一種抗蟲基因Zm-Cry1A(h)及其相關(guān)生物材料與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗蟲基因Zm-CrylA(h)及其相關(guān)生物材料與應用，屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是我國重要的糧食作物和飼料作物，隨著全球氣溫變暖，冬季氣溫越來越高， 昆蟲越冬成活率不斷增高，蟲害的危害性不斷增大。全世界范圍內(nèi)玉米害蟲達350多種，其 中鱗翅目害蟲玉米螟對玉米的危害影響最大，全球玉米每年因玉米螟造成的損失達600~ 900萬噸，給玉米生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。培育抗玉米螟的轉(zhuǎn)基因玉米可有效降低玉米 螟對玉米的危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是提供一種DNA分子。
[0004] 本發(fā)明提供的DNA分子是如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0005] 1)如序列表中序列1所示的DNA分子；
[0006] 2)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98 %或至少 具有99%同源性且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0007] 3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的 DNA分子；
[0008] 所述嚴格條件可為如下：在50°C，7%十二烷基硫酸鈉（SDS)、0. 5M Na3P〇jP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. 1% SDS中漂洗；還可為在50°C，在7% SDS、 0. 5M Na3P0jP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；還可為 在50 °C，7%SDS、0. 5M Na3P0jP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50 °C，0? 5 X SSC，0? 1% SDS中漂洗；還可為在50°C，7% SDS、0. 5M Na3P0jP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C， 0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；還可為在50°C，7% SDS、0. 5M Na3P0jP ImM EDTA的混合溶液 中雜交，在65°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；也可為在65°C，6XSSC，0. 5% SDS的溶液中 雜交，在2 X SSC，0? 1%SDS和1 X SSC，0? 1%SDS各洗膜一次。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供與上述DNA分子相關(guān)的生物材料。
[0010] 本發(fā)明提供的與上述DNA分子相關(guān)的生物材料為下述B1)至B4)中的任一種：
[0011] B1)含有上述DNA分子的表達盒；
[0012]B2)含有上述DNA分子的重組載體或含有B1)所述表達盒的重組載體；
[0013]B3)含有上述DNA分子的重組菌或含有B1)所述表達盒的重組菌或含有B2)所述 重組載體的重組菌；
[0014]B4)含有上述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系或含有B1)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物 細胞系或含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系。
[0015] 上述生物材料中，B4)所述轉(zhuǎn)基因植物細胞系不包括繁殖材料。
[0016] 上述生物材料中，所述重組載體可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建；所述植物表 達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pROKII、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa或 pCAMBIA1391-Xb等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺 苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚 腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導（Ti)質(zhì)粒基因（如胭脂合成酶Nos 基因）、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述 基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子（如 花椰菜花葉病毒（CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子（Ubiquitin)、組成型啟動子或組織 特異表達啟動子（如種子特異表達的啟動子），它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié) 合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子 或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需 與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子 的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或 結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進 行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基 因、螢光素酶基因等）、抗生素的標記基因（如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll 基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦 予對methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化學試劑 標記基因等（如抗除莠劑基因）、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。
[0017] 本發(fā)明的重組載體為將PBI121載體的Xbal和SacI酶切位點間的DNA片段替換 為序列表中序列1所示的Zm-CrylA(h)基因得到的載體。
[0018] 上述DNA分子或上述相關(guān)生物材料在調(diào)控植物抗蟲性中的應用也屬于本發(fā)明的 保護范圍。
[0019] 上述應用中，所述調(diào)控具體為提高。
[0020] 上述應用中，所述蟲為玉米螟。
[0021] 上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米。
[0022] 上述DNA分子或上述相關(guān)生物材料在培育抗蟲性轉(zhuǎn)基因植物中的應用也屬于本 發(fā)明的保護范圍。
[0023] 上述應用中，所述蟲為玉米螟。
[0024] 上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米。
[0025] 本發(fā)明的最后一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0026] 本發(fā)明提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法包括向出發(fā)植物中導入上述DNA分子得到 抗蟲性高于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物的步驟。
[0027] 上述方法中，所述DNA分子是通過重組載體導入出發(fā)植物的；所述重組載體為 將pBI121載體的Xbal和SacI酶切位點間的DNA片段替換為序列表中序列1所示的 Zm-CrylA(h)基因得到的載體。
[0028] 上述方法中，所述蟲為玉米螟。
[0029] 上述方法中，所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為 玉米。
[0030] 本發(fā)明根據(jù)玉米密碼子偏好性，人工合成了新基因Zm-CrylAh。通過試驗證明：將 本發(fā)明的Zm-CrylAh基因?qū)胗衩缀螳@得的轉(zhuǎn)Zm-CrylAh玉米，其抗蟲性明顯高于野生型 玉米植株。本發(fā)明為提高植物的抗蟲性提供了新的基因，對培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物，尤其是玉 米，具有重要意義。
【附圖說明】
[0031]圖1為玉米幼胚轉(zhuǎn)化再生過程。其中，A為在含卡那霉素的培養(yǎng)基上獲得的抗性 愈傷組織；B為誘導苗的分化；C為促壯培養(yǎng)和生根；D為移栽。
[0032] 圖2為轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定。其中，1-8泳道為轉(zhuǎn)基因植株（1為轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h) 玉米T_l、4 為轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米T_2、6 為轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米T_3、7 為轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h) 玉米T-4) ;9為陽性對照（質(zhì)粒DNA) ;10為Marker。
[0033] 圖3為RT-PCR檢測轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米的電泳圖。其中，CK為野生型玉米植株； T-l、T-2 和T-3 為轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米植株。
[0034] 圖4為轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米T-1與野生型玉米植株的抗蟲試驗結(jié)果。
[0035] 圖5為免疫試紙條檢測轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米。其中，左邊1、2、3和4分別為轉(zhuǎn) Zm-CrylA(h)玉米T-l、T-2、T-3和T-4;右邊1、2、3和4為陰性對照。
【具體實施方式】
[0036] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038]玉米自交系18599和綜31在文獻"YU Gui-rong, LIU Yan, DU Wen-ping, et al. Optimization of Agrobacterium Tumefaciens-Mediated Immature Embryo Transformation System and the Transformation of Glyphosate-resistant Gene 2mG2_EPSPS in Maize(Zea mays L.)[J].Journal of Integrative Agriculture(formerly Agricultural Sciences in China)，2013，119(13):605_675?"中公開過，公眾可從四川省 農(nóng)科院生物技術(shù)核技術(shù)研宄所獲得。
[0039] 實施例1、轉(zhuǎn)基因玉米的獲得及表型鑒定
[0040] 一、Zm-crylAh基因的獲得
[0041] 根據(jù)玉米密碼子偏好性，人工合成序列1所示的DNA分子，將其命名為 Zm-CrylA(h) 〇
[0042] 二、真核雙價重組載體的構(gòu)建
[0043] 1、以如序列表中序列1所示的人工合成的Zm-CrylA(h)基因為模板，采用P1和P2 引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。引物的序列如下：
[0044]P1:5' -cgctctagaATGAAGAATAGCATCAAGCTGT-3' (小寫字母為