專利名稱：葡萄糖氧化酶生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葡萄糖氧化酶生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
作為重要的食品保鮮食品添加劑，目前未見完整的葡萄糖氧化酶生產(chǎn)工 藝報(bào)道，大多數(shù)文獻(xiàn)資料報(bào)道僅僅是生產(chǎn)工藝的一個(gè)某一環(huán)節(jié)，相互之間鏈 接性差，可操作性不強(qiáng)之特點(diǎn)。本專利工藝較為系統(tǒng)報(bào)道了葡萄糖氧化酶制 劑生產(chǎn)方法，具有發(fā)酵生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)設(shè)備要求簡單，可操作性強(qiáng)之特點(diǎn)， 所制備得到的葡萄糖氧化酶具有性能穩(wěn)定，催化速度快，作用于底物高度專 一等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種葡萄糖氧化酶生產(chǎn)方法，工藝簡單、易操作、 酶活高、收率高、生產(chǎn)成本低。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是 一種葡萄糖氧化酶生產(chǎn) 方法，包括以下步驟
(l)葡萄糖氧化酶粗酶液的獲得
① 高含量的葡萄糖氧化酶發(fā)酵液獲取 挑取長滿可產(chǎn)葡萄糖氧化酶點(diǎn)的青霉菌菌苔，在一級培養(yǎng)基中30
32"C振蕩培養(yǎng)24h;
然后以2 3%接種量接種于二級培養(yǎng)基中，30 32"振蕩培養(yǎng)24h;
最后以2 3%接種量接種于內(nèi)有三級培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，控制溶氧 為60%以上，pH保持在6.0 7.0之間，發(fā)酵36 48h即可得到酶活為7.0 U 以上的葡萄糖氧化酶發(fā)酵液；
② 發(fā)酵液離心濃縮處理
對發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，8000rpm， 20min，收取上清液，微濾去除 殘留的微小顆粒及菌體，超濾濃縮，直至酶活達(dá)到20U以上的葡萄糖氧化酶
3發(fā)酵液；
(2) 葡萄糖氧化酶的提純及脫鹽
4。C條件下，向超濾濃縮酶液體中緩緩加入硫酸銨固體顆粒，直至形成
90%硫酸銨溶液，鹽析4 6h， 12000r/min離心得沉淀，用pH 7.0的Tris-HCl
緩沖溶液收取沉淀蛋白，加去離子水稀釋8 10倍，超濾脫鹽濃縮處理；
(3) 形成葡萄糖氧化酶凍干成品
加入保護(hù)劑于-2(TC條件下冷凍真空干燥48小時(shí)，即得到葡萄糖氧化酶 凍干品。
所述步驟①中的一級培養(yǎng)基、二級培養(yǎng)基和三級培養(yǎng)基的成分為葡萄 糖80g/L、蛋白胨5g/L、硝酸鈉3g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.5g/L、 氯化鈣2g/L。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明生產(chǎn)葡萄糖氧化酶具有工藝簡單、易操作、 酶活高、收率高、生產(chǎn)成本低之特點(diǎn)，獲取制備得到的葡萄糖氧化酶可廣泛 運(yùn)用于食品添加劑工業(yè)中。
1、 本發(fā)明較為系統(tǒng)的公布了葡萄糖氧化酶凍干品的生產(chǎn)工藝流程，制備 得到的葡萄氧化酶具有收率高，酶活高的特點(diǎn)。
2、 本工藝流程操作簡單，操作性強(qiáng)，適合大規(guī)模生產(chǎn)，所制備得到的葡 萄糖氧化酶為黃白，雜質(zhì)少，不存有任何的有害的化學(xué)藥品，可廣泛運(yùn)用于 食品添加劑量工業(yè)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。 實(shí)施例
(1)、葡萄糖氧化酶粗酶液的獲得 ①高含量的葡萄糖氧化酶發(fā)酵液獲取
a、 挑取長滿可產(chǎn)葡萄糖氧化酶點(diǎn)青霉菌菌苔于30ml的滅菌培養(yǎng)基(葡萄 糖80g/L、蛋白胨5g/L、硝酸鈉3g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯 化鈣2g/L)中(250ml規(guī)格三角瓶)，30 32。C振蕩培養(yǎng)24h;
b、 然后以2 3%接種量接種于乘有150ml (250ml規(guī)格三角瓶)滅菌培養(yǎng)基中(葡萄糖80g/L、蛋白胨5g/L、硝酸鈉3g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂 0.5g/L、氯化鈣2g/L)， 30 32t:振蕩培養(yǎng)24h;
c、再以2 37。接種量接種于滅菌好培養(yǎng)基(葡萄糖80g/L、蛋白胨5g/L、 硝酸鈉3g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣2g/L)發(fā)酵罐中，通 過轉(zhuǎn)數(shù)及通氣量控制溶氧為60%以上，通過氫氧化鈉溶液使發(fā)酵罐內(nèi)pH保 持在6.0 7.0之間，經(jīng)36 48h發(fā)酵即可得到含有酶活為7.0U (酶活定義 每分鐘催化氧化lpmol葡萄糖的酶量的定義為一個(gè)酶活力單位)以上葡萄糖 氧化酶發(fā)酵液。
②發(fā)酵液離心濃縮處理
離心制備得到發(fā)酵液(離心條件8000rpm， 20min)，去除菌絲體收取上 清液，過微濾膜去除殘留的微小顆粒及菌體，過超濾膜進(jìn)行濃縮處理直至酶 活達(dá)到20U以上。
(2) 、葡萄糖氧化酶的進(jìn)步提純及脫鹽
fC條件下，超濾濃縮酶液體中緩緩加入硫酸銨直至形成90%硫酸銨溶 液，鹽析4 6h， 12000 r/min離心得沉淀，用定量的Tris-HCl( pH 7.0)緩沖 溶解收取沉淀蛋白，加去離子水稀釋，經(jīng)由一定量的中空纖維超濾柱膜脫鹽 濃縮處理。
(3) 、葡萄糖氧化酶凍干成品形成
收集得到脫鹽濃縮葡萄糖氧化酶酶液，加入保護(hù)劑于-2(TC條件下冷凍真 空干燥48小時(shí)，即得到葡萄糖氧化酶凍干品。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明作任何形式上的限 制，雖然本發(fā)明己以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何 熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭 示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離 本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡 單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種葡萄糖氧化酶生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)葡萄糖氧化酶粗酶液的獲得①高含量的葡萄糖氧化酶發(fā)酵液獲取挑取長滿可產(chǎn)葡萄糖氧化酶點(diǎn)的青霉菌菌苔，在一級培養(yǎng)基中30～32℃振蕩培養(yǎng)24h；然后以2～3％接種量接種于二級培養(yǎng)基中，30～32℃振蕩培養(yǎng)24h；最后以2～3％接種量接種于內(nèi)有三級培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，控制溶氧為60％以上，pH保持在6.0～7.0之間，發(fā)酵36～48h即可得到酶活為7.0U以上的葡萄糖氧化酶發(fā)酵液；②發(fā)酵液離心濃縮處理對發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，8000rpm，20min，收取上清液，微濾去除殘留的微小顆粒及菌體，超濾濃縮，直至酶活達(dá)到20U以上的葡萄糖氧化酶發(fā)酵液；(2)葡萄糖氧化酶的提純及脫鹽4℃條件下，向超濾濃縮酶液體中緩緩加入硫酸銨固體顆粒，直至形成90％硫酸銨溶液，鹽析4～6h，12000r/min離心得沉淀，用pH7.0的Tris-HCl緩沖溶液收取沉淀蛋白，加去離子水稀釋8～10倍，超濾脫鹽濃縮處理；(3)形成葡萄糖氧化酶凍干成品加入保護(hù)劑于-20℃條件下冷凍真空干燥48小時(shí)，即得到葡萄糖氧化酶凍干品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖氧化酶生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟①中的一級培養(yǎng)基、二級培養(yǎng)基和三級培養(yǎng)基的成分為葡萄糖80g/L、蛋白胨5g/L、硝酸鈉3g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣2g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葡萄糖氧化酶生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)葡萄糖氧化酶粗酶液的獲得①高含量的葡萄糖氧化酶發(fā)酵液獲取，和②發(fā)酵液離心濃縮處理；(2)葡萄糖氧化酶的提純及脫鹽；以及(3)形成葡萄糖氧化酶凍干成品。本發(fā)明生產(chǎn)葡萄糖氧化酶具有工藝簡單、易操作、酶活高、收率高、生產(chǎn)成本低之特點(diǎn)，獲取制備得到的葡萄糖氧化酶可廣泛運(yùn)用于食品添加劑工業(yè)中。
文檔編號C12N9/04GK101481680SQ20091000512
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者喬彥良, 崔增學(xué), 李國保 申請人:崔增學(xué)