牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆和測序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種牛樟芝Laccase蛋白基因及其克隆 和測序方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶（Laccase)是一種糖蛋白，肽鏈一般由500個左右氨基酸組成，糖配基占整個 分子的10%~45%。糖組成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、巖藻糖和阿拉伯糖等。由于分 子中糖基的差異，漆酶的分子量隨來源不同會有很大差異，甚至來源相同的漆酶分子量也 會不同。盡管漆酶的氨基酸序列同源性差異很大，一般不同來源的漆酶同源性低于50%，但 其催化位點序列還是非常保守的。通過對漆酶蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的研宄，發(fā)現(xiàn)漆酶具有3個 銅離子結(jié)合位點，共結(jié)合有4個銅離子，根據(jù)它們的氧化還原電勢、光學(xué)和磁學(xué)特征劃分為 三種類型。
[0003] 第一類銅離子（Cul)能與包括水在內(nèi)的溶劑作用，各種銅離子絡(luò)合劑能將其除去 導(dǎo)致酶的活性大大減少。第二類銅離子（Cu2)是由兩分子的咪唑和一分子的水配位形成 松散的扭曲四面體幾何構(gòu)型，所以很容易除去，在有氧條件下則不易除去。第三類銅離子 (Cu3a，Cu3b)與三個組氨酸分子和一個氫氧化物分子形成受阻四面體幾何構(gòu)型，在有氧分 子存在時，這對銅離子由氫氧化物為橋結(jié)合在一起，Cu-Cu工價體產(chǎn)生強烈的反鐵磁性，檢 測不到EPR光譜信號。這類二價復(fù)合物在330nm處的吸收隨活性位點的還原而消失。
[0004] 漆酶能催化許多化合物的氧化反應(yīng)，底物比較廣泛，包括許多對二酚結(jié)構(gòu)類似的 化合物，如氨基苯酚，鄰、對苯二酚，多胺，木質(zhì)素和芳基二胺等。一些漆酶能高效的氧化抗 壞血酸，另外一些真菌漆酶還能催化木質(zhì)素和甲氧基酚酸的脫甲基反應(yīng)。漆酶的抑制劑大 多是銅離子螯合劑，有鹵化物、半胱氨酸、EDTA和SDS等，離子強度的不同也會影響酶的活 力。不同來源的漆酶最適pH范圍也不同。
[0005] 漆酶的活性與真菌的出芽、色素生產(chǎn)、木質(zhì)素降解和病源發(fā)生相關(guān)，同時漆酶還可 以保護真菌病原菌免受寄主植保素和鞣質(zhì)等化合物的影響，所以漆酶被認為是重要的病原 菌毒力因子。例如根病原菌Heterobasidionannosum的侵染性和漆酶緊密相關(guān)。
[0006] 漆酶可存活于空氣中，發(fā)生反應(yīng)后唯一的產(chǎn)物就是水，因此本質(zhì)上是一種環(huán)保型 酵素，存在菇、菌及植物中，有關(guān)真菌漆酶的研宄與應(yīng)用已有大量報道。真菌漆酶因為具有 降解木質(zhì)素、酚類物質(zhì)的作用，所以在紡織、造紙、食品、飼料、環(huán)保等方面具有廣泛的應(yīng)用 潛力。分泌漆酶的主要真菌有黃孢原毛平革菌、彩絨革蓋菌、變色栓菌、射脈菌、鳳尾菇、香 菇等，這些真菌都屬于擔(dān)子菌門。
[0007] 漆酶在植物中主要起到合成木質(zhì)素的作用，而真菌所分泌的漆酶作用恰恰相反， 主要起降解木質(zhì)素的作用，因此真菌漆酶對木質(zhì)素的降解作用使漆酶具有廣泛的潛在應(yīng)用 價值。牛樟芝是珍貴的藥用真菌，是牛樟樹上發(fā)現(xiàn)的唯一腐木菌，但是樟芝的寄生病源性 并不強，牛樟樹很少死亡，所以，研宄牛樟芝的漆酶具有重要意義。本發(fā)明參考其它物種 Laccase基因序列，克隆測序獲得牛樟芝Laccase基因的cDNA序列，并對不同物種Laccase 基因的CDS序列進行同源性比較，旨在了解和驗證Laccase基因的結(jié)構(gòu)特點，為今后研宄Laccase基因與菌類漆酶提供基礎(chǔ)資料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種牛樟芝Laccase蛋白基因。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實施方式提供了一種牛樟芝Laccase蛋白基因， 該基因為一種漆酶的基因，具體來說，本發(fā)明的實施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基 因，該基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0011] 同時，本發(fā)明的實施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因，其核苷酸序列編碼 具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的多肽。
[0012] 本發(fā)明的實施方式還提供上述牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法，該方 法包含以下步驟：
[0013] (1)組織分離：取牛樟芝菌絲，以重蒸水沖洗去除培養(yǎng)基及雜質(zhì)，然后將組織樣迅 速放入液氮中冷凍后于_70°C保存；
[0014] (2)總RNA的分離：從上述步驟（1)中凍存的組織樣中提取總RNA，通過分光光度 計測定RNA含量，并采用瓊脂糖電泳分析進行總RNA的鑒定；
[0015] (3)全長cDNA序列的克隆和測序：以上述步驟⑵中獲得的總RNA為模板，設(shè)計 并合成SEQ ID NO: 3所示的正向引物和SEQ ID NO: 4所示的反向引物，進行反轉(zhuǎn)錄-PCR擴 增，以獲得牛樟芝Laccase蛋白基因cDNA序列，對cDNA序列進行克隆，得到重組質(zhì)粒；
[0016]SEQIDN0:3 :5'-ATGGCCAACCTTCGCCTTCTC-3'；
[0017] SEQ ID N0:4 :TTTTTTTTTTTTTTT，即Oligo(dT) 15。
[0018] (4)測序：對上述步驟（3)中的重組質(zhì)粒進行測序。
[0019] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法 中，步驟（2)中從牛樟芝菌的組織樣中提取總RNA時使用Trizol試劑進行提取。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測 序方法中，步驟（3)中進行反轉(zhuǎn)錄-PCR擴增的反轉(zhuǎn)錄體系組成為：緩沖液（2XBca 1stBuffer)10yl，25MmMgS044yl，核苷酸（dNTP)lyl，40U/yl酶抑制齊lj(Rnase Inhibitor) 0.5yl，22U/yl反轉(zhuǎn)錄酶（BcaBESTPolymerase)lyl，SEQIDNO: 3 所示的正 向引物0. 5yl，SEQIDN0:4所示的反向引物0. 5yl，RNA模板（RNASample)lyl，無酶水 (RnaseFreedH20) 1. 5y1，總體系為 20yl〇
[0021] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法 中，步驟⑶中進行反轉(zhuǎn)錄-PCR擴增的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：65°C1分鐘，30°C5分鐘，15~ 30分鐘內(nèi)勻速升溫，65°C25分鐘，98°C5分鐘，5°C5分鐘。
[0022] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方 法中，步驟（3)中進行反轉(zhuǎn)錄-PCR擴增的PCR擴增反應(yīng)條件為：97°C變性5分鐘；然后以 95°C30秒，55°C30秒，72°C1分鐘為一個循環(huán)，進行30次循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，在 4°C下保存。
[0023] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式所提供的牛樟芝Laccase蛋白基因的克隆和測序方法 中，步驟（3)中對cDNA序列進行克隆的步驟包括：對反轉(zhuǎn)錄-PCR擴增片段回收DNA，將回收 到的DNA片段同T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，然后進行轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)， 回收重組質(zhì)粒，對回收到的重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序。
[0024] 本發(fā)明中的Laccase蛋白基因的cDNA序列是通過以牛樟芝菌絲組織中總RNA為 模板，參考粗毛革孔菌、杏鮑菇、木耳、毛頭鬼傘等物種的Laccase蛋白基因的同源序列設(shè) 計引物，進行反轉(zhuǎn)錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的牛樟芝Laccase蛋白基因cDNA序列 見SEQIDNO. 1。將牛樟芝Laccase蛋白基因cDNA序列中的編碼序列（CDS)按通用密碼子 翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見SEQIDNO. 2。
[0025] 在SEQIDNO. 1中，RT-PCR產(chǎn)物長度約為1600bp，電泳結(jié)果見附圖1，其中33-35 位為起始密碼子ATG，1569-1571位為終止密碼子TGA，33-1571位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域（⑶S)。 在SEQIDNO. 1中，牛樟芝Laccase蛋白基因編碼512個氨基酸。牛樟芝和白粗毛革孔菌、 杏鮑葫、木耳等真菌用ClustalX中對齊的Laccase蛋白基因編碼氨基酸序列同源性比較 結(jié)果見附圖2。對包括SEQIDNO. 2在內(nèi)的12個物種的12條Laccase蛋白基因的⑶S序 列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：牛樟芝Laccase蛋白同杏鮑菇的進化距離最近，間接證明 了所得到的序列為牛樟芝的Laccase蛋白基因。
【附圖說明】
[0026] 圖1是；實施例1中的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖，其中，泳道1、2、3為per產(chǎn)物，泳道4 為Marker:A-HindIII;泳道 5 :DL2000 ;
[0027] 圖2是；實施例2中的氨基酸同源比對圖；
[0028] 圖3是；實施例2中構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹圖。
【具體實施方式】
[0029] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的各實 施方式進行詳細的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實施方式中， 為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細節(jié)和基 于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現(xiàn)本申請各權(quán)利要求所要求保護的技術(shù)方 案。
[0030] 實施例1牛樟芝Laccase蛋白基因cDNA序列的克隆
[0031] 1?組織分離（Isolation)
[0032] 從上海勤生緣生物科技有限公司崇明區(qū)陳家鎮(zhèn)裕民路20號牛樟芝培養(yǎng)基地處采 得處于生長期的牛樟芝菌絲，用ddH20沖洗去除培養(yǎng)基等雜質(zhì)，將組織樣迅速放入液氮中冷 凍后于_70°C保存，拿回實驗室準(zhǔn)備提取組織總RNA。
[0033] 2?總RNA的分離（TotalRNAisolation)
[0034] (1)提取RNA的準(zhǔn)備工作
[0035] 玻璃制品用0. 1M的NaOH浸泡過夜，用自來水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍， 180°C烘烤4小時。
[0036] 勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用0. 1 %的DEPC水沖洗.由于 未滅活的DEPC對PCR反應(yīng)有影響，可用0. 5%的SDS處理。
[0037] Tip頭、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌使DEPC失活。
[0038] 雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每100ml水或溶液加0.lmlDEPC液，室溫放置過 夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
[0039] (2)組織總RNA提取
[0040]取 100mg在液氮中凍存的組織樣放入有l(wèi)mlTrizol(trizalreagent,invitrogen BRL，USA)的勻漿器管中勻漿。4°C12000g離心10分鐘。吸取上清液，15-30°C溫育5分鐘。 加0. 2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15-30°C溫育2-3分鐘。4°C12000g離心 15分鐘。吸取上清液，加0. 8ml異丙醇，混合均勻。15-30°C溫育10分鐘，4°C12000g離心 10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加lml75%乙醇洗滌RNA，4°C7500g 離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水（RNasefree)中分裝，-70°C保存。
[0041] (3)組織總RNA的鑒定
[0042] 通過分光光度計上測定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如 下：電泳槽用RNA清洗