(jié)構(gòu)為兩個(gè)N-連接的二分支雙觸角復(fù)合型寡糖，含有高甘露糖型(Hex4-6HexNAc2)，雜合型(NeuAco-1Fucq-1Hex4-6HexNAc2-4)和復(fù)雜型(Fuco-1Hex3-4HexNAc3-6糖鏈，其末端為雙唾液酸。質(zhì)譜檢測(cè)糖基化過程委托武漢金開瑞生物工程有限公司完成。證明ST3基因在感染過程中有表達(dá)。
[0084]上述本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案，至少具有如下的技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn):
[0085](I)經(jīng)抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體可以高效表達(dá)含重鏈和輕鏈的人源化抗體。
[0086](2)本發(fā)明得到的重組抗體的糖基化修飾方式和人體內(nèi)的糖基化修飾方式一致。
[0087](3)本發(fā)明的抗體制備方法表達(dá)量大，成本低，效率高。
[0088](4)本發(fā)明制備的抗體干粉可作為血清學(xué)檢查的診斷原料。
[0089](5)本發(fā)明能在Sf SWT-3細(xì)胞系中表達(dá)具有活性的ST3酶基因。
[0090]盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，其特征在于:包括含人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)序列的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I以及含人抗體重鏈IgGl保守區(qū)的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II，所述表達(dá)載體I的序列如序列表SEQ ID I所示，所述表達(dá)載體II的序列如序列表SEQ ID 2所示； 還包括含α-2，3-唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II I，所述表達(dá)載體III的序列如序列表SEQ ID 3所不。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，其特征在于:所述表達(dá)載體1、I1、IIISpFAST Bac I 載體。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體，其特征在于:所述表達(dá)載體III的啟動(dòng)子為桿狀病毒極早期弱啟動(dòng)子iel。4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述方法包括: 所述載體I的構(gòu)建方法為:設(shè)計(jì)引物從pFUSE2ss-CLIg-hk載體上克隆人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)片段，并連接到pFAST Bacl載體上； 所述載體II的構(gòu)建方法為:設(shè)計(jì)引物從pFUSEss-CHIg-hGl載體上克隆人抗體重鏈IgGl保守區(qū)片段，并連接到pFAST Bacl載體上； 所述載體III的構(gòu)建方法為:將pFAST Bacl載體的PH啟動(dòng)子置換成病毒極早期弱啟動(dòng)子iel，以及克隆人α-2，3_唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3基因到含啟動(dòng)子iel的所述pFAST Bacl載體上。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述載體I的構(gòu)建方法中，所述人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)片段和pFAST Bacl載體各自經(jīng)雙酶切后，以3:1的摩爾比例混合后通過連接酶連接;所述載體II的構(gòu)建方法中，所述人抗體重鏈IgGl保守區(qū)片段和pFAST Bacl載體各自經(jīng)雙酶切后，以3:1的摩爾比例混合后通過連接酶連接。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述載體I的構(gòu)建方法中，所述引物為上游引物L(fēng)I和下游引物L(fēng)2，所述上游引物L(fēng)I的序列如SEQ ID 4所示，所述下游引物L(fēng)2的序列如SEQ ID 5所示;所述載體II的構(gòu)建方法中，所述引物為上游引物Hl和下游引物H2，所述上游引物Hl的序列如SEQ ID 6所示，所述下游引物H2的序列如SEQ ID 7所示。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述載體III的構(gòu)建方法中，所述置換包括如下:以pFAST Bacl載體質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增pFAST Bacl載體不含pPH啟動(dòng)子的部分;合成桿狀病毒極早期弱啟動(dòng)子iel，將所述啟動(dòng)子iel與擴(kuò)增后的所述pFAST Bacl載體連接，得到含桿狀病毒極早期弱啟動(dòng)子iel的病毒表達(dá)載體。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述人α-2，3-唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶ST3基因片段和含啟動(dòng)子ie I的pFAST Bac I載體各自經(jīng)雙酶切后，以2:1的摩爾比例混合后通過連接酶連接。9.根據(jù)權(quán)利要求5或8所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述載體1、載體II和載體III的構(gòu)建方法中，所述雙酶切為BamHI和HindIII雙酶切。10.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體在制備全長(zhǎng)抗體中的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用方法包括: 分別克隆分泌鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序 列； 將所述輕鏈可變區(qū)核酸序列連接到含人抗體輕鏈Kappa保守區(qū)序列的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I，將所述重鏈可變區(qū)核酸序列連接到含人抗體重鏈IgGl保守區(qū)的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II; 分別米用昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體I和昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體II轉(zhuǎn)染構(gòu)建重組桿狀病毒粒子，得到兩種病毒； 所述兩種病毒混合感染昆蟲細(xì)胞，得到重組人鼠嵌合抗體。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體在制備全長(zhǎng)抗體中的應(yīng)用，其特征在于:所述輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID 9所示，所述重鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID 10所不O12.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體在表達(dá)人源糖蛋白中的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用方法包括:將特征蛋白基因構(gòu)建到表達(dá)載體III上，利用表達(dá)載體1、II及III分別轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，得到三種病毒，所述三種病毒混合共同感染昆蟲細(xì)胞SfSWT-3細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK105925610SQ201610334911
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】沈鶴霄, 華權(quán)高, 馬峰, 徐春雷
【申請(qǐng)人】武漢金開瑞生物工程有限公司