本發(fā)明涉及一種化合物及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種具有抗腫瘤作用性的化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)前臨床上癌癥的治療往往出現(xiàn)“癌死人亡”的悲劇，尤其是肝癌、結(jié)腸癌等多類惡性癌變目前尚未特效藥物，究其原因是目前化療是癌癥的主要方式之一，一線化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時往往對正常機體造成嚴(yán)重的毒副作用，例如：腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性等等。對于獲得高效、低毒、選擇性強的抗癌藥物是藥學(xué)工作者孜孜以求的目標(biāo)，可喜的是國內(nèi)外最新研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒選擇性強的化合物具有良好的成藥性，符合當(dāng)代精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展趨勢(cancercell,2015,28,240–252；int.j.mol.sci.2015,16(7),16401-16413)。
本發(fā)明以具有抗腫瘤、抗肝病生物活性的白樺脂酸(ba)及天然藥物川芎嗪(tmp)為起始原料，進(jìn)行化學(xué)拼合合成本發(fā)明化合物。對該類化合物的活性評價主要圍繞抗腫瘤(尤其肝癌、腸癌等)方面展開，分別測試了類似物對5種癌癥細(xì)胞系(hepg-2、ht-29、hela、bgc-823、a549)及非癌細(xì)胞系(人肝正常細(xì)胞l02)的細(xì)胞毒活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個目的在于提供具有式1結(jié)構(gòu)的化合物及其制備方法。
本發(fā)明的第二個目的在于提供式1化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種具有抗腫瘤作用的藥物組合物。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
具有式1結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，
進(jìn)一步，所述化合物可加入制劑領(lǐng)域常規(guī)輔料制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、口服液、注射劑等常規(guī)劑型。
本發(fā)明所述化合物的制備方法包括如下步驟：
步驟1，將白樺脂酸溶解于有機溶劑中，與2-氯代甲基-3,5,6-三甲基吡嗪在堿性條件下生成中間體化合物川芎嗪-白樺脂酸酯(中間體化合物tba)；
步驟2，中間體化合物tba在催化劑的作用下與肌氨酸發(fā)生反應(yīng)生成化合物lqc-c。
進(jìn)一步，上述反應(yīng)在-20℃至250℃下進(jìn)行；所述有機溶劑是含有1-20個碳原子的醚、醇、烷烴、芳香烴、酮、鹵代烷、酰胺、腈、酯或者它們各種比例的混合物；所用堿為三乙胺或碳酸鉀；所述催化劑為1-羥基苯并三唑(hobt)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edci)、1,3-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)或4-二甲氨基吡啶(dmap)。
進(jìn)一步，上述制備方法中，原料與氯代川芎嗪的摩爾比為1:0.1～1:10；原料與堿的摩爾比為1:0.1～1:10；中間體與肌氨酸的摩爾比為1:0.1～1:10；中間體與催化劑的摩爾比為1:0.1～1:10。
本發(fā)明反應(yīng)路線為：
反應(yīng)條件和試劑:(a)acoh,30％h2o2,reflux,90℃,6h；(b)ac2o,reflux,105℃,2h；(c)thf:meoh:h2o＝3:1:1,naoh,1h；(d),thf,tscl,tea,dmap,12h.；(e)dmf,dryk2co3,60℃,12h.(f)boc-sarcosine,edci,dmap,dcm,25℃,12h；(g)hcl(g)inea,0℃,1h.
本發(fā)明還提供式1化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
進(jìn)一步，所述腫瘤為肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌和胃癌細(xì)胞系。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物，該組合物包含以治療有效量存在的式1化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與至少一種藥學(xué)可接受的賦形劑的混合物。
進(jìn)一步，所述組合物還包含至少一種常規(guī)抗癌藥。
更進(jìn)一步，所述抗癌藥選自環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、阿霉素、依托泊苷、伊立替康、奧沙利鉑、順鉑或健擇。
本發(fā)明還提供治療癌癥的方法，包括給予患者給藥有效量的式1化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
為使上述劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備這些劑型時加入藥學(xué)可接受的賦形劑，例如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑等，填充劑包括：淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等，崩解劑包括：淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等，潤滑劑包括：硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等，助懸劑包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等，粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等，甜味劑包括：糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等，矯味劑包括：甜味劑及各種香精，防腐劑包括：尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等。
本發(fā)明所述“藥學(xué)可接受的”表示化合物或組合物必須在化學(xué)上和/或毒理學(xué)上與制劑中包含的其他成分相容。
所述“治療有效量”表示本發(fā)明化合物治療或預(yù)防特定疾病或癥狀；減弱、改善或消除特定疾病的一種或多種癥狀；或預(yù)防或延遲特定疾病或癥狀的發(fā)作的量。
本發(fā)明化合物具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞系(hepg-2、ht-29、hela、bgc-823、a549)生長的活性但對人肝正常細(xì)胞(l02)系毒性較小。其中，化合物lqc-c的對人結(jié)腸癌細(xì)胞系ht-29、人宮頸癌細(xì)胞系hela以及人肺癌細(xì)胞系a549抗增殖活性優(yōu)于陽性藥順鉑；但對人肝正常細(xì)胞l02的細(xì)胞毒性明顯低于陽性藥順鉑。
實驗例1mtt法觀察本發(fā)明化合物lqc-c對癌細(xì)胞及非癌細(xì)胞系的增殖影響
1.儀器與材料
thermo3111型co2培養(yǎng)箱；hfsafe生物安全柜；multiskango酶標(biāo)儀；京立牌ld5-2b型臺式低速離心機；olympusix71倒置熒光顯微鏡改良型rpmi-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶溶液、噻唑藍(lán)、磷酸鹽緩沖液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)；amresco二甲基亞砜(dmso)；
人肝癌細(xì)胞系hepg-2；人結(jié)腸癌細(xì)胞系ht-29；人宮頸癌細(xì)胞系hela；人胃癌細(xì)胞系bgc-823；人肺癌細(xì)胞系a549；人肝正常細(xì)胞l02；
實驗藥物：本發(fā)明化合物lqc-c(按實施例1-4制備)；原料藥川芎嗪(tmp)、白樺脂酸(ba)；陽性藥物注射用順鉑(dpp)(301001cf；齊魯制藥有限公司)。
2.方法
2.1不同細(xì)胞株的培養(yǎng)
hepg2、ht-29、hela、bgc-823、a549和l02細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，放置于37℃、5％的co2培養(yǎng)箱中溫育。細(xì)胞均呈貼壁狀態(tài)生長，在倒置顯微鏡下觀察生長狀況，待細(xì)胞數(shù)量適量時傳代培養(yǎng)。
2.2對腫瘤細(xì)和正常細(xì)胞的增殖抑制作用
取對數(shù)生長期的hepg2、ht-29、hela、bgc-823、a549和l02細(xì)胞，以3×103/孔的數(shù)量接種于96孔培養(yǎng)板中，在含5％co2的濕化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h；每孔分別加入100μl待測化合物，使最終濃度分別為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25μm。設(shè)置細(xì)胞對照組及空白對照組，藥物組每濃度重復(fù)4孔，細(xì)胞對照組和空白對照組重復(fù)3孔。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h后，每孔加20μlmtt孵育4h，棄去上清，再加100μldmso，振蕩10min，酶標(biāo)儀490nm波長測得吸光度值，記錄結(jié)果，并計算化合物的ic50值，細(xì)胞抑制率(％)＝[1－(a給藥－a空白)/(a正 常－a空白)]×100％。
3.結(jié)果
3.1本發(fā)明化合物lqc-c對5種腫瘤細(xì)胞系(hepg2、ht-29、hela、bgc-823、a549)和人肝正常細(xì)胞l02的ic50值如表1所示。
由表1可以看出，化合物lqc-c對各種癌細(xì)胞均表現(xiàn)出較好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，并且其抗腫瘤活性優(yōu)于原料；其中，化合物lqc-c的對人結(jié)腸癌細(xì)胞系ht-29和人宮頸癌細(xì)胞系hela和人肺癌細(xì)胞系a549抗增殖活性優(yōu)于陽性藥順鉑；但對人肝正常細(xì)胞l02的細(xì)胞毒性明顯低于陽性藥順鉑。
表1lqc-c對不同腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞的ic50值
4.結(jié)論
本發(fā)明化合物表現(xiàn)出抑制腫瘤細(xì)胞系(hepg2、ht-29、hela、bgc-823、a549)增殖的活性。
具體實施方式
實施例1化合物2-氯代甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(化合物5)的制備
取川芎嗪21.76g(160mmol)(化合物1)溶于50ml冰乙酸，加入18ml(160mmol)30％過氧化氫于90℃反應(yīng)4h，之后補充18ml(160mmol)30％過氧化氫繼續(xù)反應(yīng)2h，tlc監(jiān)測至反應(yīng)完全，冷卻至室溫，以50％氫氧化鈉調(diào)ph至10，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾，回收溶劑，得到白色川芎嗪單氮氧(化合物2)。在化合物2中加入15.1ml(160mmol)乙酸酐，于105℃加熱回流2.5h，tlc監(jiān)測至反應(yīng)完 全后，減壓蒸除過量的醋酐，得到黑色漿狀川芎嗪乙?；?化合物3)。將次此黑色漿狀物置于100ml(thf:meoh:h2o＝3:1:1)的溶液，分批加入19.2g(480mmol)氫氧化鈉，攪拌反應(yīng)2h，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶劑，得到羥基川芎嗪粗品，以正己烷重結(jié)晶，得18.5g黃色針狀結(jié)晶(化合物4)。最后將此黃色結(jié)晶溶于150ml無水四氫呋喃中，然后加入30.3g(0.159mol)tscl、24.64g(0.244mol)tea、1.5g(0.122mol)dmap，攪拌過夜，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾，回收溶劑，得到淡黃色氯代川芎嗪粗品，硅膠柱分離[v(石油醚):v(乙酸乙酯)＝10:1]得無色透明的氯代川芎嗪(化合物5)，收率80％。
備實施例2化合物tba的制備
稱取12g(26.28mmol)白樺脂酸，7.25g(52.56mmol)無水碳酸鉀于100ml單口瓶中，加入50mldmf，攪拌半小時后加入5.4g(31.5mmol)氯代川芎嗪(化合物5)，氮氣保護(hù)下，于60℃反應(yīng)12h，tlc檢測至反應(yīng)完全，加入一定量的水終止反應(yīng)，隨后用二氯甲烷萃取，收集有機層，適量無水硫酸鈉除水，減壓蒸干，硅膠柱分離[v(石油醚):v(丙酮)＝10:1]得白色固體tba，熔點:184.6–185.4℃,收率90％。1h-nmr(cdcl3)(ppm):0.78,0.80,0.82,0.96,0.98,1.69(s,each,3h,6×-ch3),2.51(s,3h,-ch3),2.53(s,3h,-ch3),2.57(s,3h,-ch3),3.02(m,1h),3.19(m,1h),4.61,4.74(each,brs,1h,＝ch2),5.20,5.23(each,d,j＝12.5hz,1h,-ch2),1.00–2.50(25h,methyl-andmethylene-oftriterpenoidstructure).13c-nmr(cdcl3)(ppm):14.7,15.4,15.9,16.1,18.3,19.4,20.9,25.5,27.4,28.0,29.7,30.6,32.1,34.4,36.9,37.2,38.1,38.7,38.9,40.7,42.4,46.9,49.5,50.6,55.4,56.7,79.0,109.6,150.5,175.5(-coo-)；pyrazinering:20.4(-ch3),21.4(-ch3),21.6(-ch3),64.3(-ch2),145.4,148.7,148.9,150.9.hrms(esi)m/z:591.45212[m+h]+,理論計算c38h58n2o3590.44474.
實施例3化合物lqc-c的制備
依次稱取200mg(0.338mmol)tba、83.25mg(0.44mmol)boc-l-肌氨酸、97.20mg(0.50mmol)edci和4.12mg(0.0038mmol)dmap置于50ml單口瓶中，加入5ml的無水二氯甲烷使其溶解，室溫下攪拌過夜tlc[v(二氯甲 烷):v(甲醇)＝20:1]檢測反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，收集有機層，適量無水硫酸鈉除水，減壓蒸干，硅膠柱分離[v(二氯甲烷):v(甲醇)＝40:1]得白色固體；將其溶于含3mhcl的乙酸乙酯中，冰鹽浴攪拌1h；減壓蒸干反應(yīng)液，適量乙酸乙酯復(fù)溶，用飽和的碳酸氫鈉溶液調(diào)ph至中性，收集有機層，適量無水硫酸鈉除水，減壓蒸干，硅膠柱分離[v(二氯甲烷):v(甲醇)＝40:1]得白色固體lqc-c，熔點:172.6–173.4℃，收率:76.90％。1h-nmr(cdcl3)(ppm):0.77,0.84,0.93(s,each,3h,3×-ch3,methylofba),0.82(brs,6h,2×-ch3,methylofba),1.00-2.50(31h,methyl-andmethylene-ofba),2.40,2.50,2.53(s,each,3h,3×-ch3,methyloftmp),2.96-3.01(m,1h,-cchch2-),3.52(brs,2h,-ch2nh-),4.48-4.51(m,1h,-ococh-),4.56,4.59(brs,each,1h,＝ch2),5.17,5.20(d,each,1h,j＝15hz,-och2-).13c-nmr(cdcl3)(ppm):14.79,16.00,16.28,16.64,18.27,19.47,20.63,23.85,25.56,28.22,29.75,30.66,32.15,34.35,34.55,37.04,37.21,38.01,38.18,38.47,40.79,42.53,46.97,49.59,50.58,50.73,55.55,56.79(-ch-nh2),83.23(-ococh-),109.81(-ch＝c-),151.10(-ch＝c-),168.63(-coch-),175.66(-coo-),pyrazinering:21.02(-ch3),21.51(-ch3),21.80(-ch3),64.48(-ch2),145.46,148.89,148.98,150.60.hrms(esi)m/z:[m+h]+662.48975，理論計算：c41h63n3o4661.48186.
實施例4
取lqc-c10g，加入注射劑(包括凍干粉針劑和無菌分裝干粉針劑)適當(dāng)輔料，按注射劑(包括凍干粉針劑和無菌分裝干粉針劑)工藝制備成抗腫瘤藥注射劑。
實施例5
取lqc-c10g，加入片劑(包括緩控釋片、骨架片、包衣片、分散片等)適當(dāng)輔料，按片劑(包括緩控釋片、骨架片、包衣片、分散片等)工藝制備成抗腫瘤藥片劑。
實施例6
取lqc-c10g，加入膠囊劑適當(dāng)輔料，按膠囊劑工藝制備成抗腫瘤藥膠囊劑。
實施例7
取lqc-c10g，加入乳劑(包括微乳、納米乳等)適當(dāng)輔料，按乳劑(包括微乳、納米乳等)工藝制備成抗腫瘤藥乳劑。
實施例8
取lqc-c10g，加入顆粒劑適當(dāng)輔料，按顆粒劑工藝制備成抗腫瘤藥顆粒劑。
實施例9
取lqc-c10g，加入緩釋控釋劑適當(dāng)輔料，按緩釋控釋劑工藝制成抗腫瘤藥緩釋控釋劑。
實施例10
取lqc-c10g，加入口服液適當(dāng)輔料，按口服液工藝制備成抗腫瘤藥口服液。
實施例11
取lqc-c10g，加入脂質(zhì)體劑型適當(dāng)輔料，按脂質(zhì)體工藝制備成抗腫瘤藥脂質(zhì)體劑型。