本發(fā)明涉及k-卡拉膠寡糖領(lǐng)域，具體地說是一種具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖制備方法。

背景技術(shù)：

卡拉膠作為一種結(jié)構(gòu)獨特的天然海洋硫酸多糖，被稱為類肝素多糖，其生物活性已經(jīng)成為當前多糖研究領(lǐng)域中的一個熱點。近年來，卡拉膠在生理學(xué)和病理學(xué)研究中所顯出來的生物活性已相繼被人們發(fā)現(xiàn)。實驗研究顯示，卡拉膠具有抗血管新生、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血糖等生物學(xué)活性。但由于卡拉膠多糖分子量較大，溶解性和吸收性較差，結(jié)構(gòu)復(fù)雜等原因，限制了其應(yīng)用。而卡拉膠寡糖分子量較小，溶解性增強，結(jié)構(gòu)簡化，易于吸收，穩(wěn)定性和安全性都有所增加，多糖鏈經(jīng)過不同形式的斷裂后活性基團充分暴露，其活性較卡拉膠有顯著提高，同時寡糖還具有低毒性的特征，因此拓寬了卡拉膠的應(yīng)用范圍，目前卡拉膠寡糖活性的研究已日益受到關(guān)注。

卡拉膠寡糖是從紅藻細胞壁中提取得到的一種水溶性硫酸寡糖，主要存在于紅藻綱的角叉菜屬(chondrus)、杉藻屬(gigartina)、麒麟菜屬(eucheuma)和沙菜屬中。

卡拉膠寡糖的基本結(jié)構(gòu)是由β(1→3)-d-吡喃半乳糖(g)和α(1→4)-d-吡喃半乳糖(d)為基本骨架交替連接形成的硫酸線性寡糖。根據(jù)是否含有3，6-內(nèi)醚半乳糖以及半乳糖上的硫酸基團的含量和分子中半乳糖所連接的位置不同，卡拉膠寡糖可分為八種類型：k-卡拉膠寡糖、γ-卡拉膠寡糖、ι-卡拉膠寡糖、ω-卡拉膠寡糖、λ-卡拉膠寡糖、υ-卡拉膠寡糖、ψ-卡拉膠寡糖、ξ-卡拉膠寡糖。常用的卡拉膠寡糖主要有k-、ι-、λ-型。

目前卡拉膠寡糖的制備主要有化學(xué)降解、物理降解和酶降解三種方法?；瘜W(xué)和物理降解方法存在反應(yīng)條件不易控制、降解產(chǎn)物不均一等缺點，在工業(yè)生產(chǎn)中受到限制，而酶降解法可以最大程度地保護反應(yīng)底物的活性基團不會在降解過程中受到破壞，降解產(chǎn)物均一，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物活性較高。在酶解制備卡拉膠寡糖方法有報道，但是未見具有抗氧化活性的酶解k-卡拉膠寡糖的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問題是提供一種具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖制備方法，包括以下步驟：(a)k-卡拉膠酶的制備

將cellulophagalyticastrainn5-2菌種接種于活化培養(yǎng)基中，于20-30℃、150-250rpm/min搖床中培養(yǎng)15-20h，進行培養(yǎng)活化，得到種子液；

按2-4％的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于20-30℃、150-250rpm/min搖床中培養(yǎng)15-20h，得到發(fā)酵液；

將發(fā)酵液在4℃條件下，于4000-5000r/min冷凍離心20min，離心后取上清液，得到粗酶液；

(b)k-卡拉膠寡糖的制備

k-卡拉膠的溶解：用0.1mol/l的na2hpo4·12h2o將k-卡拉膠配置為濃度為1％的溶液，在40℃加熱攪拌使之完全溶解，

k-卡拉膠的酶解：將粗酶液與溶解的k-卡拉膠溶液按照1:7～10的體積比混合，于40℃水浴加熱攪拌5-10min，

酶解液滅活：將酶解后的液體于100℃滅活15min，

酶解液離心：將酶解滅活的產(chǎn)物于8000r/min，高速離心10min；

酶解液凍干：酶解液離心物真空冷凍干燥，得到k-卡拉膠寡糖粉末。

進一步的，本發(fā)明還包括上述具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖的清除羥自由基能力的測定，其包括以下步驟：

取1.0ml濃度為1.865mmol/l鄰二氮菲的無水乙醇溶液于帶塞試管中，分別加入濃度為0.2m的ph7.4磷酸鹽緩沖液2ml和1ml不同濃度系列的k-卡拉膠寡糖混合，濃度系列為1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml，充分混合后加入1.0ml濃度為1.865mmol/l的feso4·7h2o溶液，再次混勻后加入1.0ml0.03％(v/v)的h2o2，于37℃恒溫水浴，保持60min；

最后，在536nm下分別測量各組混合溶液的吸光度值as，以蒸餾水代替樣品作為空白組測吸光度值ab，以蒸餾水替代h2o2作為損傷組，測吸光度an，以抗壞血酸代替樣品作為陽性對照，抗氧化劑的羥自由基清除率按以下公式計算：

羥自由基清除率(％)＝[(as-an)/(ab-an)]×100。

進一步的，本發(fā)明還包括上述具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖的清除超氧陰離子能力的測定，包含以下步驟：

在96孔板孔中依次加入黃嘌呤與nbt的混合液、100μl的0.049units/ml黃嘌呤氧化酶、50μl不同濃度系列的k-卡拉膠寡糖溶液，混勻；

混勻后于37℃孵育30min，酶標儀測od560值，不加樣品溶液作為空白對照，維生素c為陽性對照，每個濃度的樣品平行測定三次，分別計算清除率；

樣品清除率＝(od空白-od樣品)/od空白×100％。

進一步的，上述中的黃嘌呤與nbt的混合液是將50μl黃嘌呤0.4mmol/l和50μlnbt0.24mmol/l溶于0.01mol/lph＝8.0的pbs中，定容至150ml；不同濃度系列的k-卡拉膠寡糖分別為1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml。

本發(fā)明制備方法比現(xiàn)有的制備方法更簡單、快捷。本發(fā)明采用酶法降解，使得制備過程簡單快捷、產(chǎn)物的率高、質(zhì)量穩(wěn)定，并且該產(chǎn)品具有抗氧化活性，具有開發(fā)具有抗氧化功能的保健食品的前景。

附圖說明

圖1為k-卡拉膠寡糖hplc檢測圖；

圖2為k-卡拉膠四糖esi-ms檢測圖；

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。

一種具有抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖的制備方法具體包括：

一、k-卡拉膠酶的制備

1、將篩選的cellulophagalyticastrainn5-2菌種先接種于活化培養(yǎng)基中，于20-30℃、150-250rpm/min搖床培養(yǎng)15-20h，進行培養(yǎng)活化，得到種子液。

2、按2-4％的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，20-30℃、150-250rpm/min搖床培養(yǎng)15-20h。

3、將發(fā)酵液在4℃條件下，4000-5000r/min冷凍離心20min，離心后取上清液，即為粗酶液。

二、k-卡拉膠寡糖的制備

1、k-卡拉膠的溶解：用0.1mol/l的na2hpo4·12h2o將k-卡拉膠配置為濃度為1％的溶液，40℃加熱攪拌使之完全溶解。

2、k-卡拉膠的酶解，將制備好的粗酶液與步驟1溶解的k-卡拉膠溶液按照1:7-10的體積比混合，40℃水浴加熱攪拌5-10min即可。

3、酶解液滅活，將酶解后的液體100℃滅活15min；

4、酶解液離心，酶解的產(chǎn)物8000r/min，高速離心10min；

5、酶解液凍干，酶解液真空冷凍干燥后的k-卡拉膠寡糖粉末。

三、k-卡拉膠寡糖的檢測分析

1、高效液相色譜(hplc)分析

檢測儀器：美國戴安dionexultimate3000液相色譜儀，色譜條件：色譜柱kromasilc18(4.6mm×150mm，5μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液/乙腈(83:17，v/v)；檢測器：二極管陣列紫外檢測器(dad)。

表1k-卡拉膠寡糖hplc檢測結(jié)果

由上表1及圖1所示，k-卡拉膠寡糖主要含有k-卡拉膠二糖、四糖、六糖、八糖。根據(jù)高效液相色譜對降解后得到的k-卡拉膠寡糖的分析，其主要含有k-卡拉膠二糖、四糖、六糖、八糖，恰恰正是這種比例的各糖分布，使得其能夠有效的促進機體的抗氧化功能，清除自由基對機體的損傷。

2、將k-卡拉膠寡糖用凝膠柱分離純化后得到k-卡拉膠四糖，進行電噴霧質(zhì)譜(esi-ms)分析。結(jié)果如圖2所示，本申請中的k-卡拉膠酶屬于16族糖苷水解酶，為專一性內(nèi)切酶，專門水解α-3,6-內(nèi)醚-d-半乳糖和β-4-硫酸-d-半乳糖之間的β-1,4-糖苷鍵。k-卡拉膠酶專一性高、活性大，得到的產(chǎn)物分子量分布窄，對降解底物的硫酸根沒有破壞。

四、k-卡拉膠寡糖的抗氧化活性的檢測

1、k-卡拉膠寡糖清除羥自由基能力的測定

試劑：1.865mmol/l鄰二氮菲、無水乙醇溶液、0.2m的ph7.4磷酸鹽緩沖液、1.865mmol/l的feso4·7h2o溶液、0.03％(v/v)的h2o2、1mg/ml抗壞血酸

測定方法：

取1.0ml濃度為1.865mmol/l鄰二氮菲的無水乙醇溶液于帶塞試管中，分別加入濃度為0.2m的ph7.4磷酸鹽緩沖液2ml和1ml不同濃度的k-卡拉膠寡糖(濃度分別為1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml)，充分混勻后加入1.0ml濃度為1.865mmol/l的feso4·7h2o溶液，再次混勻后加入1.0ml0.03％(v/v)的h2o2，于37℃恒溫水浴，60min后，在536nm下分別測量各組混合溶液的吸光度值得as，以蒸餾水代替樣品作為空白組測吸光度值得ab，以蒸餾水替代h2o2作為損傷組，測其吸光度值an，以抗壞血酸代替樣品作為陽性對照，抗氧化劑的羥自由基清除率按以下公式計算：

羥自由基清除率(％)＝[(as-an)/(ab-an)]×100。

表2k-卡拉膠寡糖對羥基自由基清除率

由表2可見，隨著k-卡拉膠寡糖濃度逐漸增加，其清除羥自由基的能力逐漸增加，當k-卡拉膠寡糖濃度為8mg/ml時，其清除羥自由基的能力最大，達到陽性對照vc的28倍。

五、k-卡拉膠寡糖清除超氧陰離子能力的測定

試劑

xanthine(黃嘌呤):0.4mmol/l、xanthineoxidase(黃嘌呤氧化酶)貯液:1unit/ml、0.05unit/ml、nbt:(nitrobluetetrazoliumchloride氯化硝基四氮唑藍),0.24mmol、pbs(0.01mol/l,ph＝8.0)、pbs(0.01mol/l,ph＝7.4)、ascorbicacid:1mg/ml、hcl：1mol/l、naoh：1mol/l。

測定方法：

在96孔板孔中依次加入100μl黃嘌呤(0.4mmol/l)和nbt(0.24mmol/l)的混合液(每種各50μl，溶于0.01mol/l的pbs，ph＝8.0)，100μl黃嘌呤氧化酶(0.049units/ml),50μl不同濃度的k-卡拉膠寡糖溶液(濃度分別為1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml)?；靹蚝?7℃孵育30min,酶標儀測od560值(扣除od800值)。不加樣品溶液作為空白對照，vc(維生素c)為陽性對照，每個濃度的樣品平行測定三次，分別計算清除率及樣品的ic50。

樣品清除率＝(od空白-od樣品)/od空白×100％.

表3k-卡拉膠寡糖對超氧陰離子清除率

由表3可見，隨著k-卡拉膠寡糖濃度逐漸增加，其清除超氧陰離子的能力逐漸增加，當k-卡拉膠寡糖濃度為8mg/ml時，其清除超氧陰離子的能力最大，達到陽性對照vc的21倍。

通過對抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖的測定，確定了抗氧化活性的k-卡拉膠寡糖在對超氧陰離子清除率、清楚超氧陰離子能力具有很好的效果，且本發(fā)明制備簡單、科學(xué)合理，具有較好的經(jīng)濟前景。

以上所述的本發(fā)明實施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍之內(nèi)。