專利名稱：一種鑒定基因抗鹽功能的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域中一種鑒定基因抗鹽功能的方法。
背景技術：
土壤鹽漬化是影響農業(yè)生產及生態(tài)環(huán)境的一個全球性問題，鹽堿是目前制約我國農業(yè)增產的兩大土壤因素之一。土壤中的含鹽量是影響植物生長的一個重要因子，土壤的鹽漬化嚴重阻礙的植物的生長發(fā)育，造成了農作物的減產。目前，全世界大約有20%的農業(yè)用地受到鹽堿化的威脅，預計到2050年，全世界會有超過50%的土地會變得鹽堿化。上世紀四十年代，各國科學家就開始了植物耐鹽性研究，特別是近年來，無論是耐鹽品種的篩選，還是品種耐鹽機理的研究都取得了很大進展。從目前來看，雖然許多抗性基因被克隆，并通過基因工程在一定程度上提高了轉基因植物的抗逆性，但進一步挖掘有潛力的抗逆基因資源仍然是艱巨的任務。這就要求人們把目光投向更廣泛的領域中。要研究一個基因的功能，除了轉基因技術以外，最直接有效的辦法就是抑制該基因的表達或構建功能性蛋白不能形成的突變體，然后觀察其表型的變化。目前已有的用于功能喪失(loss-of-function)研究的方法主要包括化學突變，轉座子或農桿菌T-DNA插入突變以及RNAi等。這些方法在擬南芥基因功能研究中非常有效，但在其它植物中尚未能大規(guī)模的應用。另外，對引起致死突變或在維持細胞基本功能或發(fā)育早期基因的功能進行傳統(tǒng)的T-DNA插入與轉座子突變體等正向遺傳學研究方法具有一定的困難，因為往往這些基因的突變?yōu)橹滤劳蛔?。RNAi技術需要轉基因操作，實驗周期長，載體構建涉及到反向重復結構，細菌操作時容易出錯。病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是近年來發(fā)展的一種快速簡單的植物基因功能研究方法。與其它導致基因功能缺失的研究方法如反義抑制、 基因突變等相比，病毒誘導的基因沉默具有研究周期短、不需要遺傳轉化、可在不同的遺傳背景下生效以及能在不同的物種間進行基因功能的快速比較等優(yōu)點，此種技術正在發(fā)展成為一種簡單、快速、有效、高通量的分析基因功能的方法。病毒誘導的基因沉默是借助一種病毒侵染植物后發(fā)生的轉錄后基因沉默現象，來引起在mRNA水平上發(fā)生特異性降解的技術。即如果在病毒載體中插入目標基因片段，侵染寄主植物后，植物會表現出目標基因功能喪失或表達水平下降的表型，從而可以確定基因功能。VIGS被應用最活躍的領域是植物抗病性相關基因的鑒定和分離。尤其是“基因對基因”抗性相關基因的功能分析方面，近幾年來已有較大量文獻，而且有逐年增加的趨勢。 這可能得益于多數基因對基因抗性有一個標志性防衛(wèi)反應-過敏性反應0 )。而且不同植物種類間R/Avr下游信號傳導途徑保守。將互補R/Avr基因對分別克隆入雙元表達質粒，轉化農桿菌后，導入植物葉片，或將表達Avr的農桿菌或病原細菌本身導入含互補R基因的植物，即可看到R/Avr特異性誘發(fā)的HR壞死。比較野生型和VIGS植株的HR壞死產生強度，即可明確被沉默基因在該R/Avr誘發(fā)的HR產生中的作用。根據該思路，大量基因在多個R/Avr互作包括Pto/AvrPto，Rx/PVX, Cf/Avr等誘導的HR和抗病性中的作用已得到鑒定。除此之外，VIGS還被用于其它抗病性和防衛(wèi)反應相關基因的鑒定。研究發(fā)現，SGTI 和HSP90不僅與多個R基因誘導的HR和抗性相關，而且在非寄主抗性中也起重要作用。另外，VIGS還被應用于抗蟲信號傳導途徑以及植物醇合成途徑，光合作用途徑，以及纖維素合成途徑的分析。目前，與生物逆境中的研究不同，VIGS在非生物逆境的研究方面應用的還很有限，目前還缺乏一種快速鑒定植物里鹽脅迫相關基因的方法。基因LeNHX2是與植物的抗鹽性相關的，呈正相關，過表達LeNHX2基因擬南芥的抗鹽性提高，而LeNHX2基因表達量下調的番茄對鹽更敏感(Rodriguez-Rosales， Μ. P. , Χ. Y. Jiang, et al. (2008). " Overexpression of the tomato K+/H+ antiporter LeNHX2confers salt tolerance by improving potassium compartmentalization. " New Phytologistl79(2) :366-377)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測植物中目標基因是否具有抗鹽功能的方法。本發(fā)明所提供檢測植物中目標基因是否具有抗鹽功能的方法，包括如下步驟利用病毒誘導的基因沉默方法將目的植物中目標基因的功能喪失，得到的植物記作基因沉默植物；對所述基因沉默植物進行鹽脅迫處理，檢測鹽脅迫處理后的基因沉默植物的與鹽脅迫有關的性狀，若所述鹽脅迫處理后的基因沉默植物表現出耐鹽性狀，則確定所述目標基因具有抗鹽功能。所述利用病毒誘導的基因沉默方法將目的植物中目標基因的功能喪失的方法包括如下步驟將目標基因的部分片段插入PTRV2載體的多克隆位點間，得到重組載體；將得到的重組載體與PTRVl載體共同導入所述目的植物中。所述目標基因的部分片段位于所述目標基因的開放讀碼框區(qū)域或5'和3'非編碼區(qū)域。所述對所述基因沉默植物進行鹽脅迫處理的方法為對所述基因沉默植物的離體葉盤進行鹽脅迫處理或對所述基因沉默植物的完整植株進行鹽脅迫處理。所述對所述基因沉默植物的離體葉盤進行鹽脅迫處理的方法包括如下步驟取所述基因沉默植物的葉盤，得到離體葉盤，將離體葉盤分別浸泡在IOOmM和200mMNaCl水溶液中處理3天。所述對所述基因沉默植物的完整植株進行鹽脅迫處理的方法包括如下步驟用含 200mM NaCl的溶液澆灌所述基因沉默植物的根系，處理20天。所述與鹽脅迫有關的性狀為如下1)-5)所示性狀中的至少一種1)所述離體葉盤中葉綠素含量；2)所述基因沉默植物的葉片萎蔫程度、根的長度和/或根的數量；3)所述基因沉默植物的株高；4)所述基因沉默植物的鮮重和/或干重；5)所述基因沉默植物的光合速率。所述鹽脅迫處理后的基因沉默植物表現出耐鹽性狀為如下1)-5)中所示的至少一種
1)所述基因沉默植物的離體葉盤中葉綠素含量顯著低于野生型對照；2)所述基因沉默植物與野生型對照相比，葉片顯著枯萎并下垂、根的長度顯著降低和/或根的數量顯著減少；3)所述基因沉默植物的株高顯著低于野生型對照；4)所述基因沉默植物的鮮重和/或干重顯著低于野生型對照；5)所述基因沉默植物的光合速率顯著低于野生型對照；所述野生型對照為野生型植物。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為番茄。本發(fā)明的另一個目的是提供病毒誘導的基因沉默方法在檢測植物中待功能鑒定基因是否與具有抗鹽功能中的應用。實驗證明，本發(fā)明方法鑒定結果準確，對于快速鑒定和挖掘抗鹽相關基因資源有
重要意義。


圖1為不同NaCl處理下番茄葉片中的LeNHX2基因的表達量的比較。圖2為沉默番茄植株、病毒空載體對照番茄植株以及野生型對照番茄植株體內 LeNHX2基因的表達量的比較。圖3為不同NaCl處理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空載體對照番茄植株(TRV2) 和野生型對照番茄植株(CK)離體葉片中葉綠素含量的比較。圖4為不同NaCl處理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空載體對照番茄植株(TRV2) 和野生型對照番茄植株(CK)地上部分的表型變化。圖5為不同NaCl處理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空載體對照番茄植株(TRV2) 和野生型對照番茄植株(CK)根系的表型變化。圖6為不同NaCl處理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空載體對照番茄植株(TRV2) 和野生型對照番茄植株(CK)株高的變化。圖7為不同NaCl處理下，沉默番茄植株(NHX2)、病毒空載體對照番茄植株(TRV2) 和野生型對照番茄植株(CK)光合速率的變化。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明所用番茄品種為麗春(購自中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所)，在光照培養(yǎng)室內培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)16小時，溫度20°C ；黑暗培養(yǎng)8小時，溫度18°C ；培養(yǎng)基質為草炭土 蛭石=1 1。實施例1、植物內源與抗鹽性相關的LeNHX2基因的沉默及其檢測一、鑒定LeNHX2基因表達量受NaCl調控取30天苗齡的番茄品種麗春，用200mMNaCl處理0、3、6、12、24、48小時，然后取不同時間NaCl處理的番茄品種麗春的上部成熟且完全展開的葉片，提取總RNA，反轉錄成 cDNA,用Actin作為內參，用LeNHX2的特異引物進行Real-timequantitative PCR分析，結果如圖1所示。從圖1可見，與不用NaCl處理的0小時比較，LeNHX2基因的表達在NaCl處理下上升，并且在6小時的時候達到最高。此結果說明LeNHX2基因參與了植物響應鹽脅迫的反應。二、用病毒誘導的基因沉默(VIGS)方法鑒定LeNHX2基因的功能1、構建重組載體根據NCBI 上已公布的基因序列(LePDS-GI :387886 和 LeNHX2_GI :15982205)，設計LePDS基因的特異性引物上游引物5‘TAGAGAATTCGGCACTCAACTTTATAAACC 3'，加了 EcoR I 酶切位點，下游引物5'GAATGGATCCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC 3‘，加了 BamH I 酶切位點；同時設計LeNHX2基因的特異性引物上游引物5‘ GATGAATTCTACTACTCAAGGTGGAGACGA 3'，加了 EcoR I 酶切位點，下游引物5‘GATGGATCCCCTAATCCTGGCTTTGAACAT 3'，加了 BamH I 酶切位點。以番茄cDNA為模板，采用RT-PCR擴增分別獲取LePDS基因和LeNHX2基因片段。用 EcoR I禾口 BamH I酶切LeNHX2基因片段，同時用EcoR I禾口 BamH I雙酶切pTRV2載體(公眾可從中國科學院植物研究所獲得，記載過PTRV2載體的非專利文獻是Liu，Y. L.，Μ. Schiff, et al. (2002). “ Tobacco Rarl, EDSl and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus. " Plant Journal 30(4) :415-429), 回收大約101Λ的片段，將該回收片段與回收的LeNHX2基因片段連接，得到目的質粒。將目的質粒轉入大腸桿菌中，抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在PTRV2載體的EcoR I和BamHI酶切位點間插入了 LeNHX2基因片段，證明質粒構建正確，將構建重組載體命名為pTVR2_LeNHX2 ；用EcoR I和 BamH I酶切LePDS基因片段，同時用EcoR I和BamHI雙酶切pTRV2載體，回收大約IOkb 的片段，將該回收片段與回收的LePDS基因片段連接，得到目的質粒。將目的質粒轉入大腸桿菌中，抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在PTRV2載體的EcoR I和BamH I酶切位點間插入了 LePDS基因片段， 證明質粒構建正確，將構建重組載體命名為pTVR2-LePDS ；分別將重組載體pTVR2_LeNHX2、 重組載體pTVR2-LePDS、載體pTRV2和pTRVl載體(pTRVl載體為pTRV2載體及其衍生載體的輔助載體，公眾可從中國科學院植物研究所獲得，記載過載體PTRVl的非專利文獻是 Liu, Y. L.，M. Schiff, et al. (2002). “ Tobacco Rarl, EDSl and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus. " Plant Journal 30(4) :415-429)用熱激法轉化農桿菌GV3101感受態(tài)(購自北京天根生化科技有限公司)， 得到含有pTVR2-LePDS的重組農桿菌、含有pTVR2_LeNHX2的重組農桿菌、含有pTRV2的重組農桿菌以及含有PTRVl的重組農桿菌。2、農桿菌接種液的準備挑取新鮮培養(yǎng)的pTVR2-LeNHX2、pTVR2_LePDS和pTRV2農桿菌單菌落，分別接種 7ml含KanOOOug/ml)和Rif (50ug/ml)的LB培養(yǎng)基(1升LB培養(yǎng)基中酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，其余為水)，在沘°〇、170卬111培養(yǎng)16h至0D600為1.2-1.6。以1 100 的比例接入IOOml LB培養(yǎng)基(加入100mg/ml Kan IOOul，200mM乙酰丁香酮IOul，IM MES Iml)，當菌液0D600為0. 8 1. 2時，5000rpm離心10分鐘收集菌體細胞，以20_50ml體積的重懸液(IOmM MgC12+10mM MES+200 μ MAcetosyringone)重懸至 0D6002. 0 左右。室溫靜止6小時。分別得到pTVR2-LeNHX2農桿菌接種液、pTVR2_LePDS農桿菌接種液、pTRV2農桿菌接種液和PTRVl農桿菌接種液。3、基因沉默番茄植株的獲得將以上步驟2靜止6小時活化的pTRVl農桿菌接種液分別與pTVR2_LeNHX2農桿菌接種液、pTVR2-LePDS農桿菌接種液和pTRV2農桿菌接種液按體積比為1 1的比例混合，將得到的3種農桿菌混合液分別通過去針頭的IOml注射器侵染完全展開兩片子葉的番茄品種麗春幼苗，分別得到轉入pTVR2-LeNHX2的番茄苗，即沉默番茄苗(NHX2) ’轉入pTVR2-LePDS的番茄苗，即陽性對照番茄苗；和轉入pTRV2空載體的番茄苗，即病毒空載體對照番茄苗(TRM)，同時設野生型番茄苗(即未轉化的番茄苗)為野生型對照番茄苗 (CK)。4、觀察基因沉默現象并進行分子檢測分別將上述步驟3得到的沉默番茄苗(NHX2)、陽性對照番茄苗和病毒空載體對照番茄苗(TRW)放置在光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)室光照培養(yǎng)16小時，溫度20°C ；黑暗培養(yǎng)8小時，溫度18°C ；培養(yǎng)番茄的基質為草炭土 蛭石=1 1。利用沉默時產生白化現象而易觀察的LePDS基因作為陽性對照，觀察陽性對照番茄植株葉片白化現象，當其葉片開始出現白化后，分別提取沉默番茄植株、病毒空載體對照番茄植株以及野生型對照番茄植株上部新長出葉片的總RNA，用Actin作為內參， Real-time quantitative PCR檢測沉默番茄植株、病毒空載體對照植株以及野生型對照番茄植株體內LeNHX2基因的表達量下調情況，結果如圖2所示。從圖2的結果可以看出，沉默番茄植株(圖2中ΝΗΧ2-1、ΝΗΧ2-2、ΝΗΧ2-3分別為三株沉默番茄植株)獲得的沉默效果明顯，LeNHX2的轉錄水平下降到了野生型對照番茄植株(CK)的50% -80%之間；病毒空載體對照番茄植株(TRM)的LeNHX2沒有明顯的下降，與野生型對照番茄植株(CK)維持在一個水平。此結果表明，重組載體pTVR2-LeNHX2的導入可以有效誘導植物內源LeNHX2基因的沉默。4、離體葉片水平上檢測沉默植株抗鹽性變化葉綠素是光合作用的主要色素和輔助色素，葉綠素含量對逆境脅迫非常敏感，因此常作為植物抗鹽性變化的指標。為了研究VIGS引起的基因沉默在離體葉片水平上的能否引起植物鹽敏感性變化，取沉默番茄植株(NHX2)、病毒空載體對照番茄植株(TRV2)以及野生型對照番茄植株(CK)上部完全展開的葉片，打孔器截取直徑為0.8cm的圓型葉盤，分別浸泡在IOml IOOmM和200mM的NaCl水溶液和蒸餾水(即OmM的NaCl處理，作為對照處理)中，在連續(xù)光照條件下處理3天。培養(yǎng)條件為20°C，16小時；18°C，8小時，光強控制在 130 μ mol. πΓ2· 左右。處理后的葉片在95 %的乙醇暗中浸提48h，以95 %乙醇為對照，在分光光度計 (UV-2102PC,UNICOjUSA)上測定 A649 和 A665，葉綠素含量=6. 63XA665+18. 08XA649。測定結果見圖3，從圖3可見，在沒有NaCl脅迫時沉默番茄植株(NHX2)、病毒空載體對照番茄植株(TRM)和野生型對照番茄植株(CK)都有較高的葉綠素含量；對其離體葉盤進行不同濃度(IOOmM和200mM)的NaCl處理后不同處理組的葉綠素含量均有明顯下降，但沉默番茄植株中葉綠素含量下降的幅度更大，且200mM NaCl處理的時候與病毒空載體對照番茄植株和野生型對照番茄植株均發(fā)生了顯著差異。也就是說，VIGS引起的LeNHX2基因沉默降低了植物對鹽脅迫的耐受力。此結果表明，離體葉片處理可以用于VIGS方法鑒定與抗鹽相關的基因功能中。5、整株水平上檢測沉默植株抗鹽性變化為了研究整株水平上抗鹽性的變化，將沉默番茄植株、病毒空載體對照番茄植株和野生型對照番茄植株分別進行鹽脅迫處理，具體為用含有200mM NaCl的溶液澆灌以上三種植株的根系，處理20天。同時用含有OmM NaCl的溶液澆灌以上三種植株的根系，處理 20天，作為對照處理。含有200mM NaCl的溶液和含有OmM NaCl的溶液分別為含有200mM NaCl 的 l/2Hoagland 溶液和含有 OmM NaCl 的 l/2Hoagland 溶液。l/2Hoagland 溶液的配方如下表1 :表ll/2Hoagland溶液的配方
權利要求
1.檢測植物中目標基因是否具有抗鹽功能的方法，包括如下步驟利用病毒誘導的基因沉默方法將目的植物中目標基因的功能喪失，得到的植物記作基因沉默植物；對所述基因沉默植物進行鹽脅迫處理，檢測鹽脅迫處理后的基因沉默植物的與鹽脅迫有關的性狀，若所述鹽脅迫處理后的基因沉默植物表現出耐鹽性狀，則確定所述目標基因具有抗鹽功能。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述利用病毒誘導的基因沉默方法將目的植物中目標基因的功能喪失的方法包括如下步驟將目標基因的部分片段插入PTRV2載體的多克隆位點間，得到重組載體；將得到的重組載體與PTRVl載體共同導入所述目的植物中。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目標基因的部分片段位于所述目標基因的開放讀碼框區(qū)域或5'和3'非編碼區(qū)域。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述對所述基因沉默植物進行鹽脅迫處理的方法為對所述基因沉默植物的離體葉盤進行鹽脅迫處理或對所述基因沉默植物的完整植株進行鹽脅迫處理。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述對所述基因沉默植物的離體葉盤進行鹽脅迫處理的方法包括如下步驟取所述基因沉默植物的葉盤，得到離體葉盤， 將離體葉盤分別浸泡在IOOmM和200mM NaCl水溶液中處理3天。
6.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述對所述基因沉默植物的完整植株進行鹽脅迫處理的方法包括如下步驟用含有200mM NaCl的溶液澆灌所述基因沉默植物的根系，處理20天。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述與鹽脅迫有關的性狀為如下1)-5)所示性狀中的至少一種1)所述離體葉盤中葉綠素含量；2)所述基因沉默植物的葉片萎蔫程度、根的長度和/或根的數量；3)所述基因沉默植物的株高；4)所述基因沉默植物的鮮重和/或干重；5)所述基因沉默植物的光合速率。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述鹽脅迫處理后的基因沉默植物表現出耐鹽性狀為如下1)-5)中所示的至少一種1)所述基因沉默植物的離體葉盤中葉綠素含量顯著低于野生型對照；2)所述基因沉默植物與野生型對照相比，葉片顯著枯萎并下垂、根的長度顯著降低和 /或根的數量顯著減少；3)所述基因沉默植物的株高顯著低于野生型對照；4)所述基因沉默植物的鮮重和/或干重顯著低于野生型對照；5)所述基因沉默植物的光合速率顯著低于野生型對照；所述野生型對照為野生型植物。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為番茄。
10.病毒誘導的基因沉默方法在檢測植物中待功能鑒定基因是否與具有抗鹽功能中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定基因抗鹽功能的方法。本發(fā)明所提供檢測植物中目標基因是否具有抗鹽功能的方法，包括如下步驟利用病毒誘導的基因沉默方法將目的植物中目標基因的功能喪失，得到的植物記作基因沉默植物；對所述基因沉默植物進行鹽脅迫處理，檢測鹽脅迫處理后的基因沉默植物的與鹽脅迫有關的性狀，若所述鹽脅迫處理后的基因沉默植物表現出耐鹽性狀，則確定所述目標基因具有抗鹽功能。實驗證明，本發(fā)明方法鑒定結果準確，對于快速鑒定和挖掘抗鹽相關基因資源有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102154362SQ201010597870
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權日2010年12月21日
發(fā)明者李銀心, 賀希格都楞, 陳顯揚 申請人:中國科學院植物研究所