專利名稱：一種葡萄糖氧化酶的編碼基因及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子酶學(xué)與生物技術(shù)，具體涉及一種高活力葡萄糖氧化酶的編 碼基因，同時涉及該突變株編碼基因的制備方法。該突變基因編碼的高酶活葡 萄糖氧化酶突變株蛋白，可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及生物等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡萄糖氧化酶是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一。目前應(yīng)用中使用的葡萄糖 氧化酶的生產(chǎn)一般都采用黑曲霉和青霉屬菌株作生產(chǎn)菌，進(jìn)行深層通風(fēng)培養(yǎng)的方 法制取。我國和美國常以點青霉和黃色青霉為生產(chǎn)菌種，日本則篩選出尼崎青霉 作為常用菌種。
自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應(yīng)用于血糖測 定以來，GOD被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等許多相關(guān)領(lǐng)域。
在食品工業(yè)中，由于氧的存在，引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并 為許多微生物生長創(chuàng)造了條件。目前，許多國家已將GOD作為工人的安全抗 氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主 要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一 氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準(zhǔn)確簡易地測定各種食品中 的葡萄糖含量，指導(dǎo)生產(chǎn)。
在醫(yī)藥工業(yè)中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(槳)、尿液及腦脊 液中葡萄糖的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙
垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發(fā)生。此外，由于可以催化生成H202，還 可用于對H202敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。
GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)飼糧消 化，促進(jìn)動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加 劑，可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進(jìn)動物生長作用。
由于GOD具有廣泛的實用價值，隨著GOD在酵母中外源表達(dá)的成功，也有 人利用定向進(jìn)化的手段改造GOD，使酶活提高至原來的1.5倍，在熱穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性方面，也得到了性質(zhì)改善的突變株。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的編碼基因 GOD-A137S,具有SEQ IDNO.l所示的核苷酸序列以及所述的序列編碼的突變 酶，該突變酶具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。在黑曲霉GOD結(jié)構(gòu)基因 中通過over-lap PCR引入突變，連接于表達(dá)載體，生產(chǎn)高酶活GOD突變酶，該 突變酶的酶活是野生型的2倍，同時也具有良好的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的制備 方法，該方法是構(gòu)建酵母表達(dá)載體，利用陰離子交換層析方法純化高酶活葡萄 糖氧化酶突變株蛋白，該方法簡便，成本低廉。
本發(fā)明的再一個目的在于提供一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白，在食 品、醫(yī)藥上的應(yīng)用，即一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在酒中和茶葉保鮮 中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
本發(fā)明的一個目的是提供一種核苷酸序列，該序列編碼一種高酶活葡萄糖 氧化酶突變株蛋白，具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列，其特征是在于野生 型GOD結(jié)構(gòu)基因上具有960位由G突變?yōu)門的點突變。由以下步驟制備
1. 突變酶GOD-A137S突變點的引入
(1) 設(shè)計一對誘變引物，采用PCR定點突變法在GOD基因上把野生型 GOD基因上960位的G突變?yōu)門;
(2) 上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶S朋BI及Wort進(jìn)行 酶切，與經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，獲得大腸桿菌菌株DH5a/GOD-A137S;
2. 鑒定重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-A137SV:用酶切、PCR方法對重組質(zhì)粒進(jìn) 行鑒定，并測序檢驗，由此得到具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。
本發(fā)明所述的編碼高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的基因GOD- A137S，
具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列，有以下特征
1. 本發(fā)明所用的GOD野生型基因來自黑曲霉，長度為2303bp，其中結(jié)構(gòu) 基因長度為1752bp。
2. 具有SEQIDN0.1所示的核苷酸序列，與野生型相比在此結(jié)構(gòu)基因上 具有一處點突變，即為960位的G突變?yōu)門。
本發(fā)明要求保護(hù)的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白可用如下方法生產(chǎn)。該 方法包括以下具體的操作按照常規(guī)實驗條件，如《分子克隆實驗手冊》(第三 版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學(xué)出版社中所述的條件進(jìn)行。
1. 突變酶GOD-A137S編碼基因中突變點的引入
(1) 設(shè)計兩條誘變引物，采用PCR定點突變法在GOD基因上把野生型 GOD基因上960位的G突變?yōu)門;
(2) 上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶S"flBI及7VM進(jìn)行 酶切，與經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，獲得大腸桿菌菌株DH5a/GOD-A137S;
2. 鑒定重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-A137SV:用酶切、PCR方法對重組質(zhì)粒進(jìn) 行鑒定，并測序檢驗，由此得到具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列；
3. 培養(yǎng)大腸桿菌菌株DH5a/GOD-A137S ， 提取重組質(zhì)粒 pPIC9kGOD-A137S;
4. 限制性內(nèi)切酶5g/n酶切，膠回收純化大片段，即得到酵母轉(zhuǎn)化所需含
突變基因的線性DNA;
5. 電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，經(jīng)篩選和鑒定獲得畢赤酵母菌株 GS115/GOD-A137S;
6. 將步驟5中所得菌株轉(zhuǎn)入1000mLMD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6o()=1.2-1.5; 離心收集酵母細(xì)胞，并將細(xì)胞用50mL MM培養(yǎng)基洗一次；將細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入 500mL MM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白生成，每天向培養(yǎng)物中補加1%甲醇，培養(yǎng)4-5 天；離心收取上清液；
7. 將500mL含有目標(biāo)蛋白的培養(yǎng)物上清液超濾濃縮至20-30mL，濃縮液 在0.02mol/L、 pH6.27的磷酸二氫鈉緩沖液中透析除鹽24小時。蛋白質(zhì)的純化 采用Q SepharoSeTM Fast Flow陰離子交換層析柱分離、純化，由此獲得具有
SEQUENCE N0.2氨基酸序列的蛋白，由此得到具有SEQ ID N0.2所示的氨基 酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白；
8.以新鮮的Sigma公司商品GOD作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用pH5.6、 O.lmol/L磷酸 二氫鈉緩沖液配制2mg/mL葡萄糖、O.lmg/mL的ABTS和100U/mL辣根過氧 化物酶溶液。在九十六孔板中分別加入lOOpL葡萄糖溶液、100pL的ABTS和 辣根過氧化物酶溶液40)LiL，加入lpL培養(yǎng)液或酶液，測定OD4M。
按照以上方法可以檢驗本發(fā)明要求保護(hù)的突變酶的活性。純度檢測可以用 SDS-PAGE方法檢測。
注以上提到的酵母培養(yǎng)基配方如下
MD (L—1):酵母基本氮源培養(yǎng)基(YNB) 1.7g，硫酸銨5g，葡萄糖20g， 生物素400ng;
MM (I/1): YNB1.7g，硫酸銨5g，甲醇12mL，生物素400嗎，酪蛋白 水解物10g,pH5.6。
本發(fā)明獲得高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在食品、醫(yī)藥及生物等相關(guān)領(lǐng) 域有著廣泛的應(yīng)用。
1. 在pH7.0的條件下，取上述所得葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶以及 ABTS混合與磷酸緩沖液中，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液或酒類樣品與之反應(yīng)，根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得酒類中葡萄糖含量。本發(fā)明所述的高酶活葡萄糖氧化酶突變株 蛋白的優(yōu)勢在于其酶活是野生型的2倍以上，可以有效減少酶制劑的使用量。
2. 葡萄糖氧化酶在茶葉保鮮中的應(yīng)用將葡萄糖氧化酶與其底物葡萄糖混 合在一起，包裝于不透水但透氣的薄膜袋中，密封后置于裝有茶葉的密閉容器內(nèi)， 當(dāng)密閉容器內(nèi)的氧氣透過薄膜進(jìn)入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用下，與葡萄糖發(fā) 生反應(yīng)，從而去除密閉容器內(nèi)的氧，防止茶葉被氧化而導(dǎo)致品質(zhì)劣變。
葡萄糖氧化酶是一種廣泛應(yīng)用的工具酶，在食品工業(yè)中主要用于除氧、去 葡萄糖；在醫(yī)藥行業(yè)中主要用于血糖、尿糖的測定；在生物領(lǐng)域中，還可以制 成相應(yīng)的生物傳感器和酶電極，用于檢測葡萄糖濃度。
所述酵母表達(dá)載體pPIC9k和畢赤酵母菌株GS115均購自invitrogen公司。 所述大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a購自TaKaRa公司，可以根據(jù)所用的表達(dá)載體 選擇匹配的宿主細(xì)胞。所述重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-A137S為本發(fā)明所構(gòu)建。所
述大腸桿菌菌株DH5ct/GOD-A137S是具有質(zhì)粒pPIC9kGOD-A137S的大腸桿菌 菌株，保藏編號CCTCCNOM207089，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，
地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2007年6月27日，分類命名大腸桿
菌DH5a/GOD-A137S。所述編碼基因GOD-A137S是具有SEQUENCENO.l的 核苷酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因。所述蛋白G0D-A137S 是具有SEQUENCE N0.2的氨基酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果
本發(fā)明中提供的GOD突變株的核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列是一種GOD高酶活 突變株的基因和蛋白質(zhì)序列，未見報道。本株GOD突變株酶活是野生型酶活的2 倍以上，同時也具有良好的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性，符合實際應(yīng)用的要求。而葡 萄糖氧化酶在食品、醫(yī)藥及生物等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，是生物傳感器領(lǐng)域最主 要的工具酶，因此，獲得高酶活的GOD，具有很高的實用價值，特別是在生物 傳感器的分析器件中，要在微小的面積上固定具有足夠催化活性的酶，酶活的高 低顯得尤為重要。
圖1重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖示意圖
(1) 用PCR方法擴增出GOD基因；
(2) 設(shè)計兩條誘變引物，采用PCR定點突變法在GOD基因上把野生型 GOD分子137位氨基酸由Ala突變?yōu)镾er;
(3) 上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶5VjflBI及油/I進(jìn)行 酶切，與經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，獲得大腸桿菌菌株DH5a/GOD-A137S;
圖2重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9kGOD-A137S的PCR鑒定(b)和酶切鑒定(a) 結(jié)果(1%瓊脂糖凝膠電泳)。
如圖2(b)所示，以上下游引物擴增出的條帶大小約為1800bp，與GOD 結(jié)構(gòu)基因大小一致。
大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒pPIC9k大小約9.3kb，含有兩個5gZ II酶切位點。
而GOD基因內(nèi)部則無5g/ II酶切位點。將質(zhì)粒pPIC9k-GOD用5g/ II酶切，電 泳結(jié)果如圖2 (a)中所示，5g/ II酶切pPIC9k-GOD得到2.4 kb和8.7kb兩個片 段，與推測值一致。以上結(jié)果證明高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因 GOD-D401N/A574V已克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9k。
圖3純化后的畢赤酵母菌株pPIC9kGOD-A137S誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生高酶活葡萄 糖氧化酶突變株蛋白(10 % SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測)
葡萄糖氧化酶分子量約為160kDa，單體分子量為80kDa，與結(jié)果相符。
圖4與野生型的熱穩(wěn)定性比較
在40°C中水浴保存50分鐘內(nèi)，野生型和GOD-A137S酶活都沒有明顯損失， 60分鐘時野生型酶活略有下降，而GOD-A137S的酶活沒有明顯下降，如圖4 (a)。在5(TC中水浴20分鐘后，突變株GOD-A137S酶活開始快速下降，1小 時后降至原來的50%左右，而野生型酶活則下降相對緩慢， 一小時后分別降至 原來的72%,如圖4 (b)。 60'C下10分鐘后，野生型和GOD-A137S酶活均大 幅下降， 一小時后，野生型降至原來的30%， GOD-A137S降至原有的20。/。左 右，如圖4(c)?？傮w而言，高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-A137S具有 良好的熱穩(wěn)定性，能夠滿足實際應(yīng)用的需要。 圖5與野生型的儲存穩(wěn)定性比較
在4。C下，野生型和GOD-A137S具有較好的儲存穩(wěn)定性，保存一個月后仍 保留80%以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天時野 生型有60%活力剩余，而GOD-A137S有80%活力剩余，如圖5 (a)。在室溫 (20-25°C)下長時間儲存時，野生型和GOD-A137S的酶活都呈現(xiàn)逐步下降趨 勢。在保存的前25天，GOD-A137S酶活的下降略高于野生型酶。但在儲存后 期，野生型酶活的下降更加明顯。在室溫下儲存一個月后，野生型和GOD-A137S 都可保留65%以上的剩余活力，40天后，兩者都有40%活力剩余，如圖5 (b)。 高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-A137S與野生型相比具有良好的儲存穩(wěn) 定性，能夠滿足實際應(yīng)用的需要。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實施例中的實驗方法，按
8
常規(guī)條件進(jìn)行，參考如薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南(第二版，1992年， 科學(xué)出版社)中所述實驗方法。
實施例l.高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的獲得-
圖1顯示了重組突變葡萄糖氧化酶基因的構(gòu)建原理和過程。天然的成熟的 葡萄糖氧化酶為同源二聚體，每個單體含583個氨基酸，基因長為1800bp左右。 1.突變酶GOD-A137S編碼基因中突變點的引入
1)設(shè)計兩條誘變引物，采用PCR定點突變法在GOD基因上把野生型GOD 基因上960位的G突變?yōu)門;
設(shè)計葡萄糖氧化酶定點突變所需引物序列 上游引物5，- CCACTACGTAAGCAATGGCATTGAAG陽3， 下游引物5，國TATGCGGCCGCTCACTGCAT -3'
定點突變引物
960a:5' —GAGTAGGCGG^CACATTGTC- 3' 960s:5' -GGGACAATGTGICCGCC -3'
用下游引物與引物960s以野生型葡萄糖氧化酶基因片段為模板，擴增出 137的長片段，PCR循環(huán)條件94°C 5min; 94°C lmin， 55°C lmin, 72°C lmin30sec， 30個循環(huán)；72。C6min30sec。 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳 試劑盒回收。
用上游引物與960a以野生型葡萄糖氧化酶基因片段為模板，擴增出137 的短片段，PCR循環(huán)條件94°C 5min; 94°C lmin， 55°C lmin， 72°C 30sec， 30個循環(huán)；72°C 5min。 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。
然后將回收的兩種PCR產(chǎn)物混合，加入上、下游引物進(jìn)行第二次PCR， PCR反應(yīng)條件為94°C 5min; 94。C lmin， 60。C lmin， 72。C 2min， 5個循環(huán)；94。C lmin， 54°C lmin， 72°C 2min， 30個循環(huán)；72°C 7min。 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1^瓊 脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點A137S的葡萄糖氧化酶基因片段。
(2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶S"flBI及A^I對所 得質(zhì)粒進(jìn)行酶切，與經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，獲得大腸桿菌菌株DH5a/GOD-A137S;用限制性內(nèi)切酶SwaBI及 A/ort進(jìn)行分步酶切，酶切產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收后，用T4連接酶與
經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接，16i:連接過夜后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素(Amp) —LB平板篩選得到陽性菌落，經(jīng)過 鑒定(見下一步驟)，命名為大腸桿菌菌株DH5a/GOD-A137S。
2. 質(zhì)粒pPIC9kGOD-A137S的鑒定
用質(zhì)粒抽提試劑盒從陽性菌落DH5a/GOD-A137S培養(yǎng)物中分別提取質(zhì)粒 pPIC9kGOD-A137S，用限制性內(nèi)切酶5g/II進(jìn)行酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢査， 結(jié)果產(chǎn)生2.4Kb和8.7Kb兩條帶，如圖2 (a)，與預(yù)期大小相符。進(jìn)一步用PCR 進(jìn)行鑒定，以重組質(zhì)粒為模板，用上、下游引物進(jìn)行PCR，可以得到大小為1.8kb 的擴增帶，如圖2 (b)，與預(yù)期大小相符。
質(zhì)粒上GOD-A137S基因的測序由英俊(iiwitrogen)生物技術(shù)有限公司進(jìn) 行。測序引物是利用pPIC9k質(zhì)粒上的通用引物5，AOXl和3，AOXl，測序結(jié)果 表明獲得的GOD-A137S基因序列與預(yù)期設(shè)計完全一致，由此得到具有SEQ ID NO.l所示序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因GOD-A137S。 GOD-A137S基因全長1752nt(包括終止密碼TGA)，編碼583個氨基酸的蛋白。 將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pPIC9kGOD-A137S。
3. 重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-A137S的提取
將DH5a/GOD-A137S接種到LB培養(yǎng)基，37'C過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提試劑 盒提取質(zhì)pPIC9kGOD-A137S。
4. 限制性內(nèi)切酶^g/n酶切，膠回收純化大片段，即得到酵母轉(zhuǎn)化所需含
突變基因的線性DNA。
5. 電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，經(jīng)篩選和鑒定獲得畢赤酵母菌株 GS115/GOD-A137S。
(1) GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備 將GS115接于50mL液體YPD培養(yǎng)基中30。C培養(yǎng)過夜，再以2: 100的比
例接種于500mlYPD中30。C培養(yǎng)至OD600=1.2-1.5 ， 4。C1500g離心收集細(xì)胞； 用500mL冰冷的無菌水重懸細(xì)胞，4'C1500g離心收集細(xì)胞；再用250mL冰冷 的無菌水重懸細(xì)胞，4'C1500g離心收集細(xì)胞；接著用40ml冰冷的lmol/L山梨 醇重懸細(xì)胞，4'C1500g離心收集細(xì)胞；重懸細(xì)胞于lmLlmol/L山梨醇。
(2) 重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-A137S轉(zhuǎn)化GS115:
lOOiiL感受態(tài)細(xì)胞與5-l(Hig線性化質(zhì)粒DNA (Sg/n切)混合，轉(zhuǎn)入冰冷 的電轉(zhuǎn)杯，放置5分鐘；電擊細(xì)胞與DNA的混合物(1.5kv， 4.2-4.9ms);加入 lmL冰冷的lmol/L山梨醇，繼續(xù)放置30min;再加入0.5mLSOS (0.3xYPD， lmol/L山梨醇)，30。C放置2小時，偶爾搖動志菌體不易沉淀；用lmol/L山梨 醇稀釋菌體后涂布于固體MD培養(yǎng)基。3(TC培養(yǎng)4-6天后挑取陽性菌落。經(jīng)過實 施例3鑒定，將能產(chǎn)生GOD-A137S蛋白的菌株命名為GS115/GOD-A137S。
6.畢赤酵母菌株GS115/GOD-A137S經(jīng)甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生GOD-A137S蛋白
從上述MD平板中挑取GS115/GOD-A137S單菌落于20mLMD培養(yǎng)基中培養(yǎng) 過夜；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入500mLMD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6o『1.2-1.5;離心收集酵母細(xì) 胞，并將細(xì)胞用20mLMM培養(yǎng)基洗一次；將細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入250mLMM培養(yǎng)基中 誘導(dǎo)蛋白生成，每天向培養(yǎng)物中補加1%甲醇，培養(yǎng)4-5天；離心收取上清液。 7.蛋白GOD-A137S的純化
將近500mL含有目標(biāo)蛋白的培養(yǎng)物上清液超濾濃縮至20-30mL,濃縮液 在0.02mol/L、 pH6.27的磷酸二氫鈉緩沖液中透析除鹽24小時，以保證陰離子 交換柱的吸附性質(zhì)。
蛋白質(zhì)的純化采用Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，柱子用 20mM磷酸二氫鈉(pH6.3)平衡，上樣后，用20mM磷酸二氫鈉，0 — 0.2M NaCl(pH6.3)梯度洗脫，用核酸蛋白質(zhì)檢測儀(波長280nm)監(jiān)視收集，葡萄糖 氧化酶最先直接從柱中流出(帶黃色)。由此得到分離純化的如SEQUENCE N0.2所示的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V。
實施例2畢赤酵母菌株GS115/GOD-A137S表達(dá)GOD-A137S蛋白的活性 檢測及其他酶學(xué)性質(zhì)檢測
以新鮮的Sigma公司商品GOD作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用pH5.6、 0.1mol/L磷酸二 氫鈉緩沖液配制2mg/mL葡萄糖、0.1mg/mL的ABTS和100U/mL辣根過氧化 物酶溶液。在九十六孔板中分別加入100nL葡萄糖溶液、100pL的ABTS和辣 根過氧化物酶溶液40pL，加入lpL培養(yǎng)液或酶液，反應(yīng)3-5分鐘后測定OD414。
用Bio-Rad公司生產(chǎn)的蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
計算酶比活
EnzymesSpecific activity(U/mg protein)
Wild type369.8±63.8
A137S1210.4±307.13
熱穩(wěn)定性分析-
催化活性提高的突變體有時會伴隨熱穩(wěn)定性的降低，將野生型和突變株酶
液分別置于4(TC、 50°C、 6(TC下，每隔十分鐘取樣測定剩余酶活，評價了酶的 熱穩(wěn)定性。結(jié)果見圖4。在40。C中水浴保存50分鐘內(nèi)，野生型和GOD-A137S 酶活都沒有明顯損失，60分鐘時野生型酶活略有下降，而GOD-A137S的酶活 沒有明顯下降，如圖4 (a)。在5(TC中水浴20分鐘后，突變株GOD-A137S酶 活開始快速下降，1小時后降至原來的50%左右，而野生型酶活則下降相對緩 慢， 一小時后分別降至原來的72%，如圖4 (b)。 60'C下10分鐘后，野生型和 GOD-A137S酶活均大幅下降， 一小時后，野生型降至原來的30%， GOD-A137S 降至原有的20%左右，如圖4 (c)?？傮w而言，高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋 白GOD-A137S具有良好的熱穩(wěn)定性，能夠滿足實際應(yīng)用的需要。 儲存穩(wěn)定性分析
將酶液保存在4"C和室溫下，定期取樣測定酶活，評價了酶的儲存穩(wěn)定性。 結(jié)果見圖五。在4"下，野生型和GOD-A137S具有較好的儲存穩(wěn)定性，保存一個 月后仍保留80%以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天時 野生型有60%活力剩余，而GOD-A137S有80Q/?；盍κＳ?，如圖5(a)。在室溫(20-25 °C)下長時間儲存時，野生型和GOD-A137S的酶活都呈現(xiàn)逐步下降趨勢。在保 存的前25天，GOD-A137S酶活的下降略高于野生型酶。但在儲存后期，野生型 酶活的下降更加明顯。在室溫下儲存一個月后，野生型和GOD-A137S都可保留 65%以上的剩余活力，40天后，兩者都有40%活力剩余，如圖5 (b)。高酶活葡 萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-A137S與野生型相比具有良好的儲存穩(wěn)定性，能夠 滿足實際應(yīng)用的需要。
GOD-A137S在酶活提高的同時，熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性并未有大的損失， 滿足實際應(yīng)用的要求。 實施例3葡萄糖氧化酶在酶法測定酒中葡萄糖含量中的應(yīng)用
在pH7.0的條件下，取上述所得葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶以及ABTS
混合與磷酸鈉緩沖液(0.1mol/L)中，其中葡萄糖氧化酶終濃度為10U/mL，辣
根過氧化物酶終濃度為10U/mL， ABTS終濃度為0.1mg/mL。
取上述混合液3mL，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液或酒類樣品0.5 mL與之37°C
水浴反應(yīng)10min，測定其在414nm處的吸收。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得酒類(白酒、
紅酒、啤酒)中葡萄糖含量。本法在含葡萄糖150 mg/L以內(nèi)，吸光度與樣品葡
萄糖含量具有良好的正相關(guān)性。故測定范圍在0-150 mg/L。
實施例4葡萄糖氧化酶在茶葉保鮮中的應(yīng)用
將葡萄糖氧化酶與其底物葡萄糖以摩爾比l: 100000的比例混合在一起，包 裝于不透水但透氣的薄膜袋中，密封后置于裝有茶葉的密閉容器內(nèi)，加入量為 6-8g混合物/L，當(dāng)密閉容器內(nèi)的氧氣透過薄膜進(jìn)入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用 下，與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，從而去除密閉容器內(nèi)的氧，防止茶葉被氧化而導(dǎo)致品質(zhì) 劣變，茶葉的保質(zhì)期延長至18-24個月。
葡萄糖氧化酶是一種廣泛應(yīng)用的工具酶，在食品工業(yè)中主要用于除氧、去 葡萄糖；在醫(yī)藥行業(yè)中主要用于血糖、尿糖的測定；在生物領(lǐng)域中，還可以制 成相應(yīng)的生物傳感器和酶電極，用于檢測葡萄糖濃度。
SEQUENCE LISTING
<110>中國科學(xué)院武漢病毒研究所
<120> —種葡萄糖氧化酶的編碼基因及制備方法和應(yīng)用
<130> —種葡萄糖氧化酶的編碼基因及制備方法和應(yīng)用
<160> 2
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 2303
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 1
g肌ttcggtattctcggcatggccet肌gtcggtatcccttggCgCC3Cg3tgatttgcgt60
cca.ggattcgtatagttcctcgtccacgagctgcctaccgtcagcgtgaggcagtgagct120
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ga犯tggtctcggtggctctactctagtgaatggtggcacctggactcgcccccacaagg900
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<400> 2
Ser Asn Gly lie Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser 15 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr lie lie Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn He Ser Val Leu Val
35 40 45
lie Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro lie lie Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp lie Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr 65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gin Thr Ala Leu lie Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr 100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gin Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ser Ala Tyr Ser Leu Gin Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gin lie Ala Ala Gly His Tyr Phe 145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro lie Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 l卯
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gin Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gin Arg Pro 225 230 235 240PiAi biv人id usv j3s 311usv 3jv biv nsi tqo叫丄y可v biv O外 SSfr OSt
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Gin Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr lie Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Tip Thr Glu Tyr lie Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gin Gly Leu
530 535 540
Arg Val lie Asp Gy Ser lie Pro Pro Thr Gin Met Ser Ser His Val 545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys lie Ser Asp Ala lie Leu
565 570 575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gin 580
權(quán)利要求
1.一種分離的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因，其序列為SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2. —種分離的蛋白，其序列為SEQIDNa2所示的氨基酸序列。
3. —種大腸桿菌，其特征在于大腸桿菌(Esc/zeWcWfl co/z')DH5a/GOD- A137S， CCTCC NO.M207089。
4. 一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在酒中的應(yīng)用。
5. —種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在茶葉保鮮中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葡萄糖氧化酶突變體編碼基因及制備方法和應(yīng)用。這種高活力葡萄糖氧化酶突變體的編碼基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其編碼的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步驟是首先設(shè)計一對誘變引物；第二是獲得大腸桿菌菌株DH5α/GOD-A137S；第三是鑒定重組質(zhì)粒pPIC9kGOD-A137S；第四是培養(yǎng)大腸桿菌菌株DH5α/GOD-A137S；第五是得到含突變基因的線性DNA；第六是獲得畢赤酵母菌株GS115/GOD-A137S；第七是誘導(dǎo)純化獲得目的蛋白。本發(fā)明方法易行，成本低廉，高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在食品糖類檢測和保鮮中的應(yīng)用，具有很高的實用價值。
文檔編號C12G3/02GK101348795SQ20071005278
公開日2009年1月21日 申請日期2007年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月19日
發(fā)明者丹 劉, 周亞鳳, 張先恩, 張治平, 郭永超 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所