相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.§119要求于2014年10月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/060,424的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容整體并入本文。本發(fā)明涉及抗tnf核酸化合物以及其使用方法和其組合物。
背景技術(shù)：
：tnf-α(腫瘤壞死因子-α，tumornecrosisfactor-alpha)是由活化的巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子，其通常促進(jìn)導(dǎo)致多種疾病的炎性應(yīng)答。tnf-α從巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞釋放并在炎性和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，包括在細(xì)菌及其他微生物感染期間以及在用炎性物質(zhì)刺激之后向受損組織募集白細(xì)胞。當(dāng)以過量存在時(shí)，已知tnf-α引起組織損傷，并且已涉及與炎性疾病和自身免疫病相關(guān)的病理狀況。tnf-α通過序列和分子量不同的兩種不同膜蛋白受體tnf-ri和tnf-rii來介導(dǎo)生物作用。據(jù)報(bào)道，tnf-ri在大多數(shù)(如果不是全部的話)人細(xì)胞類型中以低水平存在，并且人中tnf-ri基因的表達(dá)可以通過感染、干擾素和第二信使調(diào)節(jié)劑(例如佛波酯)而上調(diào)。兩種tnf受體的細(xì)胞外部分也以可溶性形式存在，其由受體的膜結(jié)合形式通過在細(xì)胞表面處的蛋白水解切割而獲得?？扇苄詔nf受體保留在溶液中結(jié)合tnf-α的能力。已經(jīng)在來自健康個(gè)體的尿和血清中鑒定到可溶性tnf受體，并且已經(jīng)顯示其在一些慢性疾病中和在用誘導(dǎo)tnf-α的藥劑接種之后升高。發(fā)明概述在一些方面，本發(fā)明是包含圖7中所示結(jié)構(gòu)的化合物或其鹽。在一些實(shí)施方案中，所述化合物的長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。在另一些實(shí)施方案中，所述化合物與載體一起配制在組合物中。在另一些實(shí)施方案中，所述化合物是鈉鹽。在另一些實(shí)施方案中，所述化合物是圖8中所示結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，所述化合物還在一端包含分子物種(molecularspecies)。在另一些實(shí)施方案中，所述化合物還在兩端包含分子物種。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子物種選自：間隔物(spacer)、脂質(zhì)、固醇(sterol)、膽固醇、硬脂基、c16烷基鏈、膽汁酸、膽酸、?；悄懰帷⒚撗跄懰?deoxycholate)、油烯基石膽酸(oleyllitocholicacid)、油?；懴┧?oleoylcholenicacid)、糖脂、磷脂、鞘脂、例如類固醇(steroid)的類異戊二烯(isoprenoid)、例如維生素e的維生素、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、例如甘油三酯的脂肪酸酯、芘、卟啉(texaphyrine)、德卟啉(texaphyrine)、金剛烷、吖啶、生物素、香豆素、熒光素、羅丹明、德克薩斯紅(texas-red)、地高辛配基(digoxygenin)、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(cyaninedye)(例如，cy3或cy576)、hoechst33258染料、補(bǔ)骨脂素(psoralen)和布洛芬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子物種選自：親脂性部分(lipophilicmoiety)、葉酸基團(tuán)、類固醇基團(tuán)、碳水化合物基團(tuán)、維生素a基團(tuán)、維生素e基團(tuán)或維生素k基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子物種通過選自磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和酰胺連接(linkage)的連接與所述化合物直接連接。在一些實(shí)施方案中，所述分子物種通過接頭與所述化合物間接連接。在另一些實(shí)施方案中，所述接頭是選自以下的非核苷酸接頭：無堿基殘基(dspacer)；低聚乙二醇(oligoethyleneglycol)，例如三乙二醇(間隔物9)或六乙二醇(間隔物18)；以及烷二醇(alkane-diol)，例如丁二醇。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含mumgmgmgmamgt*a*g*a*t*g*mamgmgmumamc(seqidno.16)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸，其中m是2’o甲基，并且其中*是硫代磷酸酯修飾。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸與載體一起配制在組合物中。在另一些實(shí)施方案中，所述載體是基于脂質(zhì)的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是納米顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸還在3’或5’端包含分子物種。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸還在3’和5’兩端包含分子物種。在另一些實(shí)施方案中，所述分子物種選自：間隔物、脂質(zhì)、固醇、膽固醇、硬脂基、c16烷基鏈、膽汁酸、膽酸、?；悄懰帷⒚撗跄懰?、油烯基石膽酸、油?；懴┧?、糖脂、磷脂、鞘脂、例如類固醇的類異戊二烯、例如維生素e的維生素、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、例如甘油三酯的脂肪酸酯、芘、卟啉、德卟啉、金剛烷、吖啶、生物素、香豆素、熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、地高辛配基、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，cy3或cy576)、hoechst33258染料、補(bǔ)骨脂素和布洛芬。在一些實(shí)施方案中，所述分子物種選自：親脂性部分、葉酸基團(tuán)、類固醇基團(tuán)、碳水化合物基團(tuán)、維生素a基團(tuán)、維生素e基團(tuán)或維生素k基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子物種通過選自磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和酰胺連接的連接與所述化合物直接連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子物種通過接頭與所述化合物間接連接。在一些實(shí)施方案中，所述接頭是選自以下的非核苷酸接頭：無堿基殘基(dspacer)；低聚乙二醇，例如三乙二醇(間隔物9)或六乙二醇(間隔物18)；以及烷二醇，例如丁二醇。在另一些方面，本發(fā)明是包含5′tgggagtagatgaggtac3’(seqidno.4)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的長(zhǎng)度為18至19個(gè)核苷酸，其中所述寡核苷酸5’端的4至6個(gè)核苷酸和3’端的4至6個(gè)核苷酸包含2’o甲基，并且其中4至10個(gè)核苷酸具有硫代磷酸酯修飾。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸5’端的6個(gè)核苷酸和3’端的6個(gè)核苷酸包含2’o甲基。在另一些實(shí)施方案中，6個(gè)核苷酸具有硫代磷酸酯修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，7個(gè)核苷酸具有硫代磷酸酯修飾。在又一個(gè)實(shí)施方案中，8個(gè)核苷酸具有硫代磷酸酯修飾。在另一些實(shí)施方案中，經(jīng)硫代磷酸酯修飾的核苷酸位于寡核苷酸的中心區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與從寡核苷酸5’端的第七、第八、第九、第十、第十一和第十二個(gè)核苷酸締合的核苷酸間連接(internucleotidelinkage)是經(jīng)硫代磷酸酯修飾的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)核苷酸具有2’o甲基修飾或硫代磷酸酯核苷酸間連接。在一些實(shí)施方案中，僅一個(gè)核苷酸具有2’o甲基修飾和硫代磷酸酯核苷酸間連接二者。在另一些實(shí)施方案中，僅一個(gè)核苷酸具有2’-修飾的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，2’-修飾選自：2’-脫氧、2’-脫氧-2’-氟、2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、2’-o-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-o-dmaeoe)和2’-o--n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)。本發(fā)明的一個(gè)方面是穩(wěn)定的自組裝納米結(jié)構(gòu)，其包含含有tgggagtagatgaggtac(seqidno.4)的長(zhǎng)度為18至19個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸，其中3’或5’端的疏水性基團(tuán)在水或其他合適的溶劑中自締合(self-associate)以形成納米結(jié)構(gòu)的核心。當(dāng)寡核苷酸以高于5μm的濃度存在于不含dna酶和rna酶的水或其他合適溶劑中時(shí)，通常形成自組裝納米結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸的長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。在另一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸具有磷酸二酯核苷酸間連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不是所有的核苷酸間連接都是磷酸二酯。本發(fā)明的另一方面是穩(wěn)定的自組裝納米結(jié)構(gòu)，其包含含有tgggagtagatgaggtac(seqidno.4)的長(zhǎng)度為18至19個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸與核心締合。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸的長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。在另一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸具有磷酸二酯核苷酸間連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不是所有的核苷酸間連接都是磷酸二酯。在另一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸具有硫代磷酸酯核苷酸間連接。在一些實(shí)施方案中，不是所有的核苷酸間連接都是硫代磷酸酯。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸具有2’o甲基修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不是所有的核苷酸都包含2’o甲基修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸具有17個(gè)核苷酸間連接，并且其中6個(gè)中心核苷酸間連接是硫代磷酸酯。在另一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸5’端的前6個(gè)核苷酸間連接是磷酸二酯核苷酸間連接。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸5’端的前6個(gè)核苷酸是2’o甲基修飾的核苷酸。在另一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸3’端的最后5個(gè)核苷酸是2’o甲基修飾的核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸選自t-g-g-g-a-g-t-a-g-a-t-g-a-g-g-t-a-c(seqidno.4)、mumgmgmgmamgmumamgmamumgmamgmgmumamc(seqidno.10，oligo3742)、t*g*g*g*a*g*t*a*g*a*t*g*a*g*g*t*a*c(seqidno.9，oligo3500)、mumgmgmgmamgt*a*g*a*t*g*mamgmgmumamc(seqidno.16，oligo3534)和mu*mg*mg*mg*ma*mg*t*a*g*a*t*g*ma*mg*mg*mu*ma*mc(seqidno.18，oligo3509)，其中-是指磷酸二酯鍵，*是指硫代磷酸酯鍵，并且m是指o甲基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸與核心的外部連接。在一些實(shí)施方案中，所述納米結(jié)構(gòu)包含2至1,000個(gè)拷貝的反義寡核苷酸。在另一些實(shí)施方案中，所述納米結(jié)構(gòu)包含至少一種在結(jié)構(gòu)上與所述反義寡核苷酸不同的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸使其5’端暴露于納米結(jié)構(gòu)的外表面。在另一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸使其3’端暴露于納米結(jié)構(gòu)的外表面。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸側(cè)向(laterally)位于納米結(jié)構(gòu)的表面上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸通過接頭與核心間接連接。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸通過多于一個(gè)接頭與核心間接連接。在一些實(shí)施方案中，所述核心是實(shí)心或空心的核心。在另一些實(shí)施方案中，所述核心是惰性的、順磁性的或超順磁性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核心是實(shí)心核心。在另一些實(shí)施方案中，所述實(shí)心核心由以下構(gòu)成：包括金和銀的貴金屬、包括鐵和鈷的過渡金屬、包括二氧化硅的金屬氧化物、聚合物或其組合。在另一些實(shí)施方案中，所述核心是聚合物核心，并且其中所述聚合物核心由以下構(gòu)成：兩親性嵌段共聚物；疏水性聚合物，包括聚苯乙烯、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lacticco-glycolicacid))、聚(乙醇酸)、聚(己內(nèi)酯)；以及其他生物相容性聚合物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述核心是脂質(zhì)體核心。本發(fā)明的另一方面是組合物，其包含先前討論實(shí)施方案的化合物、寡核苷酸或納米結(jié)構(gòu)，所述組合物還包含與納米結(jié)構(gòu)締合的用于治療tnf病癥的治療劑。在一些實(shí)施方案中，所述治療劑與寡核苷酸連接。本文中所述的組合物和核酸各自可以在多種載體中配制。在一些實(shí)施方案中，在表面用載體中配制本發(fā)明的化合物。在一些實(shí)施方案中，表面用制劑是膏劑。在另一些實(shí)施方案中，表面用制劑是凝膠劑。本發(fā)明的另一方面是用于治療tnf病癥的方法，其包括向患有tnf病癥的對(duì)象施用治療tnf病癥有效量的組合物，所述組合物包含前述方面的化合物、寡核苷酸或納米結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述tnf病癥選自：自身免疫病、感染性疾病、移植排斥或移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease)、惡性腫瘤(malignancy)、肺病、腸病、心臟病、膿毒癥、脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathy)、代謝病(metabolicdisease)、貧血、疼痛、肝病、皮膚病、指甲病(naildisorder)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、與銀屑病關(guān)節(jié)炎組合的銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病(crohn’sdisease)、血管炎、白塞病(behcet’sdisease)、強(qiáng)直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisorder，copd)、特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis，ipf)、再狹窄、糖尿病、貧血、疼痛、克羅恩病相關(guān)病癥、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(juvenilerheumatoidarthritis，jra)、丙型肝炎病毒感染、銀屑病關(guān)節(jié)炎和慢性斑塊型銀屑病(chronicplaquepsoriasis)。在一些實(shí)施方案中，所述自身免疫病選自：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)、多發(fā)性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和腎炎綜合征。在另一方面，本發(fā)明是用于降低體內(nèi)tnf水平的方法，其包括向?qū)ο笫┯媒档腕w內(nèi)tnf水平有效量的組合物，所述組合物包含前述實(shí)施方案的化合物、寡核苷酸或納米結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的每個(gè)限定可涵蓋本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案。因此，預(yù)期本發(fā)明涉及任意一種要素或要素組合的每個(gè)限定都可以包括在本發(fā)明的每個(gè)方面中。本發(fā)明在其應(yīng)用方面不限于以下說明中所述或附圖中所示結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)和組件布置。本發(fā)明能夠具有其他實(shí)施方案并且能夠以多種方式實(shí)踐或?qū)嵤?。附圖簡(jiǎn)述附圖不旨在按比例繪制。在附圖中，不同附圖中所示的每個(gè)相同或幾乎相同的組件由相同的附圖標(biāo)記表示。為清楚起見，可以不在每個(gè)附圖中標(biāo)出每個(gè)組件。在附圖中：圖1是示出了相對(duì)于oligo3495(亂序?qū)φ?scrambledcontrol))歸一化的幾種寡核苷酸(包括oligo3482、3483、3484、3485、3486、3487和3488)在原代人角質(zhì)形成細(xì)胞中對(duì)tnf表達(dá)的抑制活性的條形圖。圖2是示出了幾種寡核苷酸(包括oligo3485、3472、3508、3500、3496、3526、3607、3534、3514、3509、3516和3495)在原代人角質(zhì)形成細(xì)胞中對(duì)tnf表達(dá)的抑制活性的條形圖。圖3是示出了不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)幾種寡核苷酸(包括oligo3660、3743、3661、3657、3669和3652)與其各自對(duì)照相比的在原代人角質(zhì)形成細(xì)胞中的抑制活性的作用的條形圖。將寡核苷酸配制成球形核酸(sphericalnucleicacid，sna)。圖4a至4b示出了經(jīng)刺激的人角質(zhì)形成細(xì)胞中sna對(duì)tnf的百分比基因敲減。在圖4a中，圖示了oligo3657與其對(duì)照oligo3661之間的百分比tnf-αmrna表達(dá)。圖4b示出了化合物的半最大抑制濃度(ic50)，分別為1.8nm和＞100nm。圖5a至5b示出了額外的硫代磷酸酯修飾對(duì)oligo3657修飾的sna的作用。在圖5a中，圖示了具有提高硫代磷酸酯含量的寡核苷酸的百分比相對(duì)mrna表達(dá)。圖5b示出了篩選的每種寡核苷酸的半最大有效濃度(ec50)的表格。圖6a至6b示出了空心sna對(duì)tnf表達(dá)的作用。在圖6a中，示出了相對(duì)于未經(jīng)處理歸一化的tnf表達(dá)，而圖6b示出了化合物的ic50值。圖7是tnf反義寡核苷酸的游離酸形式的結(jié)構(gòu)。圖8是tnf反義寡核苷酸的鹽形式的結(jié)構(gòu)。圖9示出了經(jīng)刺激的人角質(zhì)形成細(xì)胞中sna對(duì)tnf的百分比基因敲減。圖示了oligo6081與其對(duì)照oligo6093之間的百分比tnfmrna表達(dá)。所示出的數(shù)據(jù)是相對(duì)于僅用tnf刺激的細(xì)胞(無寡核苷酸，設(shè)定為1.0)的tnfmrna基因表達(dá)。圖10是示出了不同六(乙二醇)間隔物長(zhǎng)度對(duì)經(jīng)刺激的原代人角質(zhì)形成細(xì)胞中tnfmrna表達(dá)的抑制活性的作用的條形圖。示出了相對(duì)于其各自對(duì)照oligo6083、6093、6094和6095(設(shè)定為100)的用oligo6080、6081、6082和6092處理的細(xì)胞的百分比tnfmrna表達(dá)。圖11是顯示l-sna在銀屑病離體外植體中敲減tnf的條形圖。圖12a至12d示出了tnf反義寡核苷酸的s-sna(自組裝的sna)和l-sna(脂質(zhì)體sna)形式在含有炎性腸病(inflammatoryboweldisease，ibd)的小鼠中的降低的臨床和大體病理學(xué)評(píng)分。在圖12a中，示出了載劑、tnbs、不同給藥量的s-sna形式的oligo227901的疾病臨床評(píng)分。在圖12b中，示出了載劑、tnbs、不同給藥量的l-sna形式的oligo227901的疾病臨床評(píng)分。在圖12c中，示出了載劑、tnbs、不同給藥量的s-sna形式的oligo227901的疾病大體病理學(xué)評(píng)分。在圖12d中，示出了載劑、tnbs、不同給藥量的l-sna形式的oligo227901的疾病大體病理學(xué)評(píng)分。*表示使用單因素anova隨后進(jìn)行事后tukey檢驗(yàn)相對(duì)于載劑組p＜0.05。圖13示出了oligo6307自組裝sna的cryo-tem。圖14a至14b示出了oligo6307自組裝sna的cryo-tem的示意圖。示出了單獨(dú)sna(圖14a)和sna集合(圖14b)的示意圖。發(fā)明詳述本發(fā)明在一些方面涉及用于降低tnfα的組合物和使用這些組合物來治療tnf病癥的方法。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，已鑒定到高度有效的tnfα抑制劑。tnfα抑制劑是基于核酸的反義組合物。術(shù)語(yǔ)“tnf-α”是指作為17kd的分泌形式和26kd的膜締合形式存在的細(xì)胞因子，其生物活性形式由非共價(jià)結(jié)合的17kd分子的三聚體構(gòu)成。本文中使用的“tnfα抑制劑”是指干擾tnfα活性的基于核酸的藥劑。特別地，本發(fā)明的tnfα反義抑制劑或tnfα反義寡核苷酸降低tnfα基因的表達(dá)。本發(fā)明的tnf抑制劑是反義核酸。反義核酸通常包括經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的rna、dna或混合的聚合物核酸，并且主要通過與匹配序列特異性結(jié)合導(dǎo)致調(diào)節(jié)肽合成來發(fā)揮作用。反義核酸通過watsoncrick堿基配對(duì)與靶rna結(jié)合，并通過空間阻擋或通過激活rnaaseh酶阻止所結(jié)合序列的核糖體翻譯來阻斷基因表達(dá)。反義分子還可以通過干擾rna加工或從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運(yùn)來改變蛋白質(zhì)合成。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“反義核酸”或“反義寡核苷酸”描述了這樣的核酸：其在生理?xiàng)l件下與包含特定基因(在此情況下為tnfα)的dna或與該基因的mrna轉(zhuǎn)錄物雜交，并且由此抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和/或該mrna的翻譯。反義分子被設(shè)計(jì)成在與靶基因或轉(zhuǎn)錄物雜交之后干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，反義寡核苷酸的確切長(zhǎng)度及其與其靶標(biāo)的互補(bǔ)程度將取決于所選擇的具體靶標(biāo)，包括靶標(biāo)的序列和該序列所包含的具體堿基?！耙种苹虮磉_(dá)”是指來自靶基因(例如tnfα基因)的蛋白質(zhì)和/或mrna產(chǎn)物的水平的不存在或可觀察到的降低?！疤禺愋浴笔侵敢种瓢谢蚨鴮?duì)細(xì)胞的其他基因沒有明顯作用的能力。抑制的結(jié)果可通過檢測(cè)細(xì)胞或生物體的外部性質(zhì)或者通過生物化學(xué)技術(shù)來確定，所述生物化學(xué)技術(shù)例如rna溶液雜交、核酸酶保護(hù)、northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄、用微陣列進(jìn)行基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、抗體結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)、western印跡、放射免疫測(cè)定(radioimmunoassay，ria)、其他免疫測(cè)定和熒光激活細(xì)胞分析(fluorescenceactivatedcellanalysis，facs)。本發(fā)明的反義寡核苷酸抑制tnfα表達(dá)。根據(jù)測(cè)定，與未根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行處理的細(xì)胞相比，基因表達(dá)量的量化允許確定大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的抑制程度。例如，抑制效率可以通過評(píng)估細(xì)胞中基因產(chǎn)物的量來確定。在一些情況下，tnfα抑制劑是具有以下結(jié)構(gòu)的化合物或其生物等效物(包括鹽和前藥)：本文中使用的術(shù)語(yǔ)生物等效化合物(包括可藥用鹽和前藥)是指這樣的反義寡核苷酸：其與目的反義寡核苷酸具有相同的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但包括可被切割或修飾以與目的反義寡核苷酸具有相同類型的生物學(xué)效應(yīng)的鹽形式或結(jié)構(gòu)。這旨在涵蓋任何可藥用鹽、酯、或這樣的酯的鹽、或在施用于動(dòng)物(包括人)之后能夠提供(直接或間接地)其生物活性代謝物或殘余物的任何其他化合物?！翱伤幱名}”是本發(fā)明的核酸的生理上可接受和可藥用的鹽：即，保留目的化合物的期望生物活性并且不賦予其不期望的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽?？伤幱名}包括但不限于：(a)與陽(yáng)離子例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、例如精胺和亞精胺的多胺等形成的鹽；(b)與無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成鹽；(c)與有機(jī)酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的鹽；以及(d)由元素陰離子(例如氯離子、溴離子和碘離子)形成的鹽。本發(fā)明的反義寡核苷酸的鹽的實(shí)例是例如為具有以下結(jié)構(gòu)的鈉鹽的化合物：本發(fā)明的化合物還可制備成以“前藥”形式遞送?！扒八帯笔且苑腔钚孕问街苽涞脑隗w內(nèi)或其細(xì)胞內(nèi)通過內(nèi)源性酶或其他化學(xué)物質(zhì)和/或條件的作用而轉(zhuǎn)化為活性形式(即，藥物)的治療劑。本發(fā)明的反義寡核苷酸是tnfα反義寡核苷酸。反義tnfα寡核苷酸是指具有以下核苷酸堿基序列和亞基至亞基主鏈(subunit-to-subunitbackbone)的化合物，其允許反義寡核苷酸通常通過watson-crick堿基配對(duì)與tnfα靶序列雜交以在靶序列中形成rna：寡聚物異源雙鏈體(heteroduplex)。反義寡核苷酸與其靶核酸t(yī)nfα的特異性雜交干擾核酸t(yī)nfα的正常功能。與靶核酸特異性雜交的化合物對(duì)靶核酸功能的這種調(diào)節(jié)通常被稱為“反義的”。待干擾的dna功能包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的rna功能包括所有重要功能，例如rna向蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)的轉(zhuǎn)位、由rna翻譯蛋白質(zhì)、產(chǎn)生一個(gè)或更多個(gè)mrna種類的rna剪接、以及可以涉及rna或由rna促進(jìn)的催化活性。這樣的干擾靶核酸功能的總體效果是調(diào)節(jié)tnfα蛋白的表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，“調(diào)節(jié)”意指降低或抑制基因的表達(dá)。如果寡核苷酸在生理?xiàng)l件下與tnfα靶標(biāo)雜交，則該反義寡核苷酸與靶多核苷酸“特異性雜交”，其中熱解鏈點(diǎn)(tm)基本上大于37℃、優(yōu)選至少45℃并且通常為50℃至80℃或更高。這樣的雜交優(yōu)選地對(duì)應(yīng)于選擇為與特定序列在確定的離子強(qiáng)度和ph下的tm相比低約10℃并且優(yōu)選低約50℃的嚴(yán)格雜交條件。在給定的離子強(qiáng)度和ph下，tm是靶序列的50％與互補(bǔ)多核苷酸雜交時(shí)的溫度。當(dāng)兩個(gè)單鏈多核苷酸之間的反平行結(jié)構(gòu)中發(fā)生雜交時(shí)，多核苷酸被描述為彼此“互補(bǔ)”。如果在第一多核苷酸和第二多核苷酸的一條鏈之間發(fā)生雜交，則雙鏈多核苷酸可與另一多核苷酸”互補(bǔ)”。根據(jù)普遍接受的堿基配對(duì)規(guī)則，互補(bǔ)性(一個(gè)多核苷酸與另一多核苷酸互補(bǔ)的程度)可根據(jù)預(yù)期彼此形成氫鍵的相對(duì)鏈中堿基的比例來量化。即使兩條堿基序列不是100％互補(bǔ)，反義化合物也可以與靶轉(zhuǎn)錄物的靶區(qū)域互補(bǔ)，只要化合物與轉(zhuǎn)錄物之間形成的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)具有期望的tm穩(wěn)定性即可。鑒定靶向特定核酸的反義寡核苷酸可以是多步驟過程。該過程通常開始于鑒定其功能待被調(diào)節(jié)的核酸序列。這可以是例如其表達(dá)與特定tnfα病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或由該基因轉(zhuǎn)錄的mrna)。靶向過程還包括確定該tnfα基因內(nèi)用于發(fā)生反義相互作用使得將產(chǎn)生期望效果(例如，檢測(cè)或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá))的位點(diǎn)。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的基因內(nèi)位點(diǎn)是包含seqidno.34的核苷酸序列2283-2300的區(qū)域，即gtacctcatctactccca(seqidno.35)。優(yōu)選的反義寡核苷酸被設(shè)計(jì)為靶向人tnfα，例如，下文所示的seqidno.34的核苷酸序列。人tnf-αcdna序列已由nedwin，g.e.等(nucleicacidsres.1985，13，6361-6373)公開，并且公開于genbank登錄號(hào)x02910。本文中所述的納米結(jié)構(gòu)可以是穩(wěn)定的自組裝納米結(jié)構(gòu)。例如，所述納米結(jié)構(gòu)可以是包含tgggagtagatgaggtac(seqidno.4)的長(zhǎng)度為18至19個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸，其中3’或5’端的疏水性基團(tuán)在水或其他合適的溶劑中自締合以形成納米結(jié)構(gòu)的核心。本文中使用的疏水性基團(tuán)可包括：膽固醇、膽固醇基或經(jīng)修飾的膽固醇基殘基、金剛烷(adamantine)、二氫睪酮(dihydrotesterone)、長(zhǎng)鏈烷基、長(zhǎng)鏈烯基、長(zhǎng)鏈炔基、油烯基石膽酸、膽烯酸、油?；懴┧?、棕櫚基、十七烷基、豆蔻基(myrisityl)、膽汁酸、膽酸或?；悄懰帷⒚撗跄懰?、油烯基石膽酸、油?；懴┧?、糖脂、磷脂、鞘脂、例如類固醇的類異戊二烯、例如維生素e的維生素、飽和或不飽和的脂肪酸、例如甘油三酯的脂肪酸酯、芘、卟啉、德卟啉、金剛烷、吖啶、生物素、香豆素、熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、地高辛配基、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，cy3或cy5)、hoechst33258染料、補(bǔ)骨脂素或布洛芬。反義寡核苷酸的長(zhǎng)度通常為15至20個(gè)堿基，其通常足夠長(zhǎng)以在哺乳動(dòng)物基因組中具有一個(gè)互補(bǔ)序列。另外，長(zhǎng)度為至少12個(gè)核苷酸，通常長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸的反義化合物與其靶mrna充分雜交。因此，本發(fā)明的反義寡核苷酸通常在8至100個(gè)核苷酸的大小范圍內(nèi)，更優(yōu)選地長(zhǎng)度為12至50個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸的長(zhǎng)度為18至19個(gè)核苷酸并且其包含tgggagtagatgaggtac(seqidno.4)。包含seqidno.4的反義寡核苷酸可以在該寡核苷酸的5’和/或3’端包含另外的核苷酸。然而，包含seqidno.4并且長(zhǎng)度限于18個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸在分子的5’或3’端不具有任何另外的核苷酸。這些寡核苷酸的5’和/3’端可共價(jià)或非共價(jià)連接有其他非核苷酸分子。在一些情況下，反義寡核苷酸是以下寡核苷酸之一：t-g-g-g-a-g-t-a-g-a-t-g-a-g-g-t-a-c(seqidno.4)、mumgmgmgmamgmumamgmamumgmamgmgmumamc(seqidno.10，oligo3742)、t*g*g*g*a*g*t*a*g*a*t*g*a*g*g*t*a*c(seqidno.9，oligo3500)、mumgmgmgmamgt*a*g*a*t*g*mamgmgmumamc(seqidno.16，oligo3534)、和mu*mg*mg*mg*ma*mg*t*a*g*a*t*g*ma*mg*mg*mu*ma*mc(seqidno.18，oligo3509)，其中-是指磷酸二酯鍵，*是指硫代磷酸酯鍵，并且m是指o甲基。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“寡核苷酸”可互換使用，意指多個(gè)核苷酸(即，包含與磷酸基團(tuán)并與可互換有機(jī)堿基連接的糖(例如，核糖或脫氧核糖)的分子，所述有機(jī)堿基是經(jīng)取代的嘧啶(例如，胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))或者經(jīng)取代的嘌呤(例如，腺嘌呤(a)或鳥嘌呤(g)))。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”和“寡核苷酸”是指寡核糖核苷酸以及寡脫氧核糖核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“寡核苷酸”應(yīng)還包括多核苷(即，去掉磷酸的多核苷酸)和任何其他含有機(jī)堿基的聚合物。核酸分子優(yōu)選地是合成的(例如，通過核酸合成產(chǎn)生的)。寡核苷酸可以是可用于產(chǎn)生反義效應(yīng)的任何大小。在一些實(shí)施方案中，其長(zhǎng)度為18至23個(gè)核苷酸。在另一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸的長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“寡核苷酸”還可涵蓋具有替換或修飾(例如在堿基和/或糖中)的核酸或寡核苷酸。例如，其包括具有以下主鏈糖的核酸，所述主鏈糖在2’位與除羥基之外的低分子量有機(jī)基團(tuán)共價(jià)連接且在5’位與除磷酸基團(tuán)或羥基之外的低分子量有機(jī)基團(tuán)共價(jià)連接。因此，經(jīng)修飾的核酸可以包含2’-o-烷基化的核糖基團(tuán)。此外，經(jīng)修飾的核酸可以包含例如阿拉伯糖或2’-氟阿拉伯糖的糖而不是核糖。因此，核酸在主鏈組成方面可以為異質(zhì)的，從而包含連接在一起的聚合物單元的任何可能的組合，例如肽-核酸(其具有含有核酸堿基的氨基酸主鏈)。另一些實(shí)例在下文中更詳細(xì)地描述。寡核苷酸可以是dna、rna、pna、lna、ena或包含其任何化學(xué)或天然修飾的雜合體。化學(xué)和天然修飾是本領(lǐng)域中公知的。這樣的修飾包括例如設(shè)計(jì)用于以下的修飾：提高與靶鏈的結(jié)合(即，提高其解鏈溫度)、幫助鑒定寡核苷酸或寡核苷酸-靶標(biāo)復(fù)合物、提高細(xì)胞穿透、針對(duì)降解或干擾寡核苷酸的結(jié)構(gòu)或活性的核酸酶及其他酶而穩(wěn)定化、一旦與靶標(biāo)序列特異性結(jié)合就提供破壞模式(終止事件)、以及改善寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)特性。修飾包括但不限于：例如，(a)末端修飾，例如5’端修飾(磷酸化去磷酸化、綴合、反向連接等)、3’端修飾(綴合、dna核苷酸、反向連接等)；(b)堿基修飾，例如用經(jīng)修飾的堿基、穩(wěn)定堿基、去穩(wěn)定堿基、或與配偶體的擴(kuò)增集合堿基配對(duì)的堿基、或綴合的堿基進(jìn)行置換；(c)糖修飾(例如，在2’位或4’位)或糖替換；以及(d)核苷間連接修飾，包括磷酸二酯連接的修飾或替代。就這樣的修飾干擾翻譯的程度(即，例如在體外翻譯測(cè)定中，相對(duì)于缺乏修飾，導(dǎo)致翻譯降低50％、60％、70％、80％或90％或更多)來說，所述修飾對(duì)于本文中所述的方法和組合物而言可能不是最佳的。經(jīng)修飾的核苷間連接的非限制性實(shí)例包括：具有正常3’-5’連接的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亞烷基膦酸酯)以及手性膦酸酯、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯)、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯以及硼烷磷酸酯，這些的2’-5’連接的類似物，以及其中相鄰的核苷單元對(duì)以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’連接的具有反向極性的那些。還包括多種鹽、混合鹽和游離酸形式。其中不包含磷原子的經(jīng)修飾的核苷間連接具有由短鏈烷基形成的核苷間連接或環(huán)烷基核苷間連接、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接、或者一個(gè)或更多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接。這些包括具有以下的那些：?jiǎn)徇B接(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰乙?；土虼柞Ｒ阴；麈?；亞甲基甲酰乙?；土虼柞Ｒ阴；麈湥缓N的主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈；以及具有混合的n、o、s和ch2組成部分的其他主鏈。經(jīng)取代的糖部分包括但不限于2’位的以下之一：h(脫氧核糖)；oh(核糖)；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或者o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是經(jīng)取代或未經(jīng)取代的c1至c10烷基或者c2至c10烯基和炔基。經(jīng)化學(xué)或天然修飾的寡核苷酸可以包含例如至少一個(gè)在糖的2’位修飾的核苷酸，最優(yōu)選2’-o-烷基、2’-o-烷基-o-烷基或2’-氟修飾的核苷酸或端帽(endcap)。在另一些實(shí)施方案中，rna修飾包括在rna的嘧啶的核糖上的2’-氟、2’-氨基和2’o-甲基修飾，無堿基殘基或3’端的反向堿基。根據(jù)本發(fā)明可用的寡核苷酸可以包含單個(gè)經(jīng)修飾的核苷。在另一些實(shí)施方案中，寡核苷酸可以包含至少兩個(gè)經(jīng)修飾的核苷、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)或更多個(gè)核苷，多至寡核苷酸的整個(gè)長(zhǎng)度。核苷或核堿基包含天然嘌呤堿基腺嘌呤(a)和鳥嘌呤(g)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。經(jīng)修飾的核苷包含其他的合成和天然核堿基，例如肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、異鳥嘌呤核苷(isoguanisine)、殺結(jié)核菌素(tubercidine)、2-(鹵代)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2(氨基丙基)腺嘌呤、2(甲硫基)n6(異戊烯基)腺嘌呤、6(烷基)腺嘌呤、6(甲基)腺嘌呤、7(去氮雜)腺嘌呤、8(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8(炔基)腺嘌呤、8(氨基)腺嘌呤、8-(鹵代)腺嘌呤、8-(羥基)腺嘌呤、8(硫代烷基)腺嘌呤、8-(巰基)腺嘌呤、n6-(異戊基)腺嘌呤、n6(甲基)腺嘌呤、n6，n6(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鳥嘌呤、2(丙基)鳥嘌呤、6-(烷基)鳥嘌呤、6(甲基)鳥嘌呤、7(烷基)鳥嘌呤、7(甲基)鳥嘌呤、7(去氮雜)鳥嘌呤、8(烷基)鳥嘌呤、8-(烯基)鳥嘌呤、8(炔基)鳥嘌呤、8-(氨基)鳥嘌呤、8-(鹵代)鳥嘌呤、8-(羥基)鳥嘌呤、8(硫代烷基)鳥嘌呤、8-(巰基)鳥嘌呤、n(甲基)鳥嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3(去氮雜)5(氮雜)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5(鹵代)胞嘧啶、5(甲基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、n4(乙酰基)胞嘧啶、3(3氨基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)4(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2，4(二硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2，4(二硫代)尿嘧啶、5(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5(氨基烯丙基)尿嘧啶、5(氨基烷基)尿嘧啶、5(胍烷基)尿嘧啶、5(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(鹵代)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5氧基乙酸、5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(三氟甲基)尿嘧啶、6(偶氮)尿嘧啶、二氫尿嘧啶、n3(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2(硫代)假尿嘧啶、4(硫代)假尿嘧啶、2，4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、1取代的假尿嘧啶、1取代的2(硫代)-假尿嘧啶、1取代的4(硫代)假尿嘧啶、1取代的2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1，3-(二氮雜)-2-(氧代)吩嗪-1-基、1-(氮雜)-2-(硫代)-3-(氮雜)-吩嗪-1-基、1，3-(二氮雜)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1-(氮雜)2-(硫代)-3-(氮雜)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮雜)-2-(氧代)-吩嗪-1-基、7-取代的1-(氮雜)2-(硫代)-3-(氮雜)-吩嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮雜)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮雜)2-(硫代)-3-(氮雜)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羥基)-1，3-(二氮雜)-2-(氧代)-吩嗪-1-基、7-(氨基烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫代)-3-(氮雜)-吩嗪-1-基、7-(氨基烷基羥基)-1，3-(二氮雜)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氮基烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫代)-3-(氮雜)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羥基)-1，3-(二氮雜)-2-(氧代)吩嗪-1-基、7-(胍烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫代)-3-(氮雜)-吩嗪-1-基、7-(胍烷基-羥基)-1，3-(二氮雜)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫代)-3-(氮雜)吩噻嗪-1-基、1，3，5-(三氮雜)-2，6-(二氧雜)-萘、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、水粉蕈素、殺結(jié)核菌素、異鳥嘌呤核苷、肌苷基、2-氮雜-肌苷基、7-去氮雜-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)異喹諾酮基、5-(甲基)異喹諾酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)異喹諾酮基、7-(氮雜)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮雜)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基(pyrrolopyrizinyl)、異喹諾酮基、7-(丙炔基)異喹諾酮基、丙炔基-7-(氮雜)吲哚基、2，4，5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4，6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、茋基、并四苯基(tetracenyl)、并五苯基(pentacenyl)、二氟甲苯基(diiluorotolyl)、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5硝基吲哚、3硝基吡咯、6-(氮雜)嘧啶、2(氨基)嘌呤、2，6-(二氨基)嘌呤、5取代的嘧啶、n2-取代的嘌呤、n6-取代的嘌呤、06-取代的嘌呤、經(jīng)取代的1，2，4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、對(duì)位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、鄰位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、雙鄰位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、對(duì)-(氨基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、鄰-(氨基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、雙-鄰-(氨基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基、或者其任何o-烷基化或n-烷基化的衍生物。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以是嵌合寡核苷酸。本發(fā)明的嵌合反義化合物可以形成為如上所述的兩種或更多種寡核苷酸、經(jīng)修飾的寡核苷酸、寡核苷酸和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)。這樣的化合物在本領(lǐng)域中也被稱為雜合體或缺口體(gapmer)。特別地，缺口體是具有至少三個(gè)離散部分的寡核苷酸，所述離散部分中有兩個(gè)是相似的(即，包含一個(gè)或更多個(gè)主鏈修飾)并且包圍獨(dú)特的區(qū)域(即，不包含主鏈修飾)。寡核苷酸可以在一端或兩端(即在3’和/或5’端)包含分子物種。本文中使用的分子物種是指不是天然存在的核苷酸或是非天然存在的核苷酸的任何化合物。分子物種包括但不限于：間隔物、脂質(zhì)、固醇、例如膽固醇部分的脂質(zhì)部分、膽酸、例如己基-s-三苯甲基硫醇的硫醚、硫代膽固醇、例如十二烷二醇或十一烷基殘基的脂肪族鏈、例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨1，2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-h-膦酸酯的磷脂、多胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基膽固醇部分、硬脂基、c16烷基鏈、膽汁酸、膽酸、牛磺膽酸、脫氧膽酸、油烯基石膽酸、油酰基膽烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、例如類固醇的類異戊二烯、例如維生素e的維生素、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、例如甘油三酯的脂肪酸酯、芘、卟啉、德卟啉、金剛烷、吖啶、生物素、香豆素、熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、地高辛配基、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，cy3或cy576)、hoechst33258染料、補(bǔ)骨脂素或布洛芬。分子物種可以連接在寡核苷酸的多個(gè)位置。如上所述，所述分子物種可以與寡核苷酸的3’端或5’端連接，在此其還用于增強(qiáng)寡聚物針對(duì)3’-或5’-外切核酸酶的穩(wěn)定性的目的?；蛘?，其可以與內(nèi)部核苷酸或分支上的核苷酸連接。所述分子物種可以連接至核苷酸的2’-位。所述分子物種還可以與核苷酸的雜環(huán)堿基連接。所述分子物種可以通過接頭部分與寡核苷酸連接。任選地，所述接頭部分是非核苷酸接頭部分。非核苷酸接頭是例如無堿基殘基(dspacer)；低聚乙二醇，例如三乙二醇或六乙二醇；或者烷二醇，例如丁二醇。間隔物單元優(yōu)選地通過磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵連接。接頭單元可以在分子中僅出現(xiàn)一次，或者可以并入數(shù)次，例如通過磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或酰胺連接并入數(shù)次。本發(fā)明的寡核苷酸(獨(dú)立于使核苷酸與分子物種連接的接頭)還可以包含非核苷酸接頭，特別是無堿基接頭(dspacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元。另一些優(yōu)選的接頭是烷基氨基接頭，例如c3、c6、c12氨基接頭；以及烷基硫醇接頭，例如c3或c6硫醇接頭。tnfα在很多種tnfα相關(guān)病癥中發(fā)揮作用。本文中使用的tnfα病癥是指其中tnfα活性不利于對(duì)象中的特定生理功能的病癥。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“其中tnfα活性不利的病癥”旨在包括這樣的疾病和其他病癥：其中患有病癥之對(duì)象中表達(dá)的tnfα的水平在該病癥的病理生理學(xué)中發(fā)揮作用或者作為導(dǎo)致該病癥惡化或維持的因素發(fā)揮作用。因此，其中tnfα活性不利的病癥是預(yù)期抑制tnfα活性減輕該病癥的至少一種癥狀和/或發(fā)展或惡化的病癥。這樣的病癥可以例如通過患有該病癥之對(duì)象的生物流體中tnfα濃度的提高(例如，該對(duì)象的血清、血漿、滑液等中tnfα濃度的提高)來證實(shí)，其可例如使用分別用于檢測(cè)tnfα信息或蛋白質(zhì)的tnfα探針或抗tnfα抗體來檢測(cè)。所述tnfα病癥包括但不限于：膿毒癥、感染、自身免疫病、癌癥、移植排斥和移植物抗宿主病、移植排斥、惡性腫瘤、肺病、腸病、心臟病、膿毒癥、脊柱關(guān)節(jié)病、代謝病、貧血、疼痛、肝病、皮膚病、指甲病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、與銀屑病關(guān)節(jié)炎組合的銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、血管炎、白塞病、強(qiáng)直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、特發(fā)性肺纖維化(ipe)、再狹窄、糖尿病、貧血、疼痛、克羅恩病相關(guān)病癥、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(jra)、丙型肝炎病毒感染、銀屑病關(guān)節(jié)炎和慢性斑塊型銀屑病。tnfα在這些疾病中數(shù)種中的生物學(xué)作用在下文進(jìn)行描述。抑制這些疾病中的tnfα表達(dá)提供了用于所述病癥的治療性治療。tnfα在膿毒癥中發(fā)揮作用。生物學(xué)效應(yīng)包括低血壓、心肌抑制、血管滲漏綜合征、器官壞死、刺激毒性次級(jí)介質(zhì)的釋放和激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。tnfα已涉及自身免疫病，例如通過在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中激活組織炎癥和引起關(guān)節(jié)破壞、在糖尿病中促進(jìn)胰島細(xì)胞死亡和介導(dǎo)胰島素抗性、在多發(fā)性硬化中介導(dǎo)針對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)炎性斑塊、在多發(fā)性硬化中介導(dǎo)針對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)炎性斑塊、以及涉及克羅恩病的發(fā)生。在多種感染性疾病中觀察到的生物學(xué)效應(yīng)是由tnfα引起。例如，tnfα已涉及在瘧疾中介導(dǎo)腦炎癥和毛細(xì)血管血栓形成以及梗死；在腦膜炎中介導(dǎo)腦炎癥、誘導(dǎo)血腦屏障破壞、觸發(fā)膿毒性休克綜合征和激活靜脈性梗死；以及在獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids)中誘導(dǎo)惡病質(zhì)、刺激病毒增殖和介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。tnfα還被表明為同種異體移植排斥(allograftrejection)和移植物抗宿主病(graftversushostdisease，gvhd)的關(guān)鍵介質(zhì)，并且涉及介導(dǎo)已在使用針對(duì)t細(xì)胞受體cd3復(fù)合物的大鼠抗體okt3來抑制腎移植物排斥時(shí)觀察到的不良反應(yīng)。tnfα已涉及在惡性腫瘤中誘導(dǎo)惡病質(zhì)、刺激腫瘤生長(zhǎng)、增強(qiáng)轉(zhuǎn)移潛能和介導(dǎo)細(xì)胞毒性。肺病也與tnfα有關(guān)。例如，tnfα在成人型呼吸窘迫綜合征(adultrespiratorydistresssyndrome，ards)中發(fā)揮作用，包括刺激白細(xì)胞-內(nèi)皮活化、指導(dǎo)針對(duì)肺細(xì)胞的細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)血管滲漏綜合征。本發(fā)明的組合物可用于治療多種肺病，包括成人型呼吸窘迫綜合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、肺結(jié)節(jié)病、肺纖維化、硅肺病、特發(fā)性間質(zhì)性肺病和慢性阻塞性氣道病。慢性阻塞性氣道病的實(shí)例包括哮喘和慢性阻塞性肺病(copd)。包括克羅恩病的炎性腸病也與tnf有關(guān)。克羅恩病相關(guān)病癥的實(shí)例包括膀胱、陰道和皮膚中的瘺，腸梗阻，膿腫，營(yíng)養(yǎng)缺乏，來自使用皮質(zhì)類固醇的并發(fā)癥，關(guān)節(jié)炎癥，結(jié)節(jié)性紅斑，壞疽性膿皮病，以及眼部病變。tnfα在心臟或冠狀動(dòng)脈病癥中(包括心臟局部缺血)發(fā)揮作用。其中tnfα活性不利的心臟病旨在包括這樣的冠狀動(dòng)脈和心血管疾病：其中患有病癥的對(duì)象中tnfα的存在已被表明或被懷疑導(dǎo)致該病癥的病理生理學(xué)或者是導(dǎo)致該病癥惡化的因素，所述病癥包括例如再狹窄的心血管病。這些病癥是指涉及心血管系統(tǒng)(例如，心臟、血管和/或血液)的任何疾病、病癥或狀態(tài)。心血管病的實(shí)例包括但不限于冠狀動(dòng)脈疾病、心絞痛、心肌梗死、由心臟停搏引起的心血管組織損傷、由心臟旁路引起的心血管組織損傷、心源性休克、以及高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈痙攣、冠狀動(dòng)脈疾病、瓣膜病、心律失常、以及心肌病。例如脊柱關(guān)節(jié)病的炎性疾病也因tnfα而加重。脊柱關(guān)節(jié)病是指影響脊柱關(guān)節(jié)的數(shù)種疾病中的任一種，其中這樣的疾病共有共同的臨床、放射學(xué)和組織學(xué)特征。例如糖尿病和肥胖的代謝病已與tnfα相關(guān)。術(shù)語(yǔ)代謝病是指影響身體如何處理進(jìn)行生理功能所需的物質(zhì)的疾病或病癥。糖尿病的實(shí)例包括1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病性神經(jīng)病、外周神經(jīng)病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性潰瘍、視網(wǎng)膜病性潰瘍、糖尿病性大血管病(diabeticmacrovasculopathy)和肥胖。tnfα已涉及貧血的發(fā)生。貧血是血液中循環(huán)紅細(xì)胞的數(shù)量異常低或血紅蛋白的濃度降低。與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的貧血的實(shí)例包括例如慢性病性貧血、缺鐵性貧血和自身免疫性溶血性貧血。tnfα還已涉及很多種疼痛綜合征。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“疼痛”是指包括急性和慢性疼痛在內(nèi)的所有類型的疼痛，例如神經(jīng)性疼痛和術(shù)后疼痛、慢性下背疼痛、叢集性頭痛、皰疹性神經(jīng)痛、幻肢痛、中樞性疼痛、牙痛、抗阿片樣物質(zhì)性疼痛、內(nèi)臟痛、手術(shù)性疼痛、骨損傷疼性痛、分娩痛、由燒傷(包括曬傷)引起的疼痛、產(chǎn)后疼痛、偏頭痛、心絞痛、以及包括膀胱炎的泌尿生殖道相關(guān)疼痛。該術(shù)語(yǔ)還包括傷害性疼痛或傷害感受。肝病還與tnfα有關(guān)。肝病包括這樣的肝的疾病和其他病癥或與肝細(xì)胞損傷相關(guān)的病癥或膽道病癥：其中患有病癥的對(duì)象中tnfα的存在已被表明或被懷疑導(dǎo)致該病癥的病理生理學(xué)或者是導(dǎo)致該病癥惡化的因素。肝病包括與肝細(xì)胞損傷相關(guān)的病癥，包括酒精性肝硬化、α1抗胰蛋白酶缺乏、自身免疫性肝硬化、隱源性肝硬化、暴發(fā)型肝炎、乙型和丙型肝炎、以及脂肪性肝炎。膽道病癥的實(shí)例包括囊性纖維化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎和膽道梗阻。tnfα已涉及皮膚和指甲病。皮膚病是指涉及炎癥的皮膚的除損傷性創(chuàng)傷之外的異常。皮膚病的實(shí)例包括但不限于銀屑病、尋常型天皰瘡、硬皮病、特應(yīng)性皮炎、結(jié)節(jié)病、結(jié)節(jié)性紅斑、化膿性汗腺炎、扁平苔蘚、sweet綜合征(sweet′ssyndrome)和白癜風(fēng)。tnfα已涉及血管炎，其是一組以血管的炎癥為特征的病癥。其中tnfα活性不利的血管炎的實(shí)例包括但不限于：白塞病，大血管疾病例如巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、風(fēng)濕性多肌痛和高安病(takayasu’sdisease)或動(dòng)脈炎，中血管疾病例如經(jīng)典結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎和川崎病(kawasaki’sdisease)，或者小血管疾病例如白塞綜合征(behcet’ssyndrome)、韋格納肉芽腫病(wegner′sgranulomatosis)、顯微鏡下多血管炎(microscopicpolyangitis)、超敏性血管炎、小血管性血管炎、henoch-schonlein紫癜、變應(yīng)性肉芽腫病和血管炎，以及孤立性中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎，以及血栓閉塞性血管炎。其中tnfα活性不利的多種其他病癥包括但不限于：幼年型關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位、前列腺炎、脈絡(luò)膜新血管形成、坐骨神經(jīng)痛、舍格倫綜合征(sjogren’ssyndrome)、葡萄膜炎、濕性黃斑變性(wetmaculardegeneration)、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、炎性骨病、骨吸收疾病、凝血障礙、燒傷、再灌注損傷、瘢痕疙瘩形成、瘢痕組織形成、發(fā)熱、牙周病、肥胖、輻射毒性、年齡相關(guān)性惡病質(zhì)、阿爾茨海默病(alzheimer′sdisease)、腦水腫、炎性腦損傷、癌癥、慢性疲勞綜合征、皮肌炎、例如史-約綜合征(stevens-johnsonsyndrome)和雅-赫反應(yīng)(jarisch-herxheimerreaction)的藥物反應(yīng)、脊髓中和/或脊髓周圍的水腫、家族性周期性發(fā)熱、費(fèi)爾蒂綜合征(felty’ssyndrome)、纖維化、腎小球腎炎(glomerulonephritides)(例如鏈球菌感染后腎小球腎炎或iga腎病)、假體松動(dòng)、顯微鏡下多血管炎、混合性結(jié)締組織病、多發(fā)性骨髓瘤、癌癥和惡病質(zhì)、多器官障礙、骨髓增生異常綜合征、orchitism骨質(zhì)溶解、胰腺炎(包括急性、慢性和胰腺膿腫)、多肌炎、進(jìn)行性腎衰竭、假痛風(fēng)、壞疽性膿皮病、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、風(fēng)濕性心臟病、結(jié)節(jié)病、硬化性膽管炎、卒中、胸腹主動(dòng)脈瘤修復(fù)(thoracoabdominalaorticaneurysmrepair，taaa)、tnf受體相關(guān)性周期性綜合征(tnfreceptorassociatedperiodicsyndrome，traps)、與黃熱病(yellowfever)疫苗接種相關(guān)的癥狀、與耳相關(guān)的炎性疾病、慢性耳炎、具有或不具有膽脂瘤的慢性中耳炎、兒科耳炎癥、肌炎(myotosis)、卵巢癌、結(jié)直腸癌、與治療相關(guān)的誘導(dǎo)性炎性綜合征(例如，il-2施用后的綜合征)、以及與再灌注損傷相關(guān)的病癥。寡核苷酸可以單獨(dú)施用或者與用于治療tnfα病癥的其他治療劑聯(lián)合施用。可與本發(fā)明的tnfα抑制劑組合的治療劑的非限制性實(shí)例包括以下：非甾體抗炎藥(non-steroidalanti-inflammatorydrug，nsaid)；細(xì)胞因子抑制性抗炎藥(cytokinesuppressiveanti-inflammatorydrug，csaid)；cdp-571/bay-10-3356(人源化抗tnfα抗體；celltech/baver)；ca2/英夫利昔單抗(嵌合抗tnfα抗體；centocor)；75kdtnfr-igg/依那西普(75kdtnf受體-igg融合蛋白；immunex；55kdtnf-igg(55kdtnf受體-igg融合蛋白；hoffmann-laroche)；idec-ce9/sb210396(非消耗性靈長(zhǎng)類源化的抗-cd4抗體；idec/smithkline；dab486-il-2和/或dab389-il-2(il-2融合蛋白；seragen；抗tac(人源化抗il-2rα；proteindesignlabs/roche)；il-4(抗炎性細(xì)胞因子；dnax/schering)；il-10(sch52000；重組il-10、抗炎性細(xì)胞因子；dnax/schering)；il-4；il-10和/或il-4激動(dòng)劑(例如，激動(dòng)劑抗體)；il-1ra(il-1受體拮抗劑；synergen/amgen)；阿那白滯素(kineret/amgen)；tnf-bp/s-tnf(可溶性tnf結(jié)合蛋白)；r973401(磷酸二酯酶iv型抑制劑)；mk-966(cox-2抑制劑)；伊洛前列素；甲氨蝶呤；沙利度胺和沙利度胺相關(guān)藥物(例如，celgen)；來氟米特(抗炎和細(xì)胞因子抑制劑)；氨甲環(huán)酸(纖溶酶原激活抑制劑)；t-614(細(xì)胞因子抑制劑)；前列腺素e1；替尼達(dá)普(非甾體抗炎藥)；萘普生(非甾體抗炎藥)；美洛昔康(非甾體抗炎藥)；布洛芬(非甾體抗炎藥)；吡羅昔康(非甾體抗炎藥)；雙氯芬酸(非甾體抗炎藥)；吲哚美辛(非甾體抗炎藥)；柳氮磺吡啶；硫唑嘌呤；ice抑制劑(酶白介素-1-β-轉(zhuǎn)化酶的抑制劑)；zap-70和/或ick抑制劑(酪氨酸激酶zap-70或ick的抑制劑)；vegf抑制劑和/或vegf-r抑制劑(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的抑制劑；血管發(fā)生抑制劑)；皮質(zhì)類固醇抗炎藥(例如，sb203580)；tnf-轉(zhuǎn)化酶抑制劑；抗il-12抗體；抗il-18抗體；白介素-11；白介素-13；白介素-17抑制劑；金；青霉胺；氯喹；羥氯喹；苯丁酸氮芥；環(huán)孢素；環(huán)磷酰胺；全淋巴照照；抗胸腺細(xì)胞球蛋白；抗cd4抗體；cd5毒素；經(jīng)口施用的肽和膠原；氯苯扎利二鈉；細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑(cytokineregulatingagent，cra)hp228和hp466(houghtenpharmaceuticals，inc.)；icam-1反義硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸(isis2302；isispharmaceuticals，inc.)；可溶性補(bǔ)體受體1(tp10；tcellsciences，inc.)；潑尼松；奧古蛋白；糖胺聚糖多硫酸鹽；米諾環(huán)素；抗il2r抗體；海洋和植物脂質(zhì)(魚和植物種子脂肪酸)；金諾芬；保泰松；甲氯滅酸；氟滅酸；靜脈內(nèi)免疫球蛋白；齊留通(zileuton)；阿扎立平(azaribine)；霉酚酸(rs-61443)；他克莫司(fk-506)；西羅莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(amiprilose，therafectin)；克拉屈濱(2-氯脫氧腺苷)；甲氨蝶呤；抗病毒劑；以及免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的預(yù)防和/或治療方案的毒性和效力可在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中通過標(biāo)準(zhǔn)藥物操作來確定，例如用于確定lds0(對(duì)群體中的50％致死的劑量)和ed50(在群體中的50％中治療有效的劑量)。毒性與治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，并且其可以表示為ld50/ed50比。顯示出大治療指數(shù)的預(yù)防劑和/或治療劑是優(yōu)選的。盡管可以使用表現(xiàn)出毒性副作用的預(yù)防劑和/或治療劑，但應(yīng)加以小心以設(shè)計(jì)將這樣的藥劑靶向至受影響組織的部位的遞送系統(tǒng)以使對(duì)未受感染細(xì)胞的潛在損害最小化并且從而降低副作用。在配制供人使用的預(yù)防劑和/或治療劑的一系列劑量中可使用由細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)。這樣的藥劑的劑量?jī)?yōu)選地落在包括ed50且具有很少毒性或沒有毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。根據(jù)所使用的劑型和所利用的施用途徑，劑量可以在該范圍內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明方法中使用的任何藥劑，均可最初由細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定評(píng)估治療有效劑量。如在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的，可以在動(dòng)物模型中制定劑量以實(shí)現(xiàn)包括ic50(即，實(shí)現(xiàn)癥狀的半最大抑制的受試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這樣的信息可用于更精確地確定在人中的可用劑量。血漿中的水平可以例如通過高效液相色譜來測(cè)量。眾多研究已對(duì)反義寡核苷酸的最佳劑量進(jìn)行了檢測(cè)。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可以包含例如至少約0.1％的活性化合物。在另一些實(shí)施方案中，所述活性化合物可以占單位重量的約2％至約75％、或例如約25％至約60％，以及可從其中推導(dǎo)的任何范圍。本文中所述的化合物的對(duì)象劑量的范圍通常為約0.1μg至10,000mg、更通常約1μg/天至8000mg并且最通常約10μg至100μg。根據(jù)對(duì)象的體重而言，每次施用的通常劑量的范圍為約1微克/kg/體重、約5微克/kg/體重、約10微克/kg/體重、約50微克/kg/體重、約100微克/kg/體重、約200微克/kg/體重、約350微克/kg/體重、約500微克/kg/體重、約1毫克/kg/體重、約5毫克/kg/體重、約10毫克/kg體重、約50毫克/kg/體重、約100毫克/kg/體重、約200毫克/kg/體重、約350毫克/kg/體重、約500毫克/kg/體重、至約1000mg/kg/體重或更多，以及可從其中推導(dǎo)的任何范圍。在可從本文中所列舉數(shù)值推導(dǎo)的范圍的一些非限制性實(shí)例中，基于上述數(shù)值，可施用約5mg/kg/體重至約100mg/kg/體重、約5微克/kg/體重至約500毫克/kg/體重等的范圍。絕對(duì)量將取決于多種因素，包括并行治療、劑量數(shù)量和個(gè)體患者參數(shù)(包括年齡、身體狀況、體型大小和體重)。這些是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的因素并且僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可解決。一般優(yōu)選的是，使用最大劑量，即，根據(jù)合理醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。本發(fā)明分子的多個(gè)劑量也在考慮之內(nèi)。在一些情況下，當(dāng)本發(fā)明的分子與另一種治療劑(例如抗炎劑)一起施用時(shí)，在治療患有tnfα病癥或處于其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之中的對(duì)象中使用所述分子或另一種藥劑的亞治療劑量或者二者的亞治療劑量。當(dāng)兩類藥物一起使用時(shí)，可以以亞治療劑量施用另一種藥劑以產(chǎn)生期望的治療結(jié)果。本文中使用的“亞治療劑量”是指小于如果在不存在另一種藥劑下施用在對(duì)象中產(chǎn)生治療結(jié)果之劑量的劑量。因此，治療劑的亞治療劑量是在不存在施用本發(fā)明分子下在對(duì)象中不產(chǎn)生期望的治療結(jié)果的劑量?？捎糜谥委焧nfα病癥的藥劑的治療劑量是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的。這些劑量已廣泛地描述于例如remington’spharmaceuticalsciences的參考文獻(xiàn)，以及醫(yī)學(xué)界所依據(jù)的作為用于治療感染性疾病、癌癥和自身免疫病之指導(dǎo)的很多其他醫(yī)學(xué)參考文獻(xiàn)。寡核苷酸的治療劑量也已在本領(lǐng)域中描述。給藥方案可以是一天數(shù)次、每天、每隔一天、每周、每?jī)芍?、其間的任何時(shí)間或更低頻率。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“每?jī)芍芙o藥”是指每?jī)芍芤淮蔚叵驅(qū)ο笫┯梦镔|(zhì)(例如，抗tnfα核酸)的時(shí)間過程?？梢岳缑?至20天、每11至17天或每13至15天施用寡核苷酸。寡核苷酸以有效量施用。本發(fā)明化合物在治療本文中所述的疾病中的有效量可以根據(jù)所使用的具體化合物、化合物的遞送模式以及其是單獨(dú)使用還是組合使用而變化。用于任何特定應(yīng)用的有效量也可根據(jù)例如所治療的疾病、所施用的具體化合物、對(duì)象的體型大小或者疾病或病癥的嚴(yán)重程度等因素而變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定本發(fā)明的特定分子的有效量，而不需要過度實(shí)驗(yàn)。結(jié)合本文中提供的教導(dǎo)，通過在多種活性化合物中選擇并權(quán)衡例如效力、相對(duì)生物利用度、患者體重、不良副作用的嚴(yán)重程度和優(yōu)選施用模式的因素，可以設(shè)計(jì)不引起顯著毒性并且仍對(duì)治療特定對(duì)象完全有效的有效預(yù)防性或治療性治療方案。如本文中更詳細(xì)描述的，本文中所述的寡核苷酸在本發(fā)明的檢測(cè)和治療方法中可單獨(dú)使用或與其他分子(例如檢測(cè)劑或細(xì)胞毒劑)結(jié)合使用。寡核苷酸可以例如與可檢測(cè)的標(biāo)記偶聯(lián)或綴合?？蓹z測(cè)的標(biāo)記是可以直接或間接確定其存在的部分。一般來說，標(biāo)記的檢測(cè)涉及標(biāo)記的能量發(fā)射。標(biāo)記可通過其發(fā)射和/或吸收特定波長(zhǎng)的光子或其他原子粒子(例如放射性、發(fā)光、光學(xué)或電子密度等)的能力來直接檢測(cè)。標(biāo)記可通過其結(jié)合、募集和在一些情況下切割自身可以發(fā)射或吸收特定波長(zhǎng)的光的另一部分(例如，例如flag表位的表位標(biāo)簽、例如辣根過氧化物酶的酶標(biāo)簽等)的能力來間接檢測(cè)。間接檢測(cè)的一個(gè)實(shí)例是使用將底物切割成可見產(chǎn)物的第一酶標(biāo)記。標(biāo)記可以具有化學(xué)、肽或核酸分子性質(zhì)，但是其不限于此。其他可檢測(cè)的標(biāo)記包括例如p32或h3的放射性同位素、例如熒光染料的發(fā)光標(biāo)志物、光學(xué)或電子密度標(biāo)志物等；或者例如flag表位或ha表位的表位標(biāo)簽，生物素，親和素，以及酶標(biāo)簽(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)。所述標(biāo)記可以在寡核苷酸的合成期間或之后與其結(jié)合。存在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的很多不同的標(biāo)記和標(biāo)記方法?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記類型的實(shí)例包括酶、放射性同位素、熒光化合物、膠體金屬、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知曉用于本文中所述的寡核苷酸的其他合適標(biāo)記，或者將能夠使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定這樣的標(biāo)記。此外，這些標(biāo)記與本發(fā)明寡核苷酸的偶聯(lián)或綴合可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)行。除其他方面之外，寡核苷酸與可檢測(cè)標(biāo)記的綴合還有利于在診斷測(cè)定中使用這樣的試劑。另一類別的可檢測(cè)標(biāo)記包括診斷和成像標(biāo)記(通常被稱為體內(nèi)可檢測(cè)標(biāo)記)，例如，例如磁共振成像(magneticresonanceimaging，mri)：gd(dota)；對(duì)于核醫(yī)學(xué)：201tl，γ發(fā)射放射性核素99mtc；對(duì)于正電子發(fā)射斷層攝影(positron-emissiontomography，pet)：正電子發(fā)射同位素(18)f-氟脫氧葡萄糖((18)fdg)、(18)f-氟化物、銅-64、釓雙胺和pb(ii)的放射性同位素(例如203pb)；111in。在這樣的一些情況下，當(dāng)寡核苷酸提供反義效應(yīng)時(shí)，可觀察到寡核苷酸的使用。本文中描述的綴合或修飾使用常規(guī)化學(xué)，所述化學(xué)不構(gòu)成本發(fā)明的一部分并且所述化學(xué)是化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人公知的。保護(hù)基和已知接頭(例如單-和異-雙功能接頭)的使用在文獻(xiàn)中有充分記載，并且在此不再贅述。本文中使用的“綴合的”意指通過任何物理化學(xué)方式彼此穩(wěn)定結(jié)合的兩個(gè)實(shí)體。重要的是，連接的性質(zhì)為使得其不會(huì)顯著損害任一實(shí)體的有效性?？紤]到這些參數(shù)，可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何共價(jià)或非共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選共價(jià)連接。非共價(jià)綴合包括疏水相互作用、離子相互作用、例如生物素-親和素和生物素-鏈霉親和素絡(luò)合的高親和力相互作用以及其他親和力相互作用。這樣的連接方式和方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。根據(jù)標(biāo)記和其他測(cè)定組分的性質(zhì)，可以使用多種方法來檢測(cè)標(biāo)記。本發(fā)明的藥物組合物包含有效量的溶解或分散在可藥用載體中的一種或更多種藥劑。短語(yǔ)“可藥用的或藥理學(xué)上可接受的”是指當(dāng)施用于動(dòng)物(例如，例如人)(適當(dāng)時(shí))時(shí)不產(chǎn)生不利的、變應(yīng)性的或其他不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。此外，對(duì)于動(dòng)物(例如，人)施用，應(yīng)當(dāng)理解，制劑應(yīng)滿足fda生物標(biāo)準(zhǔn)局(fdaofficeofbiologicalstandards)所要求的無菌性、致熱原性、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。該化合物通常適合施用于人。該術(shù)語(yǔ)要求，化合物或組合物無毒且足夠純，使得在施用于人之前不需要對(duì)化合物或組合物進(jìn)行進(jìn)一步操作。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，本文中使用的“可藥用載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細(xì)菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、矯味劑、染料、諸如此類的材料及其組合(參見，例如remington’spharmaceuticalsciences(1990)，其通過引用并入本文)。除非任何常規(guī)載體與活性成分不相容，否則其在治療性或藥物組合物中的使用均在考慮之內(nèi)。藥劑可以包含不同類型的載體，這取決于其是否將以固體、液體或氣霧劑形式施用，以及其是否需要是無菌的(對(duì)于例如注射這樣的施用途徑)。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，本發(fā)明可如下施用：靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、病灶內(nèi)、瘤內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、表面、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、囊內(nèi)(intravesicularlly)、經(jīng)黏膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)口、表面、局部、吸入(例如，氣霧劑吸入)、注射、輸注、連續(xù)輸注、直接浸浴靶細(xì)胞的局部灌注、通過導(dǎo)管、通過灌洗、在乳膏中、在脂質(zhì)組合物(例如，脂質(zhì)體)中、或者通過其他方法或前述的任意組合(參見，例如remington’spharmaceuticalsciences，通過引用并入本文)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，考慮腹膜內(nèi)注射。在任何情況下，所述組合物均可以包含多種抗氧化劑以延緩一種或更多種組分的氧化。另外，可通過防腐劑來實(shí)現(xiàn)防止微生物的作用，所述防腐劑例如多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，包括但不限于對(duì)羥基苯甲酸酯(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。藥劑可以被配制成游離堿、中性或鹽形式的組合物?？伤幱名}包括酸加成鹽，例如，與蛋白質(zhì)組合物的游離氨基形成的那些，或者與例如如鹽酸或磷酸的無機(jī)酸或者與例如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸的有機(jī)酸形成的酸加成鹽。與游離羧基形成的鹽還可來自于例如鈉、鉀、銨、鈣或鐵氫氧化物的無機(jī)堿，或者例如異丙胺、三甲胺、組氨酸或普魯卡因的有機(jī)堿。在組合物為液體形式的一些實(shí)施方案中，載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、脂質(zhì)(例如，甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)及其組合?？衫缫韵聛砭S持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性：通過使用包衣，例如卵磷脂；通過分散在載體(例如，如液體多元醇或脂質(zhì))中來維持所需的顆粒尺寸；通過使用表面活性劑(例如羥丙基纖維素)；或者這樣的方法的組合。在很多情況下，將優(yōu)選地包含等張劑，例如糖、氯化鈉或其組合。本發(fā)明的化合物可直接施用于組織。直接組織施用可以通過直接注射來實(shí)現(xiàn)。化合物可以施用一次，或者作為替代地其可以以多次施用來施用。如果多次施用，可以通過不同的途徑來施用化合物。例如，第一次(前幾次)施用可直接針對(duì)受影響的組織，而后續(xù)施用可以是全身性的。本發(fā)明的制劑以可藥用溶液施用，所述溶液常規(guī)地可包含可藥用濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容性載體、輔料和任選地其他治療性成分。根據(jù)本發(fā)明的方法，化合物可以以藥物組合物施用。一般來說，藥物組合物包含本發(fā)明的化合物和可藥用載體。本文中使用的可藥用載體意指不干擾活性成分的生物活性的有效性的無毒材料?？伤幱幂d體包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑以及本領(lǐng)域公知的其他材料。這樣的制劑可以常規(guī)地包含鹽、緩沖劑、防腐劑、相容性載體和任選地其他治療劑。當(dāng)用于藥物時(shí)，鹽應(yīng)當(dāng)為可藥用的，但是不可藥用的鹽可以方便地用于制備其可藥用鹽并且不被排除在本發(fā)明的范圍之外。這樣的藥理學(xué)上和藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于由以下酸制備的那些：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。另外，可將可藥用鹽制備為堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉、鉀或鈣的鹽。本發(fā)明的化合物可以被配制成固體、半固體、液體或氣態(tài)形式的制劑，例如片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、儲(chǔ)庫(kù)(depository)、吸入劑和注射劑，以及用于經(jīng)口、腸胃外或外科手術(shù)施用的常用方式。本發(fā)明還包括配制用于局部施用(例如通過植入物)的藥物組合物。適用于經(jīng)口施用的組合物可以作為各自包含預(yù)定量活性劑的離散單元提供，例如膠囊劑、片劑、錠劑。另一些組合物包括在水性液體或非水性液體中的混懸劑，例如糖漿劑、酏劑或乳劑。對(duì)于經(jīng)口施用，可以通過將活性化合物與本領(lǐng)域公知的可藥用載體組合來容易地配制化合物。這樣的載體使得能夠?qū)⒈景l(fā)明的化合物配制成用于待治療對(duì)象經(jīng)口攝取的片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊劑、液體、凝膠劑、糖漿劑、漿體(slurry)、混懸劑等。用于經(jīng)口使用的藥物制劑可如下作為固體賦形劑獲得：在添加合適的助劑(如果期望的話，獲得片劑或糖衣丸核心的合適助劑)之后，任選地研磨所得混合物，并對(duì)顆粒混合物進(jìn)行加工。合適的賦形劑特別地是填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果期望的話，可以添加崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或者藻酸或其鹽(例如藻酸鈉)。任選地，經(jīng)口制劑還可以在鹽水或緩沖劑中配制以中和內(nèi)部酸性條件或者可以在無任何載體下施用。糖衣丸核心被提供合適的包衣。出于此目的，可以使用濃縮的糖溶液，其可以任選地包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠(carbopolgel)、聚乙二醇、和/或二氧化鈦、漆溶液(lacquersolution)、以及合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？上蚱瑒┗蛱且峦璋绿砑尤玖?dyestuff)或顏料(pigment)以用于識(shí)別或以表征活性化合物劑量的不同組合?？梢越?jīng)口使用的藥物制劑包括由明膠制成的推入式膠囊劑(push-fitcapsule)，以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制成的軟的密封膠囊劑。推入式膠囊劑可包含與填充劑(例如乳糖)、黏合劑(例如淀粉)和/或潤(rùn)滑劑(例如滑石或硬脂酸鎂)以及任選地穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊劑中，活性化合物可以溶解或混懸在合適的液體(例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇)中。另外，可以添加穩(wěn)定劑。還可以使用配制用于經(jīng)口施用的微球。這樣的微球已在本領(lǐng)域中充分限定。用于經(jīng)口施用的所有制劑均應(yīng)為適于這樣的施用的劑量。對(duì)于口含施用，組合物可以采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。對(duì)于通過吸入施用，根據(jù)本發(fā)明使用的化合物可以方便地通過使用合適的拋射劑以由加壓包裝或噴霧器提供的氣霧噴霧劑的形式遞送，所述拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可以通過設(shè)置遞送計(jì)量量的閥來確定。在吸入器或吹入器中使用的(例如明膠的)膠囊和藥筒可以被配制成包含化合物和合適粉末基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。用于制備氣霧劑遞送系統(tǒng)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。一般來說，這樣的系統(tǒng)應(yīng)使用不會(huì)顯著損害活性劑的生物特性的組分(參見，例如，sciarra和cutie，remington’spharmaceuticalsciences中的“aerosols”)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定用于產(chǎn)生氣霧劑的不同參數(shù)和條件，而無需進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)?；衔锂?dāng)期望將其全身遞送時(shí)可以被配制成用于通過注射(例如通過推注或連續(xù)輸液)腸胃外施用。注射用制劑可以以單位劑量形式存在，例如存在于其中添加有防腐劑的安瓿或多劑量容器中。組合物可以采用例如在油性或水性載劑中的混懸劑、溶液劑或乳劑的形式，并且可以包含配制劑，例如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于腸胃外施用的制劑包括無菌的水性或非水性溶液劑、混懸劑和乳劑。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)和可注射的有機(jī)酯(例如油酸乙酯)。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或混懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載劑包括氯化鈉溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸化林格液或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載劑包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于林格右旋糖的那些)等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。其他施用形式(例如靜脈內(nèi)施用)將導(dǎo)致較低的劑量。如果在施用的初始劑量下對(duì)象中的應(yīng)答不足，則可以在患者耐受性許可的范圍內(nèi)使用更高的劑量(或通過不同的更局部化的遞送途徑的有效更高劑量)?？紤]每天多個(gè)劑量以實(shí)現(xiàn)化合物的合適全身水平。本發(fā)明的組合物可以配制在用于施用于皮膚或體腔的表面組合物中。合適的表面載劑和載劑組分是化妝品和制藥領(lǐng)域中公知的，并且包括例如以下載劑(或載劑組分)：水；有機(jī)溶劑，例如醇(特別是能夠容易從皮膚中蒸發(fā)的低級(jí)醇，例如乙醇)、二醇(例如丙二醇、丁二醇和甘油)、脂肪族醇(例如羊毛脂)；水與有機(jī)溶劑的混合物(例如水和醇)，以及有機(jī)溶劑的混合物(例如醇和甘油)(任選地還有水)；基于脂質(zhì)的材料，例如脂肪酸、酰基甘油(包括油，例如礦物油、以及天然或合成來源的脂肪)、磷酸甘油酯、鞘脂和蠟；基于蛋白質(zhì)的材料，例如膠原和明膠；基于硅酮的材料(非揮發(fā)性和揮發(fā)性二者)，例如環(huán)甲硅脂(cyclomethicone)、聚二甲基硅氧烷醇(demethiconol)和聚二甲基硅氧烷共聚多元醇(dimethiconecopolyol)(dowcorning)；基于烴的材料，例如礦脂和角鯊?fù)?；陰離子、陽(yáng)離子和兩性表面活性劑和皂；緩釋載劑，例如微海綿和聚合物基質(zhì)；穩(wěn)定劑和助懸劑；乳化劑；以及適合施用于皮膚的其他載劑和載劑組分，以及如上鑒定或本領(lǐng)域另外已知的表面用載劑組分的混合物。載劑還可以包括適于提高所施用制劑的穩(wěn)定性或有效性的組分，例如防腐劑、抗氧化劑、皮膚滲透增強(qiáng)劑、緩釋材料等。這樣的載劑和載劑組分的實(shí)例是本領(lǐng)域公知的并且描述于例如martindale-theextrapharmacopoeia(pharmaceuticalpress，london1993)和martin(編輯)，remington’spharmaceuticalsciences的參考著作中。合適載劑的選擇將取決于制劑要實(shí)現(xiàn)的具體物理形式和遞送模式。合適形式的實(shí)例包括液體(例如，含漱劑和漱口劑，包括鍶陽(yáng)離子的溶解形式以及混懸劑、乳劑等)；固體和半固體，例如凝膠劑、泡沫劑、糊劑、乳膏劑、軟膏劑、“棒劑(stick)”(如唇膏或腋下除臭劑棒)、散劑等；包含脂質(zhì)體或其他遞送囊泡的制劑；直腸或陰道栓劑、乳膏劑、泡沫劑、凝膠劑或軟膏劑；以及其他形式。典型的遞送模式包括使用手指施加；使用物理施加器例如布、紙巾、拭子、棒或刷子施加(如通過在臨施加之前用制劑浸泡施加器，或者通過將準(zhǔn)備的已包含制劑的施加器施加或附著至皮膚，所述施加器例如經(jīng)處理或預(yù)潤(rùn)濕的繃帶、擦拭物、毛巾或棒)；噴霧(包括霧、氣霧劑或泡沫噴霧)；滴管(dropper)施加(例如用滴耳劑)；撒布(如用制劑的合適粉末形式)；以及浸泡。表面用制劑還包括用于直腸和陰道施用的制劑。用于直腸施用的制劑可以作為具有包含例如可可豆脂的合適基質(zhì)的栓劑提供。適于陰道施用的制劑可以作為片劑、陰道栓劑(pessary)、塞(tampon)、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑提供，所述制劑除活性成分之外還包含例如本領(lǐng)域已知的合適的載體。在又一些實(shí)施方案中，遞送載劑是生物相容性的微粒或適于植入到哺乳動(dòng)物接受者中的植入物。另一些遞送系統(tǒng)可包括時(shí)間釋放、遲釋或緩釋遞送系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)可避免重復(fù)施用化合物，提高對(duì)象和醫(yī)生的便利性。很多類型的釋放遞送系統(tǒng)均是可獲得的并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。其包括聚合物基質(zhì)系統(tǒng)，例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯/鹽(copolyoxalate)、聚己內(nèi)酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羥基丁酸和聚酐。在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的反義核酸配制為穩(wěn)定的自組裝納米結(jié)構(gòu)。所述納米結(jié)構(gòu)包含tnfα反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸與核心締合。所述核心可以是實(shí)心或空心的核心，例如脂質(zhì)體核心。實(shí)心核心是不具有空心中心的球形材料。本文中使用的術(shù)語(yǔ)球形是指一般形狀并且不意指或不限于完美的球體或圓形。其可以包括缺陷。實(shí)心核心可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的很多種材料構(gòu)建，所述材料包括但不限于：貴金屬(金、銀)、過渡金屬(鐵、鈷)和金屬氧化物(二氧化硅)。此外，這些核心可以是惰性的、順磁性的或超順磁性的。這些實(shí)心核心可以由所述材料的純組合物、或任意數(shù)量的材料的混合物的組合、或材料的分層組合物構(gòu)建。此外，實(shí)心核心可以由聚合物核心構(gòu)成，所述聚合物核心例如兩親性嵌段共聚物，疏水性聚合物例如聚苯乙烯、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚(乙醇酸)、聚(己內(nèi)酯)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他生物相容性聚合物?；蛘?，核心可以是空心核心，其在殼材料的中心區(qū)域中具有至少一些空間?？招暮诵陌ㄖ|(zhì)體核心。本文中使用的脂質(zhì)體核心是指由形成脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)或磷脂組分形成的位于中心的核心隔室?！爸|(zhì)體”是多種尺寸和結(jié)構(gòu)的人造的自封閉的囊狀結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)或數(shù)個(gè)膜包封水性核心。最典型的脂質(zhì)體膜由脂質(zhì)雙層膜形成，其中親水性頭基朝向水性環(huán)境取向，而脂質(zhì)鏈嵌入親脂性核心中。脂質(zhì)體也可以由其他兩親性單體和聚合物分子(例如聚合物，如嵌段共聚物或多肽)形成。單層囊泡是由包圍水性空間的單膜限定的脂質(zhì)體。相比之下，寡-或多層囊泡由數(shù)個(gè)膜構(gòu)建。通常來說，膜為約4nm厚并且由天然或合成來源的兩親性脂質(zhì)(例如磷脂)構(gòu)成。任選地，可通過并入其他脂質(zhì)(如固醇或膽酸衍生物)來對(duì)膜性質(zhì)進(jìn)行改進(jìn)。脂質(zhì)雙層由兩層脂質(zhì)分子構(gòu)成。層中的每個(gè)脂質(zhì)分子基本上與相鄰的脂質(zhì)雙層平行取向，并且形成雙層的兩個(gè)層具有其分子暴露于水相的極性末端和彼此相鄰的非極性末端。脂質(zhì)體核心的中心水性區(qū)域可以是空的或者完全或部分填充有水、水性乳劑、寡核苷酸或者其他治療劑或診斷劑?！爸|(zhì)”是指其作為通用術(shù)語(yǔ)的常規(guī)意義，包括不溶于水的脂肪、脂質(zhì)、原生質(zhì)的醇-醚可溶性成分。脂質(zhì)通常由親水性和疏水性部分組成。在水中，脂質(zhì)可以自組織以形成雙層膜，其中親水性部分(頭基)朝向水相取向，而親脂性部分(?；?嵌入雙層核心。脂質(zhì)也可以包含兩個(gè)親水性部分(雙頭基兩親物(bolaamphiphile))。在這種情況下，膜可以由單個(gè)脂質(zhì)層而不是雙層形成。當(dāng)前背景下的脂質(zhì)的典型實(shí)例是脂肪、脂肪油、精油、蠟、類固醇、固醇、磷脂、糖脂、硫脂、氨基脂質(zhì)、色脂和脂肪酸。該術(shù)語(yǔ)涵蓋天然存在和合成的脂質(zhì)二者。與本發(fā)明有關(guān)的優(yōu)選脂質(zhì)是：類固醇和固醇，特別是膽固醇、磷脂(包括磷脂酰、磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺以及鞘磷脂。在存在脂肪酸的情況下，其長(zhǎng)度可以是約12至24個(gè)碳鏈，含有多至6個(gè)雙鍵。脂肪酸與可來自于甘油的主鏈連接。一種脂質(zhì)中的脂肪酸可以是不同的(不對(duì)稱的)，或者可以僅存在1個(gè)脂肪酸鏈，例如，溶血卵磷脂?；旌现苿┮彩强赡艿?，特別是當(dāng)非陽(yáng)離子脂質(zhì)來自于天然來源時(shí)，例如卵磷脂(磷脂酰膽堿)從卵黃、牛心臟、腦、肝或大豆純化。脂質(zhì)體核心可以由本領(lǐng)域人員已知的一種或更多種脂質(zhì)構(gòu)建，所述脂質(zhì)包括但不限于：鞘脂，例如鞘氨醇、磷酸鞘氨醇、甲基化鞘氨醇和二氫鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺磷酸酯、1-0?；窠?jīng)酰胺、二氫神經(jīng)酰胺、2-羥基神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘磷脂以及多種長(zhǎng)度和飽和狀態(tài)的植物鞘氨醇及其衍生物；磷脂，例如磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酸、溶血磷脂酸、環(huán)狀lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷酸肌醇、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、雙(單?；视?磷酸酯、(二?；视?磷酸酯、醚脂質(zhì)、二植烷基醚脂質(zhì)以及多種長(zhǎng)度、飽和狀態(tài)的縮醛磷脂及其衍生物；固醇，例如膽固醇、鏈固醇(desmosterol)、豆固醇、羊毛固醇、烯膽甾烷醇(lathosterol)、薯蕷皂苷配基、谷固醇、酵母固醇、酵母甾烯醇(zymostenol)、14-去甲基-羊毛固醇、膽固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸酯、14-去甲基-14-脫水羊毛固醇、谷甾烷醇、菜油固醇(campersterol)、醚陰離子脂質(zhì)、醚陽(yáng)離子脂質(zhì)、鑭系元素螯合脂質(zhì)、a-環(huán)取代的氧化固醇、b-環(huán)取代的氧化固醇、d-環(huán)取代的氧化固醇、側(cè)鏈取代的氧化固醇、雙取代氧化固醇、膽甾烷酸衍生物、氟化固醇、熒光固醇、磺化固醇、磷酸化固醇以及不同長(zhǎng)度、飽和狀態(tài)的多不飽和固醇，及其衍生物。寡核苷酸可以位于核心的外部、核心的壁中和/或核心的中心。位于核心上的寡核苷酸通常被稱為與核心偶聯(lián)。偶聯(lián)可以是直接或間接的。在一些實(shí)施方案中，核心的外部存在至少25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個(gè)寡核苷酸或其任意范圍組合。在一些實(shí)施方案中，表面上存在1至1000、10至500、50至250或50至300個(gè)寡核苷酸。寡核苷酸殼的寡核苷酸可以在多個(gè)方向上取向。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸徑向向外取向。這些寡核苷酸的取向可以是相對(duì)于核心的5’遠(yuǎn)端/3’末端，或者相對(duì)于核心的3’遠(yuǎn)端/5’末端，或者圍繞核心側(cè)向取向。在一個(gè)實(shí)施方案中，在單個(gè)sna的相同表面上存在一個(gè)或多個(gè)不同的寡核苷酸。在所有情況下，在表面上存在至少1個(gè)寡核苷酸，但可存在多至10,000個(gè)。寡核苷酸可以通過接頭與核心或彼此和/或與其他分子(例如活性劑)直接或間接地連接。寡核苷酸可以通過5’端或3’端與接頭綴合，例如，[序列，5’-3’]-接頭或接頭-[序列，5’-3’]。納米結(jié)構(gòu)的一些或全部寡核苷酸可以通過共價(jià)或非共價(jià)連接彼此直接或間接地連接。一個(gè)寡核苷酸與另一寡核苷酸的連接可以是該寡核苷酸與脂質(zhì)體核心的連接的替代或補(bǔ)充。寡核苷酸殼可以通過一個(gè)或多個(gè)接頭分子錨定到核心的表面，所述接頭分子包括但不限于：含有一個(gè)或多個(gè)硫醇的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如多種鏈長(zhǎng)的烷烴硫醇、環(huán)狀二硫醇、硫辛酸或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他硫醇接頭。在包含脂質(zhì)體核心的一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸殼可以通過與一個(gè)或多個(gè)接頭分子綴合而錨定到脂質(zhì)體核心的表面，所述接頭分子包括但不限于：生育酚；鞘脂，例如鞘氨醇、磷酸鞘氨醇、甲基化鞘氨醇和二氫鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺磷酸酯、1-0?；窠?jīng)酰胺、二氫神經(jīng)酰胺、2-羥基神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘磷脂以及多種長(zhǎng)度和飽和狀態(tài)的植物鞘氨醇及其衍生物；磷脂，例如磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酸、溶血磷脂酸、環(huán)狀lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷酸肌醇、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、雙(單酰基甘油)磷酸酯、(二酰基甘油)磷酸酯、醚脂質(zhì)、二植烷基醚脂質(zhì)以及多種長(zhǎng)度、飽和狀態(tài)的縮醛磷脂及其衍生物；固醇，例如膽固醇、鏈固醇、豆固醇、羊毛固醇、烯膽甾烷醇、薯蕷皂苷配基、谷固醇、酵母固醇、酵母甾烯醇、14-去甲基羊毛固醇、膽固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸酯、14-去甲基-14-脫水羊毛固醇、谷甾烷醇、菜油固醇、醚陰離子脂質(zhì)、醚陽(yáng)離子脂質(zhì)、鑭系元素螯合脂質(zhì)、a-環(huán)取代的氧化固醇、b-環(huán)取代的氧化固醇、d-環(huán)取代的氧化固醇、側(cè)鏈取代的氧化固醇、雙取代氧化固醇、膽甾烷酸衍生物、氟化固醇、熒光固醇、磺化固醇、磷酸化固醇以及不同長(zhǎng)度、飽和狀態(tài)的多不飽和固醇，及其衍生物。寡核苷酸還可以通過嵌入到核心(脂質(zhì)體核心)中與核心締合，或者其可以間接地(即，通過其他分子(例如接頭)非共價(jià)地或共價(jià)地)或直接地(即，共價(jià)地)附接或連接。本發(fā)明還包括涉及任意一種組分或組分集合的制品。在一些實(shí)施方案中，所述制品是藥盒(kit)。所述制品包括在一個(gè)或更多個(gè)容器中的本發(fā)明的藥物或診斷級(jí)化合物。所述制品可以包括推廣或描述本發(fā)明化合物的使用的說明書或標(biāo)簽。本文中使用的“推廣”包括結(jié)合治療tnfα病癥的與本發(fā)明組合物相關(guān)的所有商業(yè)方法，包括教育方法、醫(yī)院和其他臨床指導(dǎo)、制藥行業(yè)活動(dòng)(包括藥品銷售)，以及任何廣告或其他推廣活動(dòng)，包括任何形式的書面、口頭和電子通信?！罢f明書”可以定義推廣的組成部分并且通常包括在本發(fā)明組合物的包裝上或與其有關(guān)的書面說明書。說明書還可以包括以任何方式提供的任何口頭或電子說明書。因此，在一些實(shí)施方案中，本文中所述的藥劑可以組裝成藥用或診斷或研究藥盒以促進(jìn)其在治療、診斷或研究應(yīng)用中的使用。藥盒可以包含容納本發(fā)明的組分的一個(gè)或更多個(gè)容器和使用說明書。具體地，這樣的藥盒可以包括本文中所述的一種或更多種藥劑，以及描述這些藥劑的預(yù)期治療應(yīng)用和合適施用的說明書。在某些實(shí)施方案中，藥盒中的藥劑可以為適于特定應(yīng)用和適于藥劑施用方法的藥物制劑和劑量。藥盒可以被設(shè)計(jì)成有利于醫(yī)師使用本文中描述的方法并且可以采用多種形式。在適用的情況下，藥盒的每種組合物可以以液體形式(例如，在溶液中)或以固體形式(例如，干粉末)提供。在某些情況下，一些組合物可以是可構(gòu)成的或以其他方式可加工的(例如，加工成活性形式)，例如，通過添加合適的溶劑或其他物類(例如，水或細(xì)胞培養(yǎng)基)，其可以與或可以不與藥盒一起提供。本文中使用的“說明書”可以限定說明和/或推廣的組分，并且通常包括在本發(fā)明的包裝上與其有關(guān)的書面說明書。說明書還可以包括以使得使用者將清楚地認(rèn)識(shí)到說明書與該藥盒有關(guān)的任何方式提供的任何口頭或電子說明書，例如，音像(例如，錄像帶、dvd等)、因特網(wǎng)和/或基于網(wǎng)絡(luò)的通信等。書面說明書可以是由管理藥品或生物制品的制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式，該說明書還可反映機(jī)構(gòu)對(duì)用于人施用的制造、使用或銷售的許可。藥盒可以包含在一個(gè)或更多個(gè)容器中的本文中所述的任意一種或更多種組分。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，藥盒可以包含用于混合藥盒的一種或更多種組分和/或分離和混合樣品并施用于對(duì)象的說明書。藥盒可以包括容納本文中所述的藥劑的容器。所述藥劑可以無菌制備，包裝在注射器中并冷藏運(yùn)送?；蛘?，其可以被放置在小瓶或其他用于儲(chǔ)藏的容器中。第二容器可以具有無菌制備的其他藥劑。或者，藥盒可以包含在注射器、小瓶、管或其他容器中預(yù)混合并運(yùn)送的活性劑。藥盒可以具有多種形式，例如泡罩袋(blisterpouch)、收縮包裝袋(shrinkwrappedpuch)、真空可密封袋、可密封的熱成型盤或者類似的袋或盤形式，其中附件松散地包裝在袋、一個(gè)或更多個(gè)管、容器、盒或包中。在添加附件之后，可以對(duì)藥盒進(jìn)行滅菌，從而允許容器中的各個(gè)附件以其他方式解開?？梢允褂萌魏魏线m的滅菌技術(shù)(例如輻射滅菌、熱滅菌或本領(lǐng)域已知的其他滅菌方法)來將藥盒滅菌。根據(jù)具體應(yīng)用，藥盒還可以包括其他組分，例如，容器、細(xì)胞培養(yǎng)基、鹽、緩沖劑、試劑、注射器、針、用于施用或去除消毒劑的織物(例如紗布)、一次性手套、施用前的藥劑載體等。藥盒的組合物可以作為任何合適的形式提供，例如，作為液體溶液或經(jīng)干燥的粉末提供。當(dāng)提供的組合物是干粉末時(shí)，可以通過添加合適的溶劑(其也可以被提供)來重構(gòu)粉末。在要求液體形式的組合物的一些實(shí)施方案中，液體形式可以是濃縮的或即用型的。溶劑將取決于化合物和使用或施用模式。用于藥物組合物的合適溶劑是公知的并且可在文獻(xiàn)中獲得。所述溶劑將取決于化合物和使用或施用模式。在一組實(shí)施方案中，藥盒可以包括被隔室化以封閉限制的方式接受一個(gè)或更多個(gè)容器裝置(例如小瓶、管等)的載體裝置，每個(gè)容器裝置包含待用于所述方法中的一個(gè)單獨(dú)元件。例如，一個(gè)容器可以包含用于測(cè)定的陽(yáng)性對(duì)照。另外地，藥盒可以包含用于可用于測(cè)定的其他組分(例如，緩沖劑)的容器。本發(fā)明還包括成品的經(jīng)包裝和標(biāo)記的藥物產(chǎn)品。該制品包括在合適密封器皿或容器(例如玻璃小瓶或其他容器)中的合適的單位劑型。在適于腸胃外施用的劑型的情況下，活性成分是無菌的并且適于作為不含顆粒的溶液施用。換言之，本發(fā)明包括腸胃外溶液和凍干粉末兩種，每種都是無菌的，并且后者適于在注射前重構(gòu)?；蛘?，單位劑型可以是適于經(jīng)口、經(jīng)皮、表面或經(jīng)黏膜遞送的固體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，單位劑型適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下遞送。因此，本發(fā)明包括適于每種遞送途徑的優(yōu)選無菌的溶液。與任何藥用產(chǎn)品一樣，包裝材料和容器被設(shè)計(jì)用于在儲(chǔ)存和運(yùn)輸期間保護(hù)產(chǎn)品的穩(wěn)定性。此外，本發(fā)明的產(chǎn)品包括建議醫(yī)師、技術(shù)人員或患者如何適當(dāng)?shù)仡A(yù)防或治療tnfα疾病或病癥的使用說明書或其他信息材料。換言之，制品包含指示或建議給藥方案(包括但不限于實(shí)際劑量)、監(jiān)測(cè)操作和其他監(jiān)測(cè)信息的說明裝置。更具體地，本發(fā)明提供了一種制品，其包括包裝材料，例如盒、瓶、管、小瓶、容器、噴霧器、吹入器、靜脈內(nèi)(i.v.)袋、封套(envelope)等；以及包含在所述包裝材料中的藥劑的至少一種單位劑型。本發(fā)明還提供了一種制品，其包含包裝材料，例如盒、瓶、管、小瓶、容器、噴霧器、吹入器、靜脈內(nèi)(i.v.)袋、封套等；以及包含在所述包裝材料中的每種藥劑的至少一種單位劑型。本發(fā)明還提供了一種制品，其包含包裝材料，例如盒、瓶、管、小瓶、容器、噴霧器、吹入器、靜脈內(nèi)(i.v.)袋、封套等；以及包含在所述包裝材料中的每種藥劑的至少一種單位劑型。本發(fā)明還提供了一種制品，其包含用于注射制劑的針或注射器(優(yōu)選以無菌形式包裝的)，和/或包裝的醇?jí)|。本發(fā)明在其應(yīng)用方面不限于以下說明中所述或附圖中所示結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)和組件布置。本發(fā)明能夠具有其他實(shí)施方案并且能夠以多種方式實(shí)踐或?qū)嵤?。另外，本文中使用的措辭和術(shù)語(yǔ)是出于描述目的并且不應(yīng)被視為限制。本文中“包括”、“包含”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其變化形式的使用意指涵蓋其后所列出的項(xiàng)目及其等同物以及另外的項(xiàng)目。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或能夠僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可確定本文中所述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的很多等同方案。這樣的等同方案旨在涵蓋在所附權(quán)利要求書中。本文中公開的包括專利文獻(xiàn)在內(nèi)的所有參考文獻(xiàn)均通過引用整體并入本文。實(shí)施例實(shí)施例1：抑制性寡核苷酸序列使用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)在mermade48(bioautomation)上合成寡核苷酸(試劑來自glenresearch和chemgenes)。使三個(gè)序列靶向人tnfmrna的起始密碼子(oligo3482、3483和3484)。用sfold產(chǎn)生三個(gè)另外的序列(oligo3485、3486和3487)。使一個(gè)序列oligo3488人源化。最后，產(chǎn)生亂序?qū)φ?oligo3495)。各自的序列列于表1中：表1：寡核苷酸序列表oligoidoligo序列(5’至3’)seqidno.oligo3482catggtgtcctttccagg1oligo3483tcagtgctcatggtgtcc2oligo3484catgctttcagtgctcat3oligo3485tgggagtagatgaggtac4oligo3486ttgaccttggtctggtag5oligo3487gatggcagagaggaggtt6oligo3488ttatctctcagctccacg7oligo3495atggagcaaaacccgcag8然后，將寡核苷酸用反相高效液相色譜(aglient)純化。用基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜驗(yàn)證寡核苷酸產(chǎn)物的身份。針對(duì)tnf表達(dá)來初始篩選合成的寡核苷酸。將原代人角質(zhì)形成細(xì)胞平板接種在96孔板中。第二天，使用optimem(lifetechnologies)中的lipofectamine(lifetechnologies)用2μm的反義鏈轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)。在孵育期之后，用pbs洗滌細(xì)胞，提取其mrna，合成cdna，并用rt-pcr確定tnf和gapdh水平(圖1)。oligo3482、4385和3487在降低tnf表達(dá)水平方面特別有效。在另外一組經(jīng)修飾的序列中進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)條件。簡(jiǎn)言之，將原代人角質(zhì)形成細(xì)胞平板接種在96孔板中。第二天，使用optimem(lifetechnologies)中的lipofectamine(lifetechnologies)用2μm的反義鏈轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)。在孵育期之后，用pbs洗滌細(xì)胞，提取其mrna，合成cdna，并用rt-pcr探測(cè)tnf和gapdh水平(圖2)。如表2中可以看出，每個(gè)序列與各自的對(duì)照(用斜體表示)配對(duì)：表2：經(jīng)修飾的寡核苷酸序列及其對(duì)照實(shí)施例2：球形核酸(sna)對(duì)tnf的抑制將不同sna的化學(xué)物質(zhì)與各自的寡核苷酸對(duì)照進(jìn)行比較。制備含有抗tnf反義鏈的sna。通過用10ml水中的0.570g檸檬酸三鈉還原0.1969ghaucl4·3h2o的490ml沸騰水溶液來制備13±1nm直徑的金納米顆粒。然后，將顆粒溶液通過0.45μm乙酸纖維素膜過濾以除去任何聚集的納米顆粒。如所制備的，納米顆粒濃度為11nm。然后，按原樣使用金納米顆粒來制備抗tnf和對(duì)照sna。sna合成開始于將向合成的金納米顆粒中添加硫醇化的5kda線性聚(乙二醇)至5μm的終濃度。在混合之后，使溶液在37℃下靜置1.5小時(shí)，此時(shí)將寡核苷酸以5μm的終濃度添加到溶液中。在維持溫度的同時(shí)，在1小時(shí)的過程內(nèi)將氯化鈉溶液以兩個(gè)相等的等分試樣添加到功能化混合物中，以將naci濃度提高至150mm。使混合物在37℃下靜置過夜。第二天，以21,000×g離心沉淀顆粒，除去上清液，并將顆粒重懸于無菌pbs中。將該過程重復(fù)三次以除去過量的peg和未附著于顆粒的寡核苷酸。通過從金核心中釋放寡核苷酸(用kcn氧化溶解納米顆粒)來測(cè)量每個(gè)納米顆粒的寡核苷酸數(shù)量。最后，用基于熒光的測(cè)定(oligreen，lifetechnologies)根據(jù)生產(chǎn)商的說明來測(cè)量所釋放的寡核苷酸的數(shù)量。將原代人角質(zhì)形成細(xì)胞平板接種在96孔板中。第二天，在5μm的寡核苷酸濃度下用tnf或?qū)φ誷na轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使處理進(jìn)行過夜。第二天，洗滌細(xì)胞，收集mrna，制備cdna，并探測(cè)tnf和gapdh的表達(dá)。結(jié)果示于圖3中。如表3中可以看出，每個(gè)序列與各自的對(duì)照(用斜體表示)配對(duì)：表3：用于比較sna化學(xué)物質(zhì)的寡核苷酸序列和對(duì)照將人角質(zhì)形成細(xì)胞平板接種在96孔組織培養(yǎng)板中并使其附著過夜。在第二天，將其用50ng/ml人重組tnf處理4小時(shí)，之后用oligo3661修飾的sna或oligo3657(seqidno：22)sna處理。使處理進(jìn)行過夜。第二天，洗滌細(xì)胞，收集mrna，制備cdna，并探測(cè)tnf和gapdh的表達(dá)，并計(jì)算百分比基因敲減(圖4)。檢測(cè)額外的硫代磷酸酯修飾對(duì)oligo3657修飾的sna的作用。如先前所述，使用金納米顆粒制備具有提高硫代磷酸酯含量的寡核苷酸家族。將顆粒轉(zhuǎn)染到人角質(zhì)形成細(xì)胞中過夜。第二天，洗滌細(xì)胞，收集mrna，制備cdna，并探測(cè)tnf和gapdh的表達(dá)，并計(jì)算百分比基因敲減(圖5)。分析表4中的序列：表4：具有提高硫代磷酸酯含量的寡核苷酸檢測(cè)了空心sna對(duì)tnf表達(dá)的作用。制備含有生育酚亞磷酰胺的寡核苷酸(試劑來自chemgenes)。通過將脂質(zhì)以75mg/ml溶解在dcm中來制備由二油酰基磷脂酰膽堿(dopc)構(gòu)成的脂質(zhì)體支架，并隨后將溶液在氮流下干燥并凍干。將殘余材料以40mg/ml的濃度溶解在hepes(ph7.3)和150mmnacl中，并使其靜置30分鐘，然后使用液氮進(jìn)行三個(gè)冷凍/融化循環(huán)。然后，將該溶液通過包含直徑為100、50和30nm的孔的聚碳酸酯膜擠出。所得溶液含有直徑為約40nm的脂質(zhì)體。通過向脂質(zhì)體溶液中添加生育酚修飾的寡核苷酸來發(fā)生向sna的功能化。然后，將材料用切向流過濾濃縮并如上所述施加于人角質(zhì)形成細(xì)胞。所制備的序列如表5中所示：表5：用于空心sna研究的寡核苷酸序列及其對(duì)照實(shí)施例3：靶向tnfmrna的反義sna的抑制作用將靶向tnfmrna的反義sna對(duì)mrna表達(dá)的抑制作用與非靶向性對(duì)照sna進(jìn)行比較。制備含有由化合物6081構(gòu)成的抗tnf反義鏈的sna。所有的寡核苷酸均使用標(biāo)準(zhǔn)的unilinker(chemgenes)以1微摩爾的規(guī)模合成。dna、rna、2’-o-me單體和六(乙二醇)間隔物從chemgenescorporation獲得。膽固醇改性劑從glenresearch獲得。連接是標(biāo)準(zhǔn)的磷酸二酯或用1∶1盧剔啶：acn中的0.2m苯乙?；蚧?phenylacetyldisulfide，pads)作為硫化劑得到的硫代磷酸酯。以5’至3’方向在dmt脫去下進(jìn)行合成。在合成之后，在55℃下使用氫氧化銨和乙醇的4∶1混合物將寡核苷酸從載體上切割下來并使其去保護(hù)16小時(shí)。將寡核苷酸通過離子交換高效液相色譜(hplc)技術(shù)純化。使用idtoligoanalyzer來評(píng)估分子量和消光系數(shù)。使用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化(matrix-assistedlaserdesorption/ionization，maldi)進(jìn)行寡核苷酸分子量的驗(yàn)證。通過微板讀數(shù)器(biotek)上260nm處的uv吸光度與來自idtoligoanalyzer的計(jì)算的消光系數(shù)來確定寡核苷酸濃度。然后，將寡核苷酸用于制備抗tnf和對(duì)照sna。合成開始于將寡核苷酸在pbs中稀釋至100μm。然后將寡核苷酸在4℃下避光儲(chǔ)存過夜。由于極性溶劑對(duì)寡核苷酸的疏水性膽固醇尾的靜電排斥，形成具有膽固醇核心和向外延伸的寡核苷酸的結(jié)構(gòu)化膠束結(jié)構(gòu)。將原代人角質(zhì)形成細(xì)胞平板接種在96孔板中。第二天，將細(xì)胞用50ng/ml人重組tnf處理4小時(shí)，之后用寡核苷酸濃度為1000、333.3、100、33.3、10、3.3、1、0.33、0.1、0.03和0.01nm的oligoid6081或oligoid6093sna轉(zhuǎn)染。使處理進(jìn)行過夜。第二天，洗滌細(xì)胞，收集mrna，制備cdna，探測(cè)tnf和gapdh的表達(dá)，并計(jì)算百分比基因表達(dá)(圖9)。檢測(cè)了改變六乙二醇(hexaethyleneglycol，heg)的鏈長(zhǎng)度對(duì)oligoid6081sna的反義活性的作用。制備具有提高h(yuǎn)eg間隔物長(zhǎng)度的寡核苷酸并將其配制成自組裝sna。將原代人角質(zhì)形成細(xì)胞平板接種在96孔板中。第二天，將細(xì)胞用50ng/ml人重組tnf處理4小時(shí)，之后用寡核苷酸濃度為100、10、1和0.1nm的oligoid6080、6081、6082、6092、6083、6093、6094或6095sna轉(zhuǎn)染。使處理進(jìn)行過夜。第二天，洗滌細(xì)胞，收集mrna，制備cdna，并探測(cè)tnf和gapdh的表達(dá)，并計(jì)算百分比基因表達(dá)(圖10)。表6：用于空心sna研究的寡核苷酸序列實(shí)施例4：測(cè)試在人銀屑病皮膚中的離體活性使用標(biāo)準(zhǔn)的固相亞磷酰胺方法用mermade48(bioautomation)合成寡核苷酸。堿基和試劑購(gòu)自glenresearch和chemgenes。所有的寡核苷酸均通過反相高效液相色譜(hplc)進(jìn)行純化，并使用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化(maldi)分析來測(cè)量分子量。合成的寡核苷酸列于表7中。如下合成脂質(zhì)體：使用具有50nm孔的47mm直徑的聚碳酸酯膜(sterlitech)擠出在磷酸緩沖鹽水溶液(pbs)(137mmnacl、10m磷酸鹽、2.7mmkcl，ph7.4，hyclone)中水合的1，2-二油?；?sm-甘油-3-磷酸膽堿(dopc)。使用malvernzetasizernano(malverninstruments)用動(dòng)態(tài)光散射來測(cè)量脂質(zhì)體直徑。使用磷脂測(cè)定試劑盒(sigma)來確定脂質(zhì)濃度。通過以100∶1的摩爾比混合寡核苷酸與脂質(zhì)體并將該混合物在室溫下孵育4小時(shí)來合成l-sna。使l-sna與未反應(yīng)的材料分離，并利用具有30kd分子量截留改性聚醚砜(modifiedpolyethersulfone，mpes)空心纖維過濾器模塊的minikrospilotisystem(spectrumlabs)使用切向流過濾(tangentialflowfiltration，tff)濃縮。使用磷脂測(cè)定試劑盒(sigma)分析含有l(wèi)-sna的滲余物的脂質(zhì)濃度。將l-sna在90％甲醇中稀釋以溶解脂質(zhì)體以釋放表面功能化的寡核苷酸，所述寡核苷酸的濃度使用cary紫外/可見分光光度計(jì)(agilent)來測(cè)量。通過將寡核苷酸的濃度除以脂質(zhì)體的濃度來計(jì)算與納米顆粒綴合的寡核苷酸的平均數(shù)。使用malvernzetasizernano(malverninstruments)用動(dòng)態(tài)光散射來測(cè)量l-sna直徑。檢測(cè)了施用含有oligo4831.1的l-sna對(duì)人銀屑病離體皮膚培養(yǎng)物的基因調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)組列于表8中。從5位患有輕度至中度斑塊狀銀屑病的不同患者的銀屑病斑塊中取出4個(gè)3mm直徑的皮膚活組織。每個(gè)重復(fù)樣取自不同的患者用于準(zhǔn)確表示和針對(duì)患者特異性應(yīng)答。外植體以以下方式進(jìn)行培養(yǎng)。在corning12孔細(xì)胞培養(yǎng)過濾器插入物的中心打孔。將外植體的真皮(底部)部分推入過濾器的孔中，使得活檢物嵌入過濾器中。使表皮暴露于內(nèi)室中，并使真皮暴露于外室中。將這些過濾器浸入1ml細(xì)胞培養(yǎng)基(dmem、1％fbs、1.25μg/ml兩性霉素b、50μg/ml慶大霉素、0.1u/ml青霉素/鏈霉素)中，使得真皮接觸孔中的培養(yǎng)基并且表皮暴露于空氣。以以下方處理培養(yǎng)物：使用移液管將2μl的每種化合物在pbs中施加到每個(gè)活檢物的頂部(角質(zhì)層)。將活檢物在37℃下孵育16小時(shí)。立即使用球軸承勻漿器在填充有3mm直徑的氧化鋯球軸承的2ml螺旋蓋小瓶中的300μlrlt緩沖液(qiagen)中將樣品勻漿。將經(jīng)勻漿的樣品立即快速冷凍并在-80℃下儲(chǔ)存。使用qiagen96孔rneasy板提取試劑盒處理裂解物。使用針對(duì)htnf和hgapdh的探針和引物(rochediagnostics)在lightcycler(rochediagnostics)上進(jìn)行rtpcr，并測(cè)量tnf基因表達(dá)(圖11)。表7：寡核苷酸序列表8：離體銀屑病皮膚組和處理組組織來源oligo靶標(biāo)類型濃度1患者aoligo4832.1對(duì)照l(shuí)-sna100μm2患者aoligo4831.1tnfl-sna100μm3患者aoligo4831.1tnfl-sna10μm4患者aoligo4831.1tnfl-sna1μm5患者boligo4832.1對(duì)照l(shuí)-sna100μm6患者boligo4831.1tnfl-sna100μm7患者boligo4831.1tnfl-sna10μm8患者boligo4831.1tnfl-sna1μm實(shí)施例5：測(cè)試抗tnfsna和l-sna在tnbs誘導(dǎo)的炎性腸病(ibd)小鼠模型中的效力在tnbs誘導(dǎo)的ibd小鼠模型中評(píng)估oligo227901的作用(表9)。合成在其3’端具有膽固醇的oligo227901(試劑來自chemgenes)。在實(shí)施例6中，我們示出了使用cryo-em來形成該寡核苷酸的自組裝sna結(jié)構(gòu)。此外，已通過將寡核苷酸添加到50nmdopc脂質(zhì)體溶液中制備了oligo227901的l-sna形式。將s-san和l-san在碳酸氫鹽溶液中調(diào)至ph9.5以用于動(dòng)物。在6至7周大的balb/c小鼠中進(jìn)行tnbs誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的研究。為了誘導(dǎo)結(jié)腸炎，在研究的第0天每只動(dòng)物直腸內(nèi)施用10mg溶解在80％乙醇中的tnbs。對(duì)照小鼠由僅用載劑處理的小鼠和未經(jīng)處理的原初小鼠組成。為了檢測(cè)oligo227901的s-sna和l-sna對(duì)tnbs誘導(dǎo)的結(jié)腸炎研究的治療效果，在誘導(dǎo)結(jié)腸炎之后，在第1、2、3和4天(總共4個(gè)劑量)通過經(jīng)口管飼用化合物以100μg/劑量/小鼠至300μg/劑量/小鼠處理小鼠。每天監(jiān)測(cè)小鼠多至7天以進(jìn)行臨床評(píng)分觀察，并在第7天實(shí)施安樂死用于分析大體病理學(xué)。通過考慮以下參數(shù)來分配對(duì)照小鼠和經(jīng)處理小鼠的臨床評(píng)分：體重、糞便稠度和經(jīng)直腸的出血以及在皮毛和腹部中觀察到的任何異常。在實(shí)施安樂死之后從動(dòng)物中移出的結(jié)腸的研究的最后一天，向?qū)φ蘸徒?jīng)處理的小鼠分配大體病理學(xué)評(píng)分。根據(jù)觀察結(jié)果分配0至5的大體病理學(xué)評(píng)分：未檢測(cè)到異常(評(píng)分0)；一處水腫和發(fā)紅(評(píng)分1)；多于一處水腫和發(fā)紅(評(píng)分2)；一處潰瘍(評(píng)分3)；多于一處潰瘍或嚴(yán)重潰瘍(評(píng)分4)；以及多于一處水腫和發(fā)紅并且一處或多于一處潰瘍(評(píng)分5)。研究的結(jié)果示于圖12中。使用單因素anova隨后進(jìn)行tukey事后檢驗(yàn)來計(jì)算各組的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在僅tnbs的組中臨床評(píng)分和大體病理學(xué)評(píng)分提高表明，直腸施用tnbs在除原初小鼠之外的所有組中均建立結(jié)腸炎疾病。對(duì)于在第0天用tnbs進(jìn)行結(jié)腸炎誘導(dǎo)后在第1天至第4天用oligo227901的s-sna形式以總共4個(gè)劑量的200μg/劑量的量處理的組，觀察到與相關(guān)載體劑相比平均臨床評(píng)分顯著降低。與載劑組相比，從第1天至第4天用4個(gè)劑量的s-sna(200μg/劑量和300μg/劑量)和l-sna(200μg/劑量)處理的動(dòng)物顯示大體病理學(xué)評(píng)分顯著降低。總體而言，結(jié)果表明，經(jīng)口施用s-sna對(duì)疾病癥狀具有積極效果，反映在較低的臨床評(píng)分、較低的病理評(píng)分以及較高的動(dòng)物存活率。表9：炎性腸病(ibd)研究中的寡核苷酸序列實(shí)施例6：自組裝sna的cryo-tem對(duì)o1igo6307自組裝球形核酸(s-sna)的溶液進(jìn)行cryotem成像(表10)。s-sna使用2.4mm寡核苷酸溶液在磷酸緩沖鹽水溶液(pbs)(137mmnacl、10m磷酸鹽、2.7mmkcl，ph7.4，hyclone)中制備。將樣品保存在400目銅載網(wǎng)上由有孔碳膜支撐的玻璃化冰(vitrifiedice)中。每個(gè)樣品如下制備：將3μl的樣品混懸液滴施加到已清洗的載網(wǎng)上，用濾紙吸干，并立即在液態(tài)乙烷中進(jìn)行玻璃化。將載網(wǎng)儲(chǔ)存在液氮下直至轉(zhuǎn)移至電子顯微鏡用于成像。使用在120kev下操作的配備有feieagle4k×4kccd照相機(jī)的feitecnait12電子顯微鏡進(jìn)行電子顯微術(shù)。使用將載網(wǎng)維持在低于-170℃的溫度的低溫臺(tái)(cryostage)將玻璃狀冰載網(wǎng)轉(zhuǎn)移到電子顯微鏡中。在110,000x(0.10nm/像素)的標(biāo)稱放大倍率下獲取高放大倍率圖像。在-5μm至-3μm的標(biāo)稱欠焦和10至40e-/a2的電子劑量下獲取圖像。在整個(gè)視野內(nèi)，樣品主要由很多小的約3nm的圓形顆粒構(gòu)成(圖13)。這些圓形顆粒對(duì)應(yīng)于構(gòu)成s-sna顆粒之疏水性核心的膽固醇分子簇的直徑。小的約3nm的圓形顆粒被3至5nm的間隙均勻隔開，這可能對(duì)應(yīng)于圍繞疏水性核心的以球形取向排列的寡核苷酸冠(corona)(圖14a)。寡核苷酸冠或殼限定s-sna的流體動(dòng)力學(xué)半徑(其為約13nm)，使得電子致密疏水性核心之間均勻間隔(圖14b)。表10：寡核苷酸序列序列表<110>艾克西治愈有限公司<120>抗tnf化合物<130>a1107.70005wo00<140>尚未分配<141>2015-10-06<150>us62/060,424<151>2014-06-10<160>46<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>1catggtgtcctttccagg18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>2tcagtgctcatggtgtcc18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>3catgctttcagtgctcat18<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>4tgggagtagatgaggtac18<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>5ttgaccttggtctggtag18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>6gatggcagagaggaggtt18<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>7ttatctctcagctccacg18<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>8atggagcaaaacccgcag18<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<220><221>m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