用于在宿主昆蟲中表達重組蛋白的桿狀病毒dna元件的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明可W被列入生物技術(shù)領(lǐng)域；其涵蓋了包含例如啟動子、作為增強子的同源 區(qū)化r)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的編碼序列（例如桿狀病毒Ac-ie-OlcDNA)或其任意組合且能夠提 高重組蛋白表達效率（例如在昆蟲幼蟲中）的核酸序列。此外，本發(fā)明還指向：包含上述本 發(fā)明核酸序列的載體本身；W所述序列或載體所感染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染的昆蟲；W及，使 用上述序列、載體或昆蟲來生成蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 桿狀病毒表達載體體系度EV巧是一種已建立完善的方法，用于生成用作疫苗、治 療分子或診斷試劑的重組蛋白。BEVS因其過度表達潛力及快速發(fā)展速度，而成為用于生成 任何用途的重組蛋白的最誘人選擇之一。工業(yè)中最常用于重組蛋白表達的桿狀病毒載體 基于首猜銀紋夜蛾（Autographacali化rnica)多核多角體病毒（AcMNPV)，W草地貪夜蛾 (Spodopterafrugiperda)9(Sf9)或21(Sf21)昆蟲細胞為合適表達宿主（1)，并W粉紋夜 蛾（Trichoplusiani，或T.ni)昆蟲幼蟲為活生物工廠（2)。邸VS開發(fā)于80年代（3)，自 此W來，已在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中成功生成了從胞質(zhì)酶到膜結(jié)合蛋白的數(shù)百種重組 蛋白。
[0003] 全世界每年約生產(chǎn)70000噸蠶絲，其生產(chǎn)過程中，將低價值的原料桑樹葉轉(zhuǎn)化為 基于蛋白質(zhì)的高價值產(chǎn)物蠶絲。昆蟲是高效的蛋白質(zhì)生產(chǎn)者，因為其新陳代謝快。鱗翅 目，例如家蠶度ombyxmori)或粉紋夜蛾（Trichoplusiani)，是生物技術(shù)中最常用的兩種 昆蟲。它們在不到2周內(nèi)即可將體積成長約5000倍，并生產(chǎn)出每只昆蟲超過1千米的蠶 絲。絲腺細胞可W產(chǎn)生約80μg蛋白質(zhì)/細胞/天，而最好的哺乳類細胞培養(yǎng)體系僅能產(chǎn) 生約50pg蛋白質(zhì)/細胞/天。從培養(yǎng)哺乳類細胞中得到的重組蛋白可能受外源因子（例 如病毒或航病毒）感染的擔憂，在人用或動物用的昆蟲源產(chǎn)品中即使并非絕不存在，亦顯 著較低。雖然已經(jīng)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因桑蠶來生成人醫(yī)療蛋白（4)，但該技術(shù)尚未用于生產(chǎn)疫苗 抗原。但是，轉(zhuǎn)基因桿狀病毒（首猜銀紋夜蛾多核多角體病毒和家蠶核型多角體病毒）已 經(jīng)用于生產(chǎn)昆蟲源疫苗（insectigen)。從根本上來說，用于在昆蟲細胞培養(yǎng)物中進行抗原 表達的相同桿狀病毒可W用于感染昆蟲幼蟲。感染后，重組抗原在昆蟲組織中積累，在感染 后3-4天，即可處理該幼蟲W獲得該重組抗原，其獲取數(shù)量可W在每條受感染幼蟲數(shù)百微 克（yg)至數(shù)毫克之間。針對動物感染性疾病的實驗性疫苗也得到了極好的測試結(jié)果，哪 怕使用的是從幼蟲獲得的未純化可溶抗原，且在對動物進行重復免疫程序后沒有任何副作 用巧，6, 7, 8)。其他一些不同用途的蛋白質(zhì)也是W昆蟲作為活生物工廠來生產(chǎn)的，例如酶 (9, 10)、抗體（11，12)、荷爾蒙（13, 14)、細胞因子（15, 16)和診斷性蛋白（17, 18, 19, 20)。 上述蛋白中大多數(shù)在合成后經(jīng)過正確處理，且其功能活性在可溶性幼蟲蛋白提取物中保持 完整。用昆蟲作為活生物工廠，因其生產(chǎn)多功能性、可擴展性、效率性和發(fā)展速度，是有希望 取代常規(guī)發(fā)酵技術(shù)和植物源蛋白的一種替代方式，
[0004] 加速重組蛋白表達，從而能夠在昆蟲幼蟲的細胞機器被桿狀病毒感染嚴重損 壞之前進行蛋白表達，將會是BEVS的一項重要改進。由常規(guī)強病毒啟動子多角體蛋白 (polyhe化in,即po化）或plO基因所驅(qū)動的晚期表達，在外源蛋白翻譯后修飾中具有嚴重 不利條件。桿狀病毒啟動子能夠比常規(guī)使用的P0化或plO啟動子更早地啟動表達，因此其 特性在于可用作異源蛋白生產(chǎn)，但其生產(chǎn)力降低（21)。
[0005] 改進BEVS的另一種可能是，通過減少病毒誘導的細胞死亡，在感染后晚期更好地 保存細胞完整性。降低感染后晚期因BEVS導致的昆蟲細胞機器嚴重損壞，將不僅增加可用 于生產(chǎn)和積累重組蛋白（分泌或未分泌）的時間，還為復合蛋白的折疊或生成蛋白的所有 翻譯后修飾提供更多時間。桿狀病毒感染的昆蟲幼蟲在感染過程中W病毒劑量依賴性的方 式生產(chǎn)和積累重組蛋白。延長受感染幼蟲的存活，連同針對高感染劑量進行某種保護，可W 極大地提高充當活生物工廠的昆蟲的生產(chǎn)力。
[0006] 已經(jīng)測定出一些桿狀病毒DNA元件參與啟動了病毒傳播所必需的后期表達因子 的基因。其中之一為AcMNPV(首猜銀紋夜蛾（Autographscalifornica)多核多角體病毒） 的立即早期（ie)蛋白（immediateearlyprotein)IE-1及其剪接變體IE-0。因其內(nèi)部翻 譯起始，翻譯由Ac-ie-01cDNA編碼的AcMNPVmRNAs會既產(chǎn)生IE-0又產(chǎn)生IE1。兩者均 由于具有作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的能力（22)而被認為是桿狀病毒基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。 AcMNPVIE-1合成于感染極早期，是67-kDa的二聚DNA結(jié)合性蛋白，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗中，它 通過其N端酸性結(jié)構(gòu)域的活性來刺激轉(zhuǎn)錄（23, 24)。IE-1在細胞核中累積，且保留于此度 過晚期（25)。IE-1作為同源二聚體與桿狀病毒同源區(qū)域化r)序列的結(jié)合，能增強IE-1 的反式激活，所述同源區(qū)域充當轉(zhuǎn)錄增強子W及病毒DNA復制起點。AcMNPV立即早期蛋白 IE-0(74kDa)與IE-1相同，只是其N端上另有54個氨基酸殘基。AcMNPVIE-0是含636個 氨基酸的72. 6-kDa的蛋白，它由orfl41 (exonO)所編碼的38個氨基酸、iel上游未翻譯前 導所編碼的16個氨基酸W及IE-1蛋白的全部582個氨基酸所組成。因此，除了融合在N 端的額外54個氨基酸外，最終產(chǎn)物與IE-1 -模一樣。推測因為其共有序列，IE-0和IE-1 具有相同的生物化學活性，包括結(jié)合虹增強子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
[0007] 由于缺乏強于商用啟動子（PO化和plO)的新型替代啟動子，W及缺乏任何能通過 降低病毒導致的細胞損傷從而在桿狀病毒體系中實現(xiàn)長期表達的替代形式，因此，本發(fā)明 聚焦于通過在桿狀病毒表達組件中并入重組DNA元件的方法，解決所述問題。令人吃驚地， 本發(fā)明展示了 ：包含桿狀病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、增強子同源區(qū)域化r)序列、啟動子或啟動子 組合的所述表達組件，能夠?qū)⒗ハx幼蟲中的重組蛋白生產(chǎn)提高到前所未有的水平。此外，本 發(fā)明的表達組件還提高了高感染劑量桿狀病毒感染的昆蟲幼蟲在感染后晚期的存活率，由 此令桿狀病毒感染對昆蟲的致病作用最小化。另一方面，提高了桿狀病毒感染期間的細胞 功能完整性，也有助于在昆蟲幼蟲中進行正確的重組蛋白翻譯后加工。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了用于改進桿狀病毒感染的昆蟲幼蟲中的重組蛋白表達的方法及其 產(chǎn)物。
[0009] W下各項為能夠?qū)崿F(xiàn)該改進表達的優(yōu)選實施例：
[0010] 1.含有能夠高于內(nèi)源水平地表達充當轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的蛋白IE-1、IE-0和/或其 片段的核酸序列的昆蟲，其中所述核酸選自：
[0011] (a)含有如SEQIDNO: 1-5中任一項所示的核巧酸序列的核酸；
[001引 化）與SEQIDNO: 1-5中任一項所示的核巧酸序列的序列一致性為至少70%、優(yōu) 選為至少75 %、更優(yōu)選為至少80 %、更優(yōu)選為至少85 %、更優(yōu)選為至少90 %、最優(yōu)選為至少 95%，并編碼能夠在重組桿狀病毒中充當轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的蛋白的核酸序列；
[0013] (C)編碼含有如SEQIDN0:6-9中任一項所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列； W及
[0014] (d)編碼了與SEQIDN0:6-9中任一項所示的氨基酸序列的序列一致性為至少 70 %、優(yōu)選為至少75 %、更優(yōu)選為至少80 %、更優(yōu)選為至少85 %、更優(yōu)選為至少90 %、最優(yōu) 選為至少95%并能夠在重組桿狀病毒中充當轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的氨基酸序列的核酸序列。
[0015] 2.根據(jù)第1項所述的昆蟲，進一步包括至少一個充當增強子區(qū)域并可操作地連接 任何適用于驅(qū)動重組蛋白表達的啟動子的重組同源區(qū)域化r)。
[0016] 3.根據(jù)第2項所述的昆蟲，其中所述重組同源區(qū)域化r)是如SEQIDN0:27(虹1) 所示的序列。
[0017] 4.根據(jù)第2或3項所述的昆蟲，其中，所述可操作地連接在所述重組同源區(qū)域 化r)上的啟動子選自如下核酸：
[001引 （a)含有如SEQIDNO: 10-16中任一項所示的核巧酸序列的核酸訊
[0019] 化）能夠在重組桿狀病毒中充當啟動子且與SEQIDNO: 10-16中任一項所示的核 巧酸序列的序列一致性為至少70%、優(yōu)選為至少75%、更優(yōu)選為至少80%、更優(yōu)選為至少 85 %、更優(yōu)選為至少90 %、最優(yōu)選為至少95 %的核酸序列。
[0020] 5.根據(jù)1-4中任一項所述的昆蟲，包含了含有重組啟動子、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的 序列、選自SEQIDNO: 17-26的增強子區(qū)域的組合的核酸序列。
[0021] 6.根據(jù)1-5中任一項所述的昆蟲，進一步包括編碼重組蛋白的核酸序列，其中所 述核酸序列可操作地連接在選自第1-5項中的核酸序列。
[002引 7.根據(jù)1-6中任一項所述的昆蟲，其中所述昆蟲來自鱗翅目（Lepidoptera)。
[0023] 8.根據(jù)1-7中任一項所述的昆蟲，其中所述昆蟲選自Jrichoplusiani(粉紋夜 蛾）、Spodopterafrugiperda(草地貪夜蛾）、Spodopteraexigua(甜菜夜蛾）、Ascalapha odorata、Bombyxmori(家蠶）、Rachiplusiani和Stigmeneacrea。
[0024] 9.根據(jù)1-8中任一項所述的昆蟲，其中所述核酸序列是通過重組桿狀病毒（優(yōu)選 為AcMNPV或BmNPV)引入該昆蟲的。
[002引10.用于產(chǎn)生重組蛋白的方法，包括：使用1-9中任一項所述的昆蟲，并通過常規(guī) 方法對重組蛋白進行提取和純化。
[0026] 11.根據(jù)第10項所述的用于生產(chǎn)重組蛋白的方法，其中所述重組蛋白選自：亞單 位單體疫苗、亞單位多聚體疫苗、病毒樣顆粒、治療蛋白、抗體、酶、細胞因子、凝血因子、抗 凝劑、受體、荷爾蒙或診斷性蛋白試劑。
[0027] 12.用于含有如1-6中任一項所述核酸序列的昆蟲的飼育、喂養(yǎng)或注射培養(yǎng)基。
【附圖說明】
[0028] 圖1:本發(fā)明的桿狀病毒重組DNA元件的示意圖，包括4種主要元件：編碼轉(zhuǎn)錄調(diào) 控因子的序列（A，例如IE0和IE1)，其表達受到啟動子度，例如P0化或地2g)的驅(qū)動；增強 子同源區(qū)域化r)序列（C，例如虹1)，位于驅(qū)動編碼重組蛋白的外源基因表達的啟動子值；e.g.plO、pB2gplO或p6. 9pl0)的上游。該示意圖展示了本發(fā)明的重組DNA元件之間相互作 用，從而獲得前所未有的重組蛋白過度表達的理論機制。
[002引 圖2 :使用"克隆體系（invitrogen?)生成重組桿狀病毒的不同策略。
[0030]圖3 :生成與其他用于制備重組桿狀病毒的商用技術(shù)相兼容的克隆、供體和轉(zhuǎn)移 載體的基本方案。
[0031] 圖4 :A)用在PO化啟動子控制下表達GFP蛋白的常規(guī)桿狀病毒或含有本發(fā)明的桿 狀病毒組件PO化Ac-ie-01/虹lp6. 9plOGFP的桿狀病毒，W500或50000P即接種粉紋夜蛾 燈richoplusiani)幼蟲（五齡），在感染96小時后所生成的重組GFP。B)W圖4A中的相 同桿狀病毒W(wǎng)兩種不同感染劑量，即500和50000P即S，感染96小時后的幼蟲存活率。 [003引圖5 :A)包含本發(fā)明的表達組件PO化Ac-ie-01/