一種鹽膚木黃酮3?O?單氧酶編碼基因及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號：11722509閱讀：330來源：國知局

本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及鹽膚木rchf3m基因。

背景技術(shù)：

五倍子是一種重要的化工原料，是由半翅目hemiptera，蚜總科aphidoidea,癭綿科pemphigidae，倍蚜族melaphidini的五倍子蚜蟲生活在漆樹科anacardiaceae鹽膚木屬rhus的寄主植物上，刺激葉片組織增生而形成的蟲癭。中國五倍子利用有2000多年的歷史，古代主要用于中藥，現(xiàn)代廣泛用于化工、醫(yī)藥、紡織、食品等行業(yè)，具有重要的經(jīng)濟價值。鹽膚木rhuschinensis是角倍蚜schlechtendaliachinensis的主要寄主，角倍是角倍蚜在寄生在鹽膚木上形成的蟲癭，是我國主要的五倍子種類之一，其產(chǎn)量占我國五倍子總產(chǎn)量的70%以上。

角倍的主要活性成分是單寧，單寧（tannins）又稱單寧酸、鞣質(zhì)，是植物體內(nèi)一大類多酚黃酮化合物，單寧的生物合成途徑已基本明確,主要是通過莽草酸途徑合成,即由莽草酸途徑形成苯丙氨酸，再經(jīng)一系列反應(yīng)后最終形成單寧。許多植物中黃酮生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的生化功能已經(jīng)得到驗證，關(guān)鍵酶包括黃酮3-o-單氧酶、花青素3-o-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、無花色素還原酶（lar），花色素還原酶（anr），二氫黃酮醇4-還原酶（dfr）、查兒酮合成酶（chs）和查兒酮異構(gòu)酶（chi）等。黃酮3-o-單氧酶在角倍的單寧合成過程中起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，所以，鹽膚木黃酮3-o-單氧酶的表達水平對其產(chǎn)生角倍的單寧含量起著重要的調(diào)節(jié)作用，黃酮3-o-單氧酶基因是控制植物黃酮3-o-單氧酶表達的遺傳基礎(chǔ)。只有找到鹽膚木黃酮3-o-單氧酶的基因，才能對鹽膚木進行遺傳改良，從而提高角倍中單寧含量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明通過對鹽膚木進行接種，并定期收集不同發(fā)育階段的蟲癭分別提取rna，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析、基因注釋、kegg數(shù)據(jù)庫比對等步驟，得到了鹽膚木單寧合成關(guān)鍵基因rchf3m（序列1、2），并采用qpcr技術(shù)對rchf3m基因進行驗證（表2，圖1），具體技術(shù)方案如下：

1、樣本收集與處理

將五倍子蚜蟲放于鹽膚木上（rhuschinensismill），五倍子蚜蟲刺激葉翅產(chǎn)生角倍，定期收集生長于鹽膚木葉翅上不同生長時期的角倍，每次收集的角倍清除角倍內(nèi)所有蚜蟲后分為兩部分保存，一部分冷凍保存，用于提取總rna，另一部分用于測定單寧含量。

2、測序及轉(zhuǎn)錄組分析

提取去除蚜蟲后的五倍子的總rna，檢測rna質(zhì)量及純度后進行rna轉(zhuǎn)錄組測序，序列經(jīng)閱讀質(zhì)量分析、統(tǒng)計學比對分析、測序飽和度分析、參考基因讀取分布及參考基因組讀取分布分析后得到高質(zhì)量鹽膚木轉(zhuǎn)錄組序列。

3、基因注釋與篩選

拼接得到的所有功能基因都分別注釋到ncbi數(shù)據(jù)庫中的nr數(shù)據(jù)庫、nt數(shù)據(jù)庫及swiss-prot數(shù)據(jù)庫、kegg數(shù)據(jù)庫、cog數(shù)據(jù)庫、go數(shù)據(jù)庫中，得到與鹽膚木單寧合成通路相關(guān)基因，并結(jié)合基因表達量與單寧含量同步一致性，最終篩選出鹽膚木單寧合成的關(guān)鍵基因rchf3m（dna序列及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列如序列3所示）。

4、基因表達量驗證

為了驗證rchf3m基因，將rchf3m基因做實時熒光定量（qpcr）分析，采用相對定量方法分析rchf3m基因相對表達量(圖1)。

附圖說明

圖1為鹽膚木rhuschinensis5個不同發(fā)育時期單寧含量；

圖2為鹽膚木rchf3m基因qpcr相對定量結(jié)果；

圖3為鹽膚木rchf3m基因qpcr相對表達量驗證結(jié)果；圖中縱坐標rchf3m基因qpcr相對表達量，橫坐標為鹽膚木發(fā)育的5個不同時間點（從6月21-8月28日）；

圖4為鹽膚木不同發(fā)育時期單寧含量動態(tài)變化圖；圖中縱坐標為單寧含量（單寧占鹽膚木倍子重量的百分數(shù)），橫坐標為鹽膚木發(fā)育的5個不同時間點（從6月21-8月28日），5個時間點鹽膚木分別進行rna轉(zhuǎn)錄組測序分析。

具體實施方式

1、樣本收集

五倍子蚜蟲飼養(yǎng)于中國西南生態(tài)研究中心資源昆蟲研究所中的鹽膚木上（rhuschinensismill）。每隔十五天收集一次生長于鹽膚木葉翅上不同生長時期的角倍，共計8次。每次收集的角倍清除角倍內(nèi)所有蚜蟲后分為兩部分保存，一部分先以液氮凍存，隨后移入?80°c冰箱中以便提取總rna，另一部分用于單寧含量的測定。

2、測序及轉(zhuǎn)錄組分析

去除蚜蟲后的五倍子以通用植物總rna提取試劑盒（離心柱型）（百泰克，中國）提取總rna。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提總rna質(zhì)量。以nanophotometer?分光光度計(implen,ca,usa)檢測純度，以核糖核酸6000納米盒(agilenttechnologies,ca,usa)檢測rna完整度。以打斷后的mrna為模板，隨機六聚體引物合成一鏈cdna，然后配制雙鏈合成反應(yīng)體系合成雙鏈cdna。合成的雙鏈cdna以qiaquickpcrextractionkit純化，經(jīng)過磁珠純化、粘性末端修復、3’末端加堿基a、加測序接頭后，進行pcr擴增，從而完成整個文庫制備工作。

去除含接頭的片段，其余所需片段以瓊脂糖凝膠電泳純化并進行pcr擴增。每個擴增樣品以nebnext?ultra?directionalrnalibraryprep試劑盒進行測序(neb,usa)，所得基因代碼整合為測序文庫。整合后，文庫以illuminahiseqtm2000測序平臺雙向測序。最后，構(gòu)建好的文庫以ampurexp體系純化并以安捷倫生物分析儀2100系統(tǒng)(agilenttechnologies,ca,usa)檢測。經(jīng)測序儀讀取后，將去除含n（表示無法確定堿基信息）比例大于10%及低質(zhì)量的片段(質(zhì)量值q≤5的堿基數(shù)占整條read的50％以上)。

轉(zhuǎn)錄組序列拼接時將trinity2軟件中的min_kmer_cov選項設(shè)置為2，其余所有參數(shù)均為默認值。序列經(jīng)閱讀質(zhì)量分析、統(tǒng)計學比對分析、測序飽和度分析、參考基因讀取分布及參考基因組讀取分布分析后得到。

3、基因注釋

拼接得到的所有功能基因都分別注釋到ncbi數(shù)據(jù)庫中的nr數(shù)據(jù)庫、nt數(shù)據(jù)庫及swiss-prot數(shù)據(jù)庫、kegg數(shù)據(jù)庫、cog數(shù)據(jù)庫、go數(shù)據(jù)庫中?；虮磉_水平為每條基因堿基讀取比對到參考基因圖譜上的堿基數(shù)量，以rpkm表示1，rpkm值的大小反映了基因表達的豐度。將rpkm>0.3設(shè)為基因顯著表達閾值。fpkm法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達量的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因差異表達。

4、實時熒光定量分析

為了驗證rna分析結(jié)果，實時熒光定量采用icycler熒光實時檢測系統(tǒng)(bio-rad,hercules,ca)，采用相對定量方法分析各目的基因相對表達量。反應(yīng)體系均為25ul，其中，每個反應(yīng)體系中包含以1/40(v/v)稀釋過的的模板cdna2ul，及終濃度各為0.5mm的上下游引物。實時熒光定量反應(yīng)條件為：95°c，5分鐘；95°c，20秒；62°c，45秒；45個循環(huán)。最后，以熔解曲線檢測擴增特異性，熔解曲線反應(yīng)條件為：變性后樣品冷卻至55°c，然后以每10秒升高0.5°c為1個循環(huán)，重復80個循環(huán)，直至95°c。pcr產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后純化擴增產(chǎn)物并測序，驗證有效擴增。以actin為內(nèi)參基因校準模板濃度。每個處理重復三次。

序列1.鹽膚木rchf3m基因序列（996bp）

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序列2.鹽膚木黃酮3-o-單氧酶氨基酸序列（由轉(zhuǎn)錄組所得序列的反義鏈翻譯得到）

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序列3.鹽膚木rchf3m基因堿基序列與編碼氨基酸序列的對應(yīng)圖

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