本發(fā)明涉及抗氧化活性的異黃酮類化合物，具體涉及一種從葛根中首次提取得到的具有抗氧化活性的異黃酮類化合物。同時(shí)，本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法、其作煙草料液添加劑的應(yīng)用，屬于天然產(chǎn)物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

葛根為豆科植物野葛的干燥根，習(xí)稱野葛。秋、冬二季采挖，趁鮮切成厚片或小塊；干燥。甘、辛，涼。有解肌退熱，透疹，生津止渴，升陽(yáng)止瀉之功。常用于表證發(fā)熱，項(xiàng)背強(qiáng)痛，麻疹不透，熱病口渴，陰虛消渴，熱瀉熱痢，脾虛泄瀉。同時(shí)葛根也是一種重要的保健食品，其藥用價(jià)值極高，素有“亞洲人參”之美譽(yù)，葛粉稱之為“長(zhǎng)壽粉”，在日本被譽(yù)為“皇室特供食品”。

抗氧化劑是指能防止或延緩食品氧化性和延長(zhǎng)貯存期的食品添加劑。隨著食品安全性與保健功能日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，食品原料乃至食品添加劑的選擇趨向天然、健康、具有生物活性的材料，天然植物成為了食品抗氧化劑的重要來(lái)源，用于抗氧化劑開(kāi)發(fā)的天然物質(zhì)資源非常廣泛，具有抗氧化性質(zhì)天然物質(zhì)結(jié)構(gòu)類型主要有：黃酮、單寧、維生素類、蒽醌、含氮化合物、植酸、幽醇、苯丙素、香豆素、枯類、烯酸等。本發(fā)明從葛根中分離得到了一種異黃酮化合物，活性研究表明該化合物具有較好的抗氧化活性。該化合物安全、無(wú)毒，抗氧化活性顯著，該化合物至今尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于這樣的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供一種具有顯著抗氧化活性的異黃酮類化合物，還涉及其制備方法，并涉及該異黃酮類化合物在煙草料液添加劑中的應(yīng)用，具體方案如下：

本發(fā)明從葛根提取的異黃酮類化合物，其分子式為c17h14o6，結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)所示：

該化合物為淺黃色膠狀物，命名為：4',8-二羥基-7-羥甲基-6-甲氧基-異黃酮，英文名為：4',8-dihydroxy-7-hydroxymethyl-6-methoxy-isoflavone。

本發(fā)明涉及的上述異黃酮類化合物的方法，是以葛根塊為原料，經(jīng)浸膏提取、硅膠柱層析、高效液相色譜制備分離步驟，包括以下步驟：

a、浸膏提取：以葛根塊為原料，將葛根粉碎到20～40目，用有機(jī)溶劑超聲提取2～5次，每次30～60分鐘，溶劑的重量為葛根重的3～5倍，合并提取液、過(guò)濾，濾液減壓濃縮至剛觀察到有沉淀析出，靜置3～5h，濾除沉淀物，濃縮成可流動(dòng)的粘稠狀浸膏；

b、硅膠柱層析：浸膏上硅膠柱層析，裝柱硅膠為160～200目，硅膠重量為浸膏重量6～10倍量；以體積配比依次為1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿和丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集各梯度的梯度洗脫液并濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測(cè)，合并相同的部分；每個(gè)梯度洗脫到tlc點(diǎn)板無(wú)點(diǎn)后，更換下一梯度洗脫；

c、高效液相色譜分離：將體積配比為1:1的氯仿-丙酮洗脫得到的洗脫液，經(jīng)高效液相色譜分離純化，即得所述的異黃酮類化合物。

進(jìn)一步地，所述a步驟的有機(jī)溶劑為體積濃度為70～100％的丙酮、90～100％的乙醇或90～100％的甲醇。

進(jìn)一步地，所述b步驟中浸膏在經(jīng)硅膠柱層析前，用重量比1.5～3倍量的丙酮或者甲醇溶解，然后用浸膏重0.8～1.2倍的80～100目硅膠拌樣。

進(jìn)一步地，所述c步驟的高效液相色譜分離純化是以體積濃度為35％的甲醇為流動(dòng)相，流速15～25ml/min，以21.2×250mm，5μm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為332nm，每次進(jìn)樣10～100μl，收集41.2min的色譜峰，多次累加后蒸干。

本發(fā)明涉及的上述異黃酮類化合物作為抗氧化劑方面的用途。

本發(fā)明涉及的上述異黃酮類化合物作為煙草料液添加劑的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果如下：

本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，從天然植物中提取獲人工合成工藝容易實(shí)現(xiàn)，具有很好的延長(zhǎng)煙草料液保質(zhì)其的效果。化合物來(lái)至傳統(tǒng)藥食來(lái)源植物葛根，毒理學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明化合物安全無(wú)毒。卷煙感官評(píng)吸結(jié)果也表明添加該化合物不影響卷煙抽吸品質(zhì)，是理想的煙草料液抗氧化劑。作煙草料液添加劑，能有效防止煙草料液的酸敗，延長(zhǎng)其保質(zhì)期。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明異黃酮類化合物的核磁共振碳譜(¹³cnmr)；

圖2為本發(fā)明異黃酮類化合物的核磁共振氫譜(¹hnmr)；

圖3本發(fā)明異黃酮類化合物的關(guān)鍵hmbc相關(guān)圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明所述的葛根來(lái)源不受地區(qū)和品種限制，均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

本發(fā)明中的其它溶液如果只給出了溶質(zhì)，沒(méi)有公開(kāi)溶劑可認(rèn)為是水。

實(shí)施例1-化合物制備

取干燥的葛根塊2.6kg，粗粉碎至30目，每次用體積濃度為70％的丙酮超聲提取4次，有機(jī)溶劑的重量為葛根重的3倍，每次60分鐘，合并提取液、過(guò)濾，濾液減壓濃縮至剛觀察到有沉淀析出，靜置3h，濾除沉淀物，濃縮成可流動(dòng)的粘稠狀浸膏62g。

浸膏在浸膏中加入120g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠62g拌樣，拌樣后，用200目硅膠400g裝柱；用體積比依次為1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測(cè)，合并相同的部分，得到6個(gè)部分a-f，其中，對(duì)收集到的樣品e(1:1)部分12g，再以體積濃度為35％的甲醇為流動(dòng)相，流速20ml/min，21.2×250mm，5μm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為332nm，每次進(jìn)樣50μl，收集41.2min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述異黃酮類化合物。

實(shí)施例2-化合物制備

取干燥的葛根塊2.8kg，粗粉碎至35目，每次用體積濃度為95％的乙醇超聲提取3次，有機(jī)溶劑的重量為葛根重的4倍，每次50分鐘，合并提取液、過(guò)濾，濾液減壓濃縮至剛觀察到有沉淀析出，靜置4h，濾除沉淀物，濃縮成可流動(dòng)的粘稠狀浸膏66g。

浸膏在浸膏中加入140g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠70g拌樣，拌樣后，用200目硅膠400g裝柱；用體積比依次為1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測(cè)，合并相同的部分，得到6個(gè)部分a-f，其中，對(duì)收集到的樣品e(1:1)部分12g，再以體積濃度為35％的甲醇為流動(dòng)相，流速20ml/min，21.2×250mm，5μm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為332nm，每次進(jìn)樣50μl，收集41.2min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述異黃酮類化合物。

實(shí)施例3-化合物制備

取干燥的葛根塊2.8kg，粗粉碎至35目，每次用體積濃度為95％的甲醇超聲提取5次，有機(jī)溶劑的重量為葛根重的5倍，每次50分鐘，合并提取液、過(guò)濾，濾液減壓濃縮至剛觀察到有沉淀析出，靜置4h，濾除沉淀物，濃縮成可流動(dòng)的粘稠狀浸膏60g。

浸膏在浸膏中加入140g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠70g拌樣，拌樣后，用200目硅膠400g裝柱；用體積比依次為1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測(cè)，合并相同的部分，得到6個(gè)部分a-f，其中，對(duì)收集到的樣品e(1:1)部分12g，再以體積濃度為35％的甲醇為流動(dòng)相，流速20ml/min，21.2×250mm，5μm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為332nm，每次進(jìn)樣50μl，收集41.2min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述異黃酮類化合物。

實(shí)施例4-化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

以上述方法制備得到的異黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定；本發(fā)明化合物為黃色膠狀物；hresi-ms顯示其準(zhǔn)分子離子峰為337.0688[m+na]⁺(計(jì)算值337.0696),結(jié)合¹hnmr和dept譜確定其分子式為c17h14o6，不飽和度為12。紅外光譜中顯示了羥基(3384cm^-1)、羰基(1642cm^-1)和芳環(huán)(1610、1552和1490cm^-1)的共振吸收峰。而紫外光譜在210、265和332nm有最大吸收也說(shuō)明了化合物中可能存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。化合物的¹h和¹³cnmr譜(表-1)顯示其含有17個(gè)碳和14個(gè)氫，包括1個(gè)異黃酮骨架(c-2～c-10和c-1′～c-6′，h-5、h-8、h-2′,6′和h-2′,6′)，一個(gè)甲氧基(δc56.0q，δh3.85s)、一個(gè)羥甲基(δc53.4q，δh4.43s)和兩個(gè)酚羥基(δh10.87s和11.11s)?；衔锏漠慄S酮骨架可進(jìn)一步由h-5和c-4、c-6、c-7、c-9、c-10，h-2和c-1′、c-3、c-4、c-9，以及h-2′,6′和c-3的hmbc相關(guān)得到確認(rèn)。進(jìn)一步分析其hmbc相關(guān)譜，根據(jù)甲氧基氫(δh3.85s)與c-6(δc153.4)的hmbc相關(guān)可推測(cè)甲氧基取代在異黃酮母核的c-6。羥甲基取代在c-7位可由h2-1″(δh4.43)與c-6(δc153.4)、c-7(δc128.6)和c-8(δc148.2)的hmbc相關(guān)得到確定。兩個(gè)酚羥基取代在c-4′和c-8位可由可由酚羥基氫(δh10.87)與c-7(128.6)、c-8(148.2)、和c-9(145.0)的hmbc相關(guān)，以及另一個(gè)酚羥基(δh11.11)與c-3′,5′(δc115.6)和c-4′(δc157.5)的hmbc相關(guān)確認(rèn)。苯環(huán)上典型的質(zhì)子信號(hào)h-5(δh6.60s)、h-2,6[δh7.79(d,j＝8.8)]和h-3,5[(δh6.83(d,j＝8.8)]也支持異黃酮母核上的上述取代基模式。至此，化合物的結(jié)構(gòu)得到確定，并命名為化合物命名為：4',8-二羥基-7-羥甲基-6-甲氧基-異黃酮。

化合物的紅外、紫外和質(zhì)譜數(shù)據(jù)：uv(甲醇)，λmax(logε)332(3.42)、265(3.69)、210、(4.43)nm；ir(溴化鉀壓片)：νmax3384、3062、2935、1642、1610、1552、1490、1435、1358、1247、1139、1053、954、838cm^-1；¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)(500和125mhz,(c5d5n)，見(jiàn)表-1；正離子模式esimsm/z337[m+na]⁺；正離子模式hresimsm/z337.0688[m+na]⁺(計(jì)算值c17h14nao6，337.0696)。

表-1.本發(fā)明化合物的¹hnmr和¹³cnmr數(shù)據(jù)(c5d5n)

實(shí)施例5-化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

取實(shí)施例2-3制備的化合物，為淺黃色膠狀物。測(cè)定與實(shí)施4相同，確認(rèn)實(shí)施2-3制備的化合物為所述異黃酮類化合物——4',8-二羥基-7-羥甲基-6-甲氧基-異黃酮。

實(shí)施例6-化合物抗氧化活性測(cè)試

對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)試，抗氧化活性以清除dpph自由基能力的大小表示；以50μg/ml的乙醇溶液為初篩濃度，測(cè)定其清除脂性自由基dpph的活性。取一塊costar96孔板，加入新鮮配制的dpph乙醇溶液(6.5×10⁵mol/l)190μl/孔，加入待測(cè)樣品(本發(fā)明化合物)l0μl/孔，空白孔加l0μl生理鹽水，充分混勻，用封板膜封板后室溫下避光靜置30分鐘，于uv2401分光光度計(jì)上測(cè)定儀上測(cè)定各孔吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)為517nm；樣品對(duì)脂性自由基dpph清除率按下式計(jì)算:

dpph清除率(％)＝(a空白-a樣品)/a空白×100％

a空白：空白對(duì)照組吸光度值；a樣品：加樣品組吸光度值。

樣品平行5次檢測(cè)，計(jì)算半數(shù)清除濃度ic50。測(cè)定結(jié)果表明，化合物的ic50值為3.86μg/l，優(yōu)于維生素-c(ic50值為4.62)，本發(fā)明化合物表現(xiàn)出良好的抗氧化活性活性。

實(shí)施例7-化合物應(yīng)用

化合物的延長(zhǎng)煙草凈油保質(zhì)期效果：實(shí)驗(yàn)用料液為云煙軟珍和軟玉溪品牌卷煙用糖料，把本發(fā)明化合物添加到煙草凈油中，添加量為煙草凈油質(zhì)量的0.01％，0.02％和0.05％，觀察其質(zhì)變情況。結(jié)果表明：對(duì)照煙草凈油的保質(zhì)期僅為1周(對(duì)照未添加本發(fā)明化合物)，添加0.01％，0.02％和0.05％的本發(fā)明化合物后，其保質(zhì)期可分別延長(zhǎng)到3個(gè)月、7個(gè)月和11個(gè)月，說(shuō)明本發(fā)明化合物具有很好的延緩煙草料液的酸敗，延長(zhǎng)其保質(zhì)期的功效。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。