技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新化合物和用途。
背景技術(shù)：
：血管新生(angiogenesis)，是從已有血管發(fā)芽生成新血管的過(guò)程。這一過(guò)程與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖相關(guān)。血管新生與多種人類(lèi)重大疾病有關(guān)，如惡性腫瘤。目前發(fā)現(xiàn)，眼部血管新生性疾病，包括年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼等，這類(lèi)疾病的共同特點(diǎn)都在于眼部新生血管的異常增生(金曉，等，抗VEGF藥物在眼科疾病中的應(yīng)用及機(jī)制研究進(jìn)展，中外醫(yī)療，2012年)。其中，黃斑變性主要有干性和濕性?xún)煞N，濕性黃斑變性(AMD)的特點(diǎn)是，脈絡(luò)膜的新生血管進(jìn)入視網(wǎng)膜下以及繼而發(fā)生的出血、滲出及水腫等病理變化。濕性迅速喪失視力，較干性更為嚴(yán)重。目前，在濕性黃斑變性的治療方面已有較好的進(jìn)展。早期的激光燒爍止血被血管內(nèi)皮因子拮抗劑所代替，但因后者效果不佳，很快被光動(dòng)力療法所取代。光動(dòng)力療法雖然提高了療效，但仍不理想。近年又出現(xiàn)了新的血管內(nèi)皮因子拮抗劑Lucentis(雷珠單抗)，是一種人源性VEGF亞型單克隆抗體片段的重組體，可減少新生血管生成。2006年，該藥物被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療濕性黃斑變性，療效良好；同時(shí)，目前也發(fā)現(xiàn)該類(lèi)抗VEGF藥物對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼有治療作用。但由于Lucentis為抗體藥，價(jià)格極高，它還不能在全世界普及。因此，研究療效良好、價(jià)格低廉的小分子新生血管抑制劑藥物是當(dāng)今國(guó)際制藥界激烈競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種新化合物，及其制備方法和用途。本發(fā)明提供了如式A所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物：其中，Z0為O或S；X為C，Y為N；；Z1、Z2分別獨(dú)立選自N或-CR8；r7選自氫或C1-C6烷基；r8選自氫或C1-C6烷基；r10選自H、氨基、羥基、巰基、C1-C6烷基或-(CH2)n1NHr1，其中，n1＝1-5，r1為H或C1-3的烷基；r9選自H、氨基、羥基、巰基、(C-r11r12)nNr13r14、(C-r11r12)nOr15、(C-r11r12)nC(O)Er13、(C-r11r12)nS(O)mr17；或r8和r9與它們所連接的原子一起形成飽和的4-7元雜環(huán)或取代雜環(huán)，其中，雜環(huán)或取代雜環(huán)含有1或2個(gè)選自N，O或S的雜原子，其取代基為0，1，或2個(gè)，分別獨(dú)立地選自氧代基團(tuán)，C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6鹵代烷氧基，C1-C6烷酰基、C1-C6烷胺基、C3-C7環(huán)烷基、鹵素，羥基，氨基，羰基，氨基羰基，C1-C6氨烷基羰基，C1-C4?；珻1-C6烷氧基羰基，C1-C6磺?；?，氨基磺?；?；Ar2選自苯基，萘基，單環(huán)或二環(huán)雜芳基，二環(huán)或三環(huán)雜環(huán)基，其中每個(gè)雜芳基或雜環(huán)基有1，2，3或4個(gè)選自N，O或S的雜原子；所述的苯基，萘基，雜芳基或雜環(huán)基團(tuán)是未取代或取代的苯基，萘基，雜芳基或雜環(huán)基團(tuán)，其取代基為1，2，或3個(gè)，分別獨(dú)立地選自C1-C8烷基，C1-C8鹵代烷基，羥基C1-C6烷基，C1-C8烷氧基，C1-C8鹵代烷氧基，鹵素，羥基，氨基，氨基C-C6烷基，C1-C6烷基氨基，苯基，C3-C7環(huán)烷基，螺環(huán)的C3-C7環(huán)烷基，氨基磺?；?，C1-C6烷基氨基磺?；籱為0，1，或2；n為0，1，2，或3；E為空、氧或-Nr18；r11，r12和r18是相同或不同的，分別獨(dú)立選自氫或C1-C4烷基；r13，r14，r15，r16和r17獨(dú)立選自氫，C1-C6烷基，C1-C6?；?，苯基和雜環(huán)，或取代的C1-C6烷基，C1-C6?；交碗s環(huán)，其取代基為為0、1或2個(gè)，分別獨(dú)立選自C1-C4烷氧基，C1-C4烷基、鹵素、羥基、氨基、C1-C6氨烷基。進(jìn)一步地，所述化合物結(jié)構(gòu)式如下：其中，X為C，Y為N；R1選自H、氨基、羥基或巰基；R2選自H、氨基、羥基、巰基或-(CH2)nNHR8，其中，n＝1-5，R8為H或C1-3的烷基；R3選自H或C1-6烷基；R4、R5、R6分別獨(dú)立選自H、鹵素、C1-6的烷基或鹵素取代烷基；R7選自H、C1-6的烷基或鹵素；或者，R2、R3與其相連的碳原子共同構(gòu)成取代或非取代的含1-2個(gè)雜原子的五元或六元環(huán)，所述雜原子為N、O或S，其取代基為C1-6的烷基。進(jìn)一步地，X、Y不相同；R1選自H或氨基；R2選自H、氨基或-(CH2)nNHR8，其中，n＝1-3，R8為H或C1-2的烷基；R3選自H或C1-2烷基；R4、R5、R6分別獨(dú)立選自鹵素、C1-2的烷基或鹵素取代烷基；R7選自H或鹵素；或者，R2、R3與其相連的碳原子共同構(gòu)成取代或非取代的含1個(gè)N的五元或六元環(huán)，取代基為C1-3的烷基。更進(jìn)一步地，R2選自氨基或-(CH2)nNHR8；或者，R2、R3與其相連的碳原子共同構(gòu)成取代或非取代的含1個(gè)N的五元或六元環(huán)，取代基為C1-3的烷基。進(jìn)一步，所述化合物結(jié)構(gòu)式如下：化合物為式II時(shí)，W1、W2分別獨(dú)立選自C或雜原子，n＝1或2；R9為H、C1-C4烷基或鹵素；R10為鹵素；其中，n＝1時(shí)，W1、W2不同時(shí)為C；優(yōu)選地，n＝1時(shí)，W1、W2同時(shí)為雜原子，雜原子優(yōu)選為N；n＝2時(shí)，W1、W2同時(shí)為C；化合物為式III時(shí)，W3選自C或雜原子，雜原子優(yōu)選為N；R10為鹵素。更進(jìn)一步地，所述鹵素為F或Cl。優(yōu)選地，所述化合物為：本發(fā)明還提供了上述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物在制備血管新生抑制劑中的用途。進(jìn)一步地，所述血管新生抑制劑為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2抑制劑。更進(jìn)一步地，所述抑制劑是抗眼部血管新生的藥物。進(jìn)一步地，所述藥物是脈絡(luò)膜新生血管抑制劑。更進(jìn)一步地，所述藥物是治療或預(yù)防濕性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變或新生血管性青光眼的藥物。本發(fā)明還提供了上述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物在制備VEGFR2、PDGFR-β或/和KIT抑制劑類(lèi)藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它是含有上述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的眼用制劑。除了本發(fā)明提供的上述化合物以外，制劑中還可以包含其他已知具有相似治療用途的藥物。進(jìn)一步地，所述眼用制劑為滴眼劑、眼膏劑或眼用注射液。在本領(lǐng)域中已知的方法可制備本發(fā)明化合物的鹽。用酸處理，或與合適的陰離子交換劑，與上述化合物可成鹽。本發(fā)明的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，可以從上述化合物具有堿性氮原子的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸加成鹽。優(yōu)選地，合適的無(wú)機(jī)酸包括但不限于，氫鹵酸，如鹽酸，硫酸，或者磷酸。優(yōu)選地，合適的有機(jī)酸包括，但不限于，羧酸，磷酸，磺酸或氨基羧酸，例如乙酸，丙酸，辛酸，癸酸，十二烷酸，羥基乙酸，乳酸，富馬酸，琥珀酸，己二酸，庚二酸，辛二酸，壬二酸，蘋(píng)果酸，酒石酸，檸檬酸，氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸，馬來(lái)酸，羥基酸，甲基馬來(lái)酸，環(huán)己烷羧酸，金剛烷羧酸，苯甲酸酸，水楊酸，4氨基水楊酸，鄰苯二甲酸，苯乙酸，扁桃酸，肉桂酸，甲烷或乙烷磺酸磺酸，2-羥基乙磺酸，乙烷-1，2-二磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，1，5-萘二磺酸，2-甲基苯磺酸，對(duì)甲基苯磺酸，乙基硫酸，十二烷基硫酸的酸，N環(huán)己基氨基乙酸，N-甲基-N-乙基-N-丙基-氨基磺酸，或其它有機(jī)酸，如抗壞血酸。另外，它也可以藥學(xué)上不可接受的鹽用于分離或純化中，例如苦味酸鹽或高氯酸鹽。但是，用于治療用途的，只能是藥學(xué)上可接受的鹽或游離化合物，以適用的藥物制劑的形式。本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受的前體藥物，是指所述化合物經(jīng)過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾后得到的在體內(nèi)經(jīng)酶或非酶的轉(zhuǎn)化釋放出活性成分而發(fā)揮藥效的化合物。本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括了同位素標(biāo)記的上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述同位素標(biāo)記化合物是指與本文中所列化合物相同，但是其中的一個(gè)或多個(gè)原子被另一個(gè)原子取代，該原子的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于自然界中常見(jiàn)的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)?？梢砸牖衔镏械耐凰匕?、碳、氮、氧、硫，即2H，3H、13C、14C、15N、17O、18O、35S。含有上述同位素和/或其它原子同位素的化合物及其立體異構(gòu)體，以及該化合物、立體異構(gòu)體的可藥用的鹽均應(yīng)包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明中的關(guān)鍵中間體和化合物進(jìn)行分離和純化，所使用的方式是有機(jī)化學(xué)中常用的分離和純化方法且所述方法的實(shí)例包括過(guò)濾、萃取、干燥、旋干和各種類(lèi)型的色譜?？蛇x擇地，可以使中間體不經(jīng)純化即進(jìn)行下一步反應(yīng)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的一種或多種化合物可以彼此聯(lián)合使用。也可選擇將本發(fā)明的化合物與任何其它的活性試劑結(jié)合使用，用于制備調(diào)控細(xì)胞功能或治療疾病的藥物或藥物組合物。如果使用的是一組化合物，則可將這些化合物同時(shí)、分別或有序地對(duì)受試對(duì)象進(jìn)行。本發(fā)明化合物具有良好的抗血管新生作用，初步認(rèn)為該類(lèi)化合物是通過(guò)抑制VEGFR2(即KDR)產(chǎn)生活性的。該類(lèi)化合物可用于對(duì)新生血管、VEGFR2等蛋白激酶異常所致疾病的治療，如濕性黃斑變性、惡性腫瘤等。附圖說(shuō)明圖1本發(fā)明化合物對(duì)斑馬魚(yú)血管發(fā)育的抑制作用圖2陰性對(duì)照結(jié)果圖，其中，斑馬魚(yú)血管發(fā)育正常圖3藥物組結(jié)果圖，其中，斑馬魚(yú)血管發(fā)育部位被本發(fā)明化合物部分抑制圖4藥物組結(jié)果圖，其中，斑馬魚(yú)血管發(fā)育部位被本發(fā)明化合物完全抑制圖5本發(fā)明化合物對(duì)VEGFR2體外抑制作用圖6本發(fā)明化合物KDR4脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用，其中，A：陰性對(duì)照，B：KDR4圖7本發(fā)明化合物V01脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用，其中，A：陰性對(duì)照，B：V01圖8化合物V01的核磁圖圖9化合物V3的質(zhì)譜圖圖10化合物V4的質(zhì)譜圖圖11化合物V5的質(zhì)譜圖圖12化合物V5的核磁圖圖13化合物V6的質(zhì)譜圖圖14化合物KDR3的質(zhì)譜圖圖15KDR4化合物質(zhì)譜圖圖16KDR6的質(zhì)譜圖圖17KDR6A的質(zhì)譜圖圖18KDR8的質(zhì)譜圖圖19KDR8A的核磁圖圖20KDR8A的質(zhì)譜圖圖21KDR8B的質(zhì)譜圖圖22化合物V01的劑量效應(yīng)曲線(xiàn)圖23化合物V01對(duì)小鼠眼部新生血管和出血的影響，A：右眼V01處理，B：左眼PBS對(duì)照具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明中間體的制備步驟如下：第1步：混和米氏酸(75.3g、0.522mol)和原甲酸三乙酯(92mL，0.55mol)，加熱至55℃，維持90分鐘，然后冷卻到45℃?；衔?(92g、0.5mol)溶于甲醇(200mL)，并加入到反應(yīng)混合物中反應(yīng)45分鐘，同時(shí)保持反應(yīng)混合物的溫度低于50℃，然后在室溫下攪拌過(guò)夜，薄層色譜(PE/EA＝3：1)監(jiān)控至反應(yīng)完成。反應(yīng)混合物被冷卻到0℃，沉淀物過(guò)濾，干燥后得到白色固體純化合物2(155.9g，產(chǎn)量：96％)。第2步：化合物2(155.9g、0.441mol)在DowthermA熱導(dǎo)管中(1.1L)被加熱到100℃，然后慢慢添加到連接有DowthermA熱導(dǎo)管的燒瓶中(500mL，預(yù)熱到210℃)中，同時(shí)保持溫度高于207℃。反應(yīng)物在210℃下攪拌反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，然后冷卻到室溫。過(guò)濾收集的沉淀，用乙醚、丙酮洗后，干燥后得到棕色的固體純化合物3(67g、產(chǎn)量：61％)。第3步：在室溫下，伴隨攪拌并往三氯氧磷P℃l3(35mL)中添加化合物3(10g、0.0398mol)。添加后，反應(yīng)混合物回流攪拌3個(gè)小時(shí)，薄層色譜(二氯甲烷DCM/甲醇＝10：1)跟蹤反應(yīng)完成，再將反應(yīng)混合物注入冰水，碳酸鈉堿化調(diào)pH＝8，然后以乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)相，用鹽水洗滌，以Na2SO4干燥后，粗產(chǎn)物再由硅膠柱色譜(石油醚PE/乙酸乙酯EA＝20：1，1：1)，得到淡黃色固體純化合物4(6.0g，產(chǎn)量：56％)。第4步：將化合物4(10.0g，37mmol)、鋅粉(0.36g、5.55mmol)、Zn(CN)2(2.69g、22.9Zn)，dppf(8.82g、15.9mmol)和Pd2(dba)3(7.8g、8.51mmol)混合于DMA(50mL)中，80℃攪拌過(guò)夜。薄層色譜(PE/EA＝5：1)跟蹤至幾乎所有的化合物4被消耗。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫后倒入水中，過(guò)濾，濾液以乙酸乙酯提取，收集有機(jī)相，用鹽水洗滌，在Na2SO4上干燥濃縮獲得粗產(chǎn)物，硅膠柱色譜純化(PE/EA＝50：1，10：1)獲得淡黃色固體純化合物5(6.0g，產(chǎn)量：62.3％)。第5步：混合化合物5(6.0g、23.08mmol)、氫氧化鈉(10g、250mmol)在乙二醇(70mL)和水(10mL)在回流蒸餾器攪拌3小時(shí)。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)跟蹤至反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，加入檸檬酸水溶液并酸化到pH＝4，過(guò)濾，沉淀干燥后得到淡黃色固體純化合物6(6.0g，產(chǎn)量：93.2％)。第6步：攪拌混和化合物6(6.0g、21.5mmol)于甲醇(100mL)中，在0℃逐滴添加SOCl2(4.7mL，64.5mmol)。添加后，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1個(gè)小時(shí)，然后加熱回流過(guò)夜。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)跟蹤至反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)除去大部分溶劑，殘留物注入冰水，添加固體碳酸鈉調(diào)節(jié)pH＝8，并用乙酸乙酯提取，收集有機(jī)相，用鹽水洗滌后，在Na2SO4上干燥，濃縮獲得褐黃色固體化合物7(3.9g，產(chǎn)量：61.9％)。第7步：混和化合物7(3.9g、13.3mmol)和10％Pd/C(1.0g)在甲醇(150mL)中，在室溫下H2氣中攪拌2小時(shí)。薄層色譜(PE/EA＝2：1)跟蹤至反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，濾液濃縮后得到棕色的固體化合物8(2.6g，產(chǎn)量：96.3％)。第8步：攪拌混和化合物8(0.5g、2.46mmol)于甲醇(5mL)中，室溫下添加2NNaOH(2.5mL，5mmol。添加后，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌夜。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)指示反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，殘留物用水稀釋?zhuān)⒂靡宜嵋阴ヌ崛。瑮壢ヒ宜嵋阴?，水相添加檸檬酸水溶液并調(diào)節(jié)pH＝2，過(guò)濾，沉淀干燥后得到純化合物9(0.4g，產(chǎn)量：86％)。第9步：混和化合物9(0.4g、2.11mmol)、3-三氟甲基苯胺(375mg，2.32mmol)，HATU(960mg，2.53mmol)和DIPEA(820mg，6.33mmol)在DMF(5mL)室溫下于N2中攪拌過(guò)夜。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)顯示反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋后乙酸乙酯提取，收集有機(jī)相，用鹽水洗滌，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物，由硅膠柱色譜純化后獲得黃色的固體純化合物10(0.4g，產(chǎn)量：57％)。實(shí)施例2化合物V01(本發(fā)明中亦可記為V01)的制備步驟1：化合物11A(20g、0.15mol)、DMAP(1.9g、15.4mmol)和(BoC)2O(75g，0.34mol)，在四氫呋喃(750mL)中混合，反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。薄層色譜(PE/EA＝3：1)顯示反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物濃縮后懸浮于PE/EA(10：1，200mL)，過(guò)濾后得到白色固體純化合物11(50g，100％)。步驟2：混合化合物10(50mg，0.15mmol)和Cs2CO3(150mg，0.45mmol)于DMSO(1mL)中，在N2中室溫?cái)嚢璋雮€(gè)小時(shí)，然后加入化合物11(60mg)。由此產(chǎn)生的反應(yīng)混合物攪拌半個(gè)小時(shí)，用薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)檢測(cè)至反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物加水稀釋后，用EA提取，收集有機(jī)相，用鹽水洗滌，以Na2SO4干燥后，色譜純化后制備黃色的固體純化合物12(30mg，32％)。室溫下N2中攪拌混合化合物12(20mg，0.032mmol)和TFA(0.1mL)半個(gè)小時(shí)。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)顯示至反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物由Na2CO3堿化后，用DCM提取，收集有機(jī)相，用鹽水洗滌，以Na2SO4上干燥，濃縮后獲得粗產(chǎn)物，由硅膠柱色譜純化后獲得黃色的固體純化合物V01(4.5mg，33％)，結(jié)構(gòu)鑒定參見(jiàn)圖8。實(shí)施例3化合物V3(本發(fā)明中亦可記為V03)的制備步驟1：攪拌混和化合物13(5.0g，45mmol)和吡啶(200mL)，65℃下將(Boc)2O(14.7g，67.5mmol)滴加到上述混合物中。添加后，在85℃攪拌反應(yīng)4小時(shí)。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)跟蹤至反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物冷卻到0℃，加入濃HCl(100mL)和H2O(50mL)，EA提取后，收集有機(jī)相，用NaHCO3水溶液洗滌，以Na2SO4干燥后，得到黃色的油狀物，將其懸浮于Et2O，過(guò)濾，獲得白色固體化合物14(4.3g，產(chǎn)量：45.2％)。攪拌混和化合物14(2.4g、11.4mmol)和N，N二甲基苯胺(6.6mL)于DCM(84mL)中，0℃N2中，滴加POCl3(3.2mL，34.2mmol)。添加后，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。薄層色譜(PE/EA＝2：1)跟蹤至反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物注入冰水。有機(jī)相用鹽水洗，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物，由硅膠柱色譜純化，獲得白色固體純化合物15(1.8g，70％)。在THF(1mL)中攪拌混和化合物15(100mg，0.47mmol)和DMAP(12mg，0.09mmol)，室溫下加入(BOC)2O(124mg，0.57mmol)，然后室溫下攪拌過(guò)夜。薄層色譜(PE/EA＝2：1)表明反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物用水稀釋?zhuān)珽A提取，收集有機(jī)相，用鹽水洗，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物，由硅膠柱色譜純化，獲得白色固體純化合物16(70mg，44.8％)。室溫下，在N2中DMSO(1mL)中攪拌混和化合物10(50mg，0.15mmol)和Cs2CO3(150mg，0.45mmol)半小時(shí)，然后加入化合物16(60mg，0.18mmol)，再攪拌半小時(shí)。薄層色譜(PE/EA＝2：1)表明反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物用水稀釋?zhuān)珽A提取，收集有機(jī)相，用鹽水洗，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物，由硅膠柱色譜純化，獲得黃色固體純化合物17(50mg，53.3％)。步驟2：室溫下，在N2中DMSO(1mL)中攪拌混和化合物17(50mg，0.08mmol)和TFA(0.2mL)半小時(shí)。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成后，這個(gè)反應(yīng)混合物由Na2CO3堿化后，用DCM提取。有機(jī)相是用鹽洗，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物，由硅膠柱色譜純化后獲得黃色的固體純化合物V3(15mg，44％)，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖9。實(shí)施例3化合物V4(本發(fā)明中亦可記為V04)的制備步驟1：攪拌混和化合物18(50g，0.47mol)于DCM(600mL)中，加入TEA(94g，0.93mol)，然后在0℃，N2中，滴加溴乙酸乙酯(94g，0.56mol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。薄層色譜(PE/EA＝1：1)表明反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合物用鹽水洗，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物，由硅膠柱色譜純化(用PE/EA＝20：1to10：1to5：1洗脫)，獲得黃色油狀純化合物19(46g，51％)。95℃下，在甲苯(800mL)攪拌混和化合物19(38g，196.65mmol)和TEA(29.9g，295mmol)，逐滴加入4-溴丁酸乙酯(72.9g，373.65mmol).加完后回流加熱過(guò)夜。薄層色譜(PE/EA＝5：1)表明反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合物濃縮，由硅膠柱色譜純化(用PE/EA＝20：1to5：洗脫)，獲得黃色油狀純化合物20(32g，yield：53％)。在甲苯(800mL)中攪拌混和化合物20(32g，104.3mmol)，0℃下，加入t-BuOK(51.2g，456.3mmol)。添加后，反應(yīng)混合物在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。薄層色譜(PE/EA＝5：1)表明反應(yīng)完成后，添加2NHCl調(diào)節(jié)pH＝6，然后EA提取，收集有機(jī)相，用鹽水洗，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物21(17g，yield：62.5％)，為暗黃色油，可直接用于下一步反應(yīng)，不需進(jìn)一步純化。MeONa((11g，161.65mmol)溶于甲醇(280mL)，反應(yīng)混合物被冷卻到5℃，再加入乙酸甲脒(3.0g，29.15mmol)。攪拌反應(yīng)混合物半個(gè)小時(shí)，再加入化合物21(17g、65.1mmol)。將反應(yīng)混合物40℃攪拌過(guò)夜。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，蒸發(fā)除去大部分的溶劑。殘留物水處理和EA提取，有機(jī)相用鹽水洗，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物，由硅膠柱色譜純化獲得淡黃色固體純化合物22(2.5g，產(chǎn)量：16％)。在壓力為0.5MPaH2中，攪拌過(guò)夜混和化合物22(2.5g，10.4mmol)，10％Pd/C(0.5g)和(B℃)2O(2.7g，12.4mmol)于MeOH(40mL)中。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物過(guò)濾濃縮得到黃色固體純化合物23(2.6g，100％)。在1，2-DCE(64mL)中混和化合物23(1.6g，6.3mmol)，PPh3(3.33g，12.6mmol)和CCl4(2.93g，18.9mmol)，70℃加熱1小時(shí)。薄層色譜(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物濃縮后，由硅膠柱色譜純化獲得淡黃色固體純化合物24(1.38g，81％)。室溫N2中，在DMSO(2mL)中攪拌混和化合物10(100mg，0.3mmol)和Cs2CO3(300mg，0.9mmol)半個(gè)小時(shí)，再加入化合物24(97mg，0.36mmol)。反應(yīng)混合物攪拌混合半小時(shí)。薄層色譜(DCM/MeOH＝10：1)表明反應(yīng)完成后，反應(yīng)物用水稀釋?zhuān)缓驟A提取。有機(jī)相用鹽水洗，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物，將反應(yīng)混合物濃縮后由硅膠柱色譜純化獲得黃色固體純化合物25(21mg，12.4％)。步驟2：室溫N2中，中攪拌混和化合物25(21mg，0.037mmol)和TFA(0.2mL)半個(gè)小時(shí)。薄層色譜(DCM/MeOH＝10：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物由Na2CO3堿化后，用DCM提取。有機(jī)相用鹽水洗，在Na2SO4上干燥濃縮后獲得粗產(chǎn)物，由硅膠柱色譜純化后獲得黃色的固體純化合物V4(10mg，57.9％)，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖10。實(shí)施例4化合物V5(本發(fā)明中亦可記為V05)的制備步驟1：(S)-1-苯基乙胺(10g，8.26mmol)和乙基乙酰丙酸(11.9g，8.26mmol)的1，2-DCE(200mL)溶液中，分批加入NaBH(OAc)3(35g，16.52mmol)。加完后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物加入NaHCO3水溶液堿化，并以DCM萃取，分離有機(jī)相，并用飽和食鹽水洗滌，在Na2SO4上干燥，并濃縮得到粗的化合物34(20.5g，收率：100％)，可不經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于下一步驟中。在1，2-DCE(200mL)中攪拌混和化合物34(20.5g，82mmol)和乙醛酸乙酯((33mL，165mmol，50％的甲苯溶液)，NaBH(OAc)3(35g，165mmol)，在室溫下攪拌4小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物用NaHCO3水溶液堿化，并以DCM萃取。分離有機(jī)相并用飽和食鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮得到粗的化合物35(26g，100％)，可不經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于下一步驟中?；衔?5(26g，78mmol)和t-BuOK(22g，156mmol)在甲苯(600mL)中的混合，攪拌回流過(guò)夜。然后將反應(yīng)混合物用NaHCO3水溶液堿化并以DCM萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗化合物36。取粗化合物36通過(guò)硅膠色譜法(PE/EA＝20：1洗脫)純化，得到純的化合物37(3g)。在乙醇(50mL)中的混合化合物37(3.0g，0.01mol)和甲脒乙酸鹽(3.24g，0.03mol)，混合物中溶液中加入NaOEt(2.38g，0.035mol)。攪拌該反應(yīng)混合物于90℃過(guò)夜，然后蒸發(fā)以除去大部分的溶劑。殘余物用H2O稀釋?zhuān)?NHCl酸化至pH為6，然后用DCM萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)硅膠色譜法純化，得到純的化合物38(1.0g，收率：35.8％)，為黃色固體。將化合物38(1.0g，10.4mmol)，10％的Pd/C(0.1g)和(B℃)2O(2.7g，12.4mmol)混合于MeOH(40mL)中，在壓力為0.5兆帕的氫氣中攪拌過(guò)夜。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，將濾液濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)硅膠色譜法純化，得到純的化合物39(0.7g，產(chǎn)率：71％)，為黃色固體。取化合物39(0.7g，6.3mmol)和三苯基膦PPh3(3.33g，12.6mmol)在四氯化碳(10mL)中混合，于80℃過(guò)夜攪拌。TLC(DCM/甲醇＝15：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物濃縮，并將殘余物通過(guò)硅膠色譜法純化，得到純的化合物40(0.4g，53.4％)，為淺黃色油狀物。在氮?dú)庀?，化合?0(150mg，0.45mmol)和Cs2CO3(440mg，1.35mmol)于DMSO(2ml)中混合，在室溫下攪拌半小時(shí)，然后加入化合物40(153mg，0.54mmol)。將所得的反應(yīng)混合物攪拌半小時(shí)，TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋并用EA萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)制備的TLC純化，得到純的化合物41(60mg，23％)，為黃色固體。步驟2：取化合物41(60mg，0.104mmol)和TFA(0.3mL)的混合物在氮?dú)庀?，室溫?cái)嚢璋胄r(shí)。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物NaHCO3水溶液堿化并以DCM萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，在Na2SO4上干燥濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)制備的TLC純化，得到純化合物V5(20mg，40.3％)，為黃色固體，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖11、12。實(shí)施例5化合物V6(本發(fā)明中亦可記為V06)的制備步驟1：配備有機(jī)械攪拌器和氯化鈣管的3L的燒瓶中，裝入化合物26(100g，0.716mol)和乙醇(1.0L)。將該混合物攪拌20分鐘，然后滴加三乙胺(72.5g，0.716mol)。將所得的混合物攪拌10分鐘，然后，加入丙烯酸乙酯(61.6g，0.716mol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌17小時(shí)。(BOC)2O(234.5g，1.08mol)在室溫下逐滴加入。滴加結(jié)束后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物濃縮以除去大部分EtOH中。將殘余物溶解在水(3L)中，并用Et2O(1L×3)萃取。合并的有機(jī)相用氯化銨(500L×3)水溶液和鹽水(500L×3)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，并濃縮得到粗的化合物28(300g，92％)，為黃色油狀物，其用于下一步驟而無(wú)需額外的純化。鈉(27.6g，0.765mol)加入無(wú)水乙醇(1.5L)中。當(dāng)固體鈉完全消失，將化合物28(300g，1.04mol)加入熱溶液中。反應(yīng)混合物回流過(guò)夜。薄層色譜法(石油醚/乙酸乙酯＝4：1)表明起始原料完全被消耗。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，將殘余物溶解在水(1L)中，然后檸檬酸水溶液酸化至pH為6。然后將混合物用EtOAc(1升×3)萃取。將萃取液合并，并用鹽水(1L×3)洗滌，在Na2SO4干燥并蒸發(fā)，得到化合物29(169g，63.4％)，為棕色油狀物。該粗產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步純化用于下一步驟。甲醇鈉(2.6g，48.58mmol)溶解于MeOH(50mL)中，并將該溶液冷卻至5℃。加入醋酸甲脒(3.0g，29.15mmol)，將反應(yīng)混合物攪拌半小時(shí)。再加入化合物29(5.0g，19.43mmol)，將反應(yīng)混合物攪拌回流過(guò)夜。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并蒸發(fā)以除去大部分溶劑。將殘余物用水處理并用EA萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)硅膠色譜法純化，得到純的化合物30(680mg，收率：14.7％)，為淺黃色固體。在0℃氮?dú)庀?，三氯氧?P℃l3，174mg，1.26mmol)加入到攪拌混合有化合物30(100mg，0.42mmol)和N，N-二甲基苯胺(0.28mL)的DCM(4mL)中，加完后，將反應(yīng)混合物傾入冰水中，通過(guò)加入固體碳酸鈉堿化，然后用DCM萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)制備TLC純化，得到純的化合物31(60mg，55.6％)，為白色固體。在氮?dú)庀拢衔?0(50mg，0.15mmol)和Cs2CO3(150mg，0.45mmol)混合于DMSO(1mL)中，混合物在室溫下攪拌半小時(shí)，然后加入化合物31(46mg，0.18mmol)。將所得的反應(yīng)混合物攪拌半小時(shí)，TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋并用EA萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)制備的TLC純化，得到純的化合物32(13mg，15.7％)，為黃色固體。步驟2：氮?dú)庀?，化合?2(13mg，0.038mmol)和TFA(0.1mL)的混合物室溫下攪拌半小時(shí)。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)用混合物用Na2CO3水溶液堿化和DCM萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)制備TLC純化，得到純的化合物，V6(6mg，收率：56.3％)，為黃色固體，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖13。實(shí)施例6KDR3的制備方法第1步：將化合物1(1.4克，0.01mmol)，4-(芐氧基甲基)-6-氯嘧啶(4.7克，0.02)和K2CO3(4.2克，0.03摩爾)在DMF(50mL)中混合，在100℃、N2下攪拌為5小時(shí)。TLC(PE/EA＝4：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并用水稀釋?zhuān)肊A萃取。收集有機(jī)相，用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)柱層析純化，得到純的化合物2(3.0克，產(chǎn)率：90％)，為黃色固體。步驟2：在N2氣氛下，化合物2(1.2克，3.56毫摩爾)，水合肼(0.36克，7.12毫摩爾)和RaneyNi(0.2g)的THF(20mL)中的混合物回流攪拌1小時(shí)。TLC(PE/EA＝2：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，過(guò)濾濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)柱層析純化，得到純的化合物3(0.8克，產(chǎn)率：73％)，為黃色固體。步驟3：在0℃在氮?dú)庀?，將TCDI(0.78克，4.4mmol)和化合物3(0.9克，2.93mmol)在干燥的DCM(10mL)中緩慢混合。加完后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌半小時(shí)。TLC(PE/EA＝1：1)表明反應(yīng)混合物中完成。將反應(yīng)混合物濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其用閃蒸色譜法純化，得到粗化合物4(1.0克，產(chǎn)率：100％)，為灰白色固體。步驟4：將化合物4(1.1克，3.15毫摩爾)，4-甲基-5-(三氟甲基)苯1，2-二胺(0.6克，3.15毫摩爾)和碳二亞胺(1.2克，6.30毫摩爾)的THF(50毫升)在氮?dú)庀?，回流下攪?小時(shí)。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明，反應(yīng)混合物中完成。與EA稀釋該反應(yīng)混合物，并過(guò)濾沉淀物。將濾液蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物，將其用柱色譜法(PE/EA＝10：1至4：1)純化，得到純的化合物5(0.8克，產(chǎn)率：50％)，為棕色油狀物。步驟5：化合物5(0.7克，1.38毫摩爾)和TFA(15ml)中的混合物于60℃過(guò)夜攪拌。將反應(yīng)混合物升溫至70℃，并在此溫度下攪拌1小時(shí)。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明，反應(yīng)混合物中完成。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并傾入冰水中，用2N的NaOH堿化至pH為10，然后用EA萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮，得到化合物6的粗產(chǎn)物(0.4g，收率：70％)，為黃色油狀物，其不經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于下一個(gè)步驟。步驟6：在攪拌著的化合物6(60mg，每日0.1445mmol)的DCM(5ml)中，加入TEA(30毫克，0.289mmol)和MSCL(25毫克，0.2168mmol)在0℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下。滴加結(jié)束后，反應(yīng)結(jié)束。將該混合物用DCM稀釋?zhuān)名}水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到化合物7的粗產(chǎn)物，它不經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于下一步驟中。第7步：化合物7(60毫克，0.12毫摩爾)和MeNH2(0.6毫升，1.2毫摩爾，在MeOH中的2N)的無(wú)水THF(5ml)中的混合物于室溫過(guò)夜攪拌。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明，反應(yīng)混合物中完成。將反應(yīng)混合物濃縮并純化殘余物，TLC純化三次，得到純KDR3(6毫克，產(chǎn)率：12％)，為白色固體，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖14。實(shí)施例7KDR4化合物制備第一步：將化合物1(1.0克，4.5毫摩爾)在A(yíng)CN(20毫升)中混合2-氯-5-硝基吡啶2-氯-5-硝基吡啶(0.8克，5毫摩爾)和碳酸銫(3.3克，10毫摩爾)，在室溫下攪拌過(guò)夜。TLC(PE/EA＝1：1)表明反應(yīng)混合物中完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋?zhuān)肊A萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)快速色譜純化，得到純的化合物2(0.4克，收率：24.5％)，為黃色固體。第二步：向化合物2(0.3克，0.83毫摩爾)的THF(5mL)中的攪拌混合物中加入阮內(nèi)鎳(0.1克)，然后加熱至回流。H2N-NH2H2O(1.66毫摩爾)的THF(5mL)中的溶液逐滴加入。將所得的反應(yīng)混合物攪拌10分鐘。TLC(DCM/甲醇＝15：1)表明，反應(yīng)混合物中完成。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，過(guò)濾濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)快速色譜純化，得到純的化合物3(0.16克，產(chǎn)率：50％)，為黃色固體。第三步：在化合物3(0.16克，0.483mmol)的攪拌溶液中，在0℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在DCM(10mL)中加入TCDI(95mg，0.531mmol)。滴加結(jié)束后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌。過(guò)夜。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明，反應(yīng)混合物中完成。將反應(yīng)混合物濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)快速色譜純化，得到純的化合物4(50毫克，產(chǎn)率：28％)為灰白色固體。第四步：將化合物4(50毫克，0.134mmol)，4-甲基-5-(三氟甲基)-苯-1，2-二胺(25.5mg，0.134毫摩爾)和EDCI(51米克，0.268毫摩爾)在無(wú)水THF(10mL)中，氮?dú)庀禄亓鲾嚢?小時(shí)。TLC(DCM/MEOH＝15：1)表明，反應(yīng)混合物中完成。稀釋反應(yīng)混合物，用EA和過(guò)濾沉淀物，得到粗產(chǎn)物，將其由預(yù)TLC純化，得到純的化合物5(40毫克，收率：56％)，為白色固體。第五步：化合物5(20毫克，0.038毫摩爾)和三氟乙酸(0.2毫升)的混合物，在室溫下攪拌半小時(shí)。TLC(DCM/甲醇＝5：1)表明反應(yīng)混合物中完成。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)以除去TFA，將殘余物溶解在THF中，由固體K2CO3堿化，過(guò)濾并濃縮濾液，得到純化合物KDR4(10毫克，產(chǎn)率：62.5％)，為白色固體，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖15。實(shí)施例10KDR6化合物制備第一步：7-甲氧基喹啉-4-醇(10.0克，57.1mmol)溶解在50ml三氯氧磷，然后將反應(yīng)混合物在120℃加熱3小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫，并倒入冰水(50毫升)。用EtOAc萃取該混合物(100mLx3)，將有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其用閃式色譜法(與PE/EA＝30：1洗脫)純化，得到的產(chǎn)物(8.5克，收率：76.9％)，為白色固體。第二步：4-氯-7-甲氧基喹啉(5.5G，28.4mmol)，鋅(276.9mg，4.26mmol)，Zn(CN)2(2.07克，17.6mmol)，DPPF(6.65克，12.21mmol)，PD2(DBA)3(5.98克，6.53mmol)溶解在100mL的DMAc中，將混合物用氬氣覆蓋并加熱在160℃過(guò)夜，然后將混合物冷卻至室溫，并通過(guò)硅藻土過(guò)濾，將濾液用H2O處理，然后用EA萃取將有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥，并在真空下濃縮。通過(guò)閃式色譜法(與PE/EA＝10：1洗脫)純化，得到產(chǎn)物7-甲氧基喹啉-4-甲腈(4.38克，收率：83.7％)，為棕色固體。第三步：7-甲氧基喹啉-4-甲腈(4.38克，23.78mmol)溶解在30mL的H2O中，加入氫氧化鈉(2.38克，59.45mmol)。然后將混合物加熱至100℃過(guò)夜。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并用EA萃取，以除去雜質(zhì)。將水相酸化，通過(guò)加入6N鹽酸至pH為2。將黃色的沉淀物通過(guò)過(guò)濾收集并干燥，得到2.5g的7-甲氧基喹啉-4-羧酸，產(chǎn)率52％，為棕色固體。第四步：7-甲氧基喹啉-4-羧酸(2.0克，9.84mmol)和DIPEA(3.82克，29.52mmol)溶解在DMF中。然后將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，加入HATU(4.49克，11.81mmol)和3-(三氟甲基)苯胺(1.74克，10.82mmol)。該混合物用氬氣覆蓋，然后在室溫下攪拌過(guò)夜。該混合物用水稀釋并用EtOAc(3×50毫升)萃取。洗滌有機(jī)層，用鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥，并在真空下濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)快速色譜純化，與PE/EA＝1：1洗脫，得到產(chǎn)物(2.5g，收率：79.6％)為淺黃色固體。第五步：7-甲氧基-N-(3-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-甲酰胺(0.6克，1.733mmol)于DCM(50毫升)溶液中，10℃氮?dú)庀轮鸬渭尤隑Br3(1.73mL，6.93毫摩爾。加完后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌100小時(shí)。TLC(DCM/甲醇＝15：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物傾入冰-水中并用DCM萃取。洗滌有機(jī)層，用鹽水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，濃縮的產(chǎn)物，為棕色固體(0.5克，產(chǎn)率：87％)，將其用于下一步，無(wú)需進(jìn)一步純化。第六步：將7-羥基-N-(3-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-甲酰胺(50毫克，0.151mmol)，叔丁基(6-氯嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(46.6mg，0.181mmol)和K2CO3(41.7mg，0.302mmol)在DMSO(2ml)溶液中混合，在90℃攪拌過(guò)夜。TLC(PE/EA＝1：2)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋并用EA萃取。洗滌有機(jī)層，用鹽水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，濃縮，粗品，這是通過(guò)預(yù)-TLC純化，得到純的產(chǎn)物(25毫克，產(chǎn)率：30％)，為白色固體。第七步：叔丁基甲基((6-(4-(3-(三氟甲基)苯基氨基甲?；?喹啉-7-基氧基)嘧啶-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(25毫克，0.045mmol)和TFA(0.25毫升)的混合物，在0℃下攪拌半小時(shí)。TLC(DCM/甲醇＝5：1)表明反應(yīng)完成。蒸發(fā)TFA，并將殘余物通過(guò)水溶液堿化。Na2CO3和用DCM萃取。洗滌有機(jī)相，用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)預(yù)-TLC純化，得到純的化合物06(7毫克，收率：21％)，為白色固體，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖16。實(shí)施例11KDR6A化合物制備第一步：7-甲氧基喹啉-4-醇(10.0克，57.1mmol)溶解在50ml三氯氧磷，然后將反應(yīng)混合物在120℃加熱3小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫，并倒入冰水(50毫升)。用EtOAc萃取該混合物(100mLx3)，將有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其用閃式色譜法(與PE/EA＝30：1洗脫)純化，得到的產(chǎn)物(8.5克，收率：76.9％)，為白色固體。第二步：4-氯-7-甲氧基喹啉(5.5G，28.4mmol)，鋅(276.9mg，4.26mmol)，鋅(CN)2(2.07克，17.6mmol)，DPPF(6.65克，12.21mmol)，PD2(DBA)3(5.98克，6.53mmol)溶解在100mL的DMAc中，將混合物用氬氣覆蓋并加熱在160℃過(guò)夜，然后將混合物冷卻至室溫，并通過(guò)硅藻土過(guò)濾，將濾液用H2O處理，然后用EA萃取將有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥，并在真空下濃縮。通過(guò)閃式色譜法(與PE/EA＝10：1洗脫)純化，得到產(chǎn)物7-甲氧基喹啉-4-甲腈(4.38克，收率：83.7％)，為棕色固體。第三步：7-甲氧基喹啉-4-甲腈(4.38克，23.78mmol)溶解在30mL的H2O中，加入氫氧化鈉(2.38克，59.45mmol)。然后將混合物加熱至100℃過(guò)夜。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并用EA萃取，以除去雜質(zhì)。將水相酸化，通過(guò)加入6N鹽酸至pH為2。將黃色的沉淀物通過(guò)過(guò)濾收集并干燥，得到2.5g的7-甲氧基喹啉-4-羧酸，產(chǎn)率52％，為棕色固體。第四步：7-甲氧基喹啉-4-羧酸(406mg，2毫摩爾)和DIPEA(775mg，6毫摩爾)溶解在DMF(5mL)中。將反應(yīng)混合物冷卻至5℃，然后加入HATU(912mg，2.4mmol)和4-氟-3-(三氟甲基)苯胺(394mg，2.2毫摩爾)。該混合物在環(huán)境溫度下用氬氣和覆蓋，過(guò)夜。TLC(PE/EA＝1：2)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋并用EA萃取。洗滌有機(jī)層，用鹽水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，并濃縮，粗產(chǎn)物，將其由CCTO純化，得到純的產(chǎn)物(220毫克，收率：30％)，為棕色固體。第五步：在N-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基)-7-甲氧基喹啉-4-甲酰胺(0.2克，0.549mmol)的DCM(10ml)溶液中，0℃下N2氣氛下攪拌加入4NBBr3(0.68毫升，2.75mmol)的DCM溶液。加完后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌為20小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物在-30℃攪拌4小時(shí)。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明起始原料依然。將反應(yīng)混合物傾入冰-水中并用DCM萃取。將有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其由預(yù)TLC純化，得到的原料(120毫克)和純的產(chǎn)物N-(4-氟-3-(三氟甲基基)苯基)-7-羥基喹啉-4-甲酰胺(60毫克，78％)，為白色固體。第六步：將N-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基)-7-羥基喹啉-4-甲酰胺(30毫克，0.086mmol)，叔丁基(6-氯嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(26.5mg，0.103mmol)和K2CO3(23.8mg，0.172mmol)在DMF(1mL)中，50℃下攪拌15小時(shí)。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋。并提取EA。將有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)預(yù)-TLC純化，得到純的產(chǎn)物(6-(4-(4-氟-3-(三氟甲基叔丁基)苯基氨基甲?；?喹啉-7-基氧基)嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(20毫克，收率：41％)，為黃色固體。第七步：甲叔丁酯的混合物(6-(4-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基氨基甲?；?喹啉-7-基氧基)嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(20毫克，0.035mmol)和三氟乙酸(0.3毫升)在室溫下攪拌一小時(shí)。TLC(DCM/MEOH＝5：1)表明反應(yīng)完成。蒸發(fā)TFA，并將殘余物由Na2CO3堿化并用DCM萃取。洗滌有機(jī)相，用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)預(yù)-TLC純化，得到純的化合物06A(5毫克，收率：30％)，為黃色固體，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖17。實(shí)施例12KDR8化合物制備第1步：草酸二乙酯(70毫升)的混合物加熱到120℃，加入化合物1(50克，0.4mol)，并將混合物加熱到180℃的，維持5分鐘。將混合物冷藏過(guò)夜，過(guò)濾收集白色沉淀物，干燥，從而得到白色粉末狀的化合物2(75.0克，收率：59.11％)。步驟2：將化合物2(25克，0.11摩爾)溶解在沸騰的二甲苯(1L)中，緩慢地加入P2S5(9.5克，0.0385摩爾)，回流，直到反應(yīng)完成(約5小時(shí))，再繼續(xù)回流。酰胺TLC(PE/EA＝5/1)表明該反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物冷卻，并用1NNaOH萃取，水相用鹽酸酸化，收集黃色沉淀物，然后將其溶解在EtOAc中，用H2O洗滌，用Na2SO4干燥，并濃縮，得到的化合物3(19克，收率：70.9％)為一種紅色油狀物。步驟3：化合物3(30克，0.142摩爾溶于1N氫氧化鈉(500mL)中，用鐵氰化鉀(135克，0.416mol，在340ml水中)氧化，通過(guò)緩慢加入硫代酰胺到鐵氰化物溶液來(lái)進(jìn)行，使溫度保持低于10℃。在1小時(shí)后，TLC(DCM/MeOH中＝3/1)表明反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物在與水中稀釋?zhuān)峄?由2N的HCl至pH為6)，然后過(guò)濾，得到的化合物4(15g，收率：50.48％)。步驟4：化合物4(1克，4.34毫摩爾)在DMF(20mL)中攪拌溶解，加入1-methyl-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-3-amine(0.717g，4.35mmol)，隨后加入在室溫氮?dú)庵屑尤際ATU(2.47g，6.5mmol)和DIEA(1.12g，8.6mmol)。在相同的的溫度下下攪拌過(guò)夜后，TLC(PE/EA＝2/1)表明該反應(yīng)完成。該反應(yīng)混合物被傾入水中，并用EtOAc萃取。洗滌將有機(jī)的相，用鹽水洗滌，在Na2SO4上干燥并濃縮，得到粗的的產(chǎn)品，由硅膠色譜法(PE/EA洗脫＝20/1-5/1)進(jìn)行純化，，得到純的化合物5(900毫克，收率：75.5％)。步驟5：-10℃氮?dú)庵?，在化合?(0.4g，1.12mmol)的DCM(10mL)溶液中，加入BBr3(10mL，4NinDCM)。4小時(shí)后，TLC(PE/EA＝1/1)表明反應(yīng)完成了。然后反應(yīng)中加入冰，過(guò)濾除去未溶解的材料。分離濾液，用DCM萃取。將有機(jī)相用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗的的產(chǎn)品，這進(jìn)行純化，由TLC得到純的化合物6的化合物(100mg，收率：26.02％)。步驟6：化合物6的溶液(50mg，0.146mmol)的DMF(10mL)溶液中加入K2CO3(70mg，0.500mmol)和tert-butyl(6-chloropyrimidin-4-yl)methyl(methyl)carbamate(41.41mg，0.161mmol)。將反應(yīng)混合物在50℃氮?dú)庀聰嚢柽^(guò)夜。TLC(PE/EA＝1/1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水洗滌，用EA萃取。有機(jī)相用鹽洗滌4次，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗的的產(chǎn)品，由TLC純化得到純化合物7(40mg，收率：48.59％)。第7步：化合物7(40mg，0.071mmol)和TFA(0.4mL)在氮?dú)庀率覝鼗旌希瑪嚢璋胄r(shí)。TLC(DCM/甲醇＝10/1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)以除去TFA。將殘余物堿化，用Na2CO3堿化至pH9，然后用DCM萃取。將有機(jī)相用鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)TLC純化，得到純的化合物8(20mg，收率：44％)。其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖18。實(shí)施例13KDR8A化合物制備第1步：草酸二乙酯(70毫升)加熱到120℃，加入化合物1(50克，0.4mol)，并將混合物加熱到180℃，加熱時(shí)間為：5分鐘。冷卻后，混合物在冰箱中過(guò)夜，加入50毫升水，然后形成白色沉淀物。收集該固體，干燥，得到白色粉末狀的化合物的2(75.0克，收率：59.11％)。步驟2：將化合物2(25克，0.11摩爾)溶解在沸騰的二甲苯(1L)中，緩慢加入P2S5(9.5克，0.0385摩爾)，回流，直到反應(yīng)完成(約5小時(shí))，再繼續(xù)回流。TLC(PE/EA＝5/1)表示反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物冷卻，并用1NNaOH萃取，水相用鹽酸酸化，收集黃色沉淀物，然后將其溶解在EtOAc中，用H2O洗滌，用Na2SO4干燥，并濃縮，得到的化合物3(19克，收率：70.9％)，為紅色油狀物。步驟3：粗化合物3(30g，0.142mol)溶解在1N氫氧化鈉(500mL)中，用鐵氰化鉀(135克，0.416mol，在340ml水中)氧化，通過(guò)緩慢加入硫代酰胺到鐵氰化物溶液來(lái)進(jìn)行，使溫度保持低于10℃。在1小時(shí)后，TLC(DCM/MeOH中＝3/1)表明反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物在水中稀釋?zhuān)?N的HCl調(diào)節(jié)至pH為6，然后過(guò)濾，得到的化合物4(15g，收率：50.48％)步驟4：化合物4(1克，4.78毫摩爾)在DMF(40毫升)溶液中加入3-(三氟甲基)苯胺，隨后加入HATU(2.73克，7.17毫摩爾)和DIEA(1.24克，9.56毫摩爾)，在室溫氮?dú)庀聰嚢?。在相同的溫度下攪拌過(guò)夜后TLC(PE/EA＝2/1)表明反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物傾入水中，并用EtOAc萃取。洗滌有機(jī)相，用鹽水洗滌，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)硅膠色譜(與PE/EA＝20/1-5/1洗脫)純化，得到純的化合物5(1.68克，收率：99.0％)。步驟5：-10℃在氮?dú)庀?，化合?(0.1克，0.283毫摩爾)的DCM(10mL)溶液中加入4NBBr3(0.5mL)。4小時(shí)后，TLC(PE/EA的＝1/1)表明反應(yīng)完成后，加入冰，然后過(guò)濾以除去所述未溶解的材料。濾液用DCM萃取。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通TLC純化，得到純的化合物6(64mg，收率：66.65％)。步驟6：化合物6(64毫克，0.189毫摩爾)DMF(10毫升)溶液中，加入K2CO3(78毫克，0.567毫摩爾)和叔丁基(6-氯嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(tert-butyl(6-chloropyrimidin-4-yl)methyl(methyl)carbamate，53毫克，0.208毫摩爾)。將反應(yīng)混合物在氮?dú)庀?0℃攪拌過(guò)夜，TLC(PE/EA＝1/1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水洗滌，EA萃取。洗滌有機(jī)相，用鹽水洗滌四次，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)預(yù)-TLC純化，得到純的化合物7(20mg，收率：19.68％)。第7步：化合物7(20毫克，0.035毫摩爾)和TFA(0.2mL)的混合物，在氮?dú)庀率覝財(cái)嚢璋胄r(shí)。TLC(DCM/MeOH中＝10/1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)除去TFA。將殘余物由sNa2CO3調(diào)節(jié)pH為9，然后用DCM萃取。洗滌有機(jī)相，用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)預(yù)-TLC純化，得到純的化合物KDR08A(12mg，收率：73.07％)，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖19、22。實(shí)施例14KDR8B化合物制備第1步：草酸二乙酯(70毫升)的混合物加熱到120℃，加入化合物1(50克，0.4mol)，并將混合物加熱到180℃，維持5分鐘。將混合物后冷藏過(guò)夜，形成白色沉淀物。收集該固體被通過(guò)過(guò)濾中，并干燥，從而得到為白色粉末狀的化合物的2(75.0克，收率：59.11％)。步驟2：將化合物2(25克，0.11摩爾)溶解在沸騰的二甲苯(1L)中，緩慢地加入P2S5(9.5克，0.0385摩爾)，回流，直到將反應(yīng)物完成(約5小時(shí)).TLC(PE/EA＝5/1)表明反應(yīng)完成。該反應(yīng)混合物冷卻，并用1NNaOH的萃取，水相用鹽酸酸化，收集黃色沉淀物，然后將其溶解在EtOAc中，用H2O洗滌，用Na2SO4干燥，并濃縮，得到的化合物3(19克，收率：70.9％)為紅色油狀物。步驟3：化合物3(30克，0.142mol)溶解在1N氫氧化鈉(500毫升)中，用鐵氰化鉀(135克，0.416mol，在340ml水中)氧化，通過(guò)緩慢加入硫代酰胺到鐵氰化物溶液來(lái)進(jìn)行，使溫度保持低于10℃。在1小時(shí)后，TLC(DCM/MeOH中＝3/1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物在水中稀釋?zhuān)峄?由2NHCl至pH為6，)，然后過(guò)濾，得到的化合物4(15g，收率：50.48％)。步驟4：化合物4(1克，4.78毫摩爾)的DMF(20mL)溶液中，室溫氮?dú)庀?，攪拌加?-氟-3-(三氟甲基)苯胺鹽酸鹽(4-fluoro-3-(trifluoromethyl)anilineHydrochloride，1.24克，5.74毫摩爾)，隨后加入HATU(2.73克，7.17毫摩爾)和DIEA(1.85克，14.34毫摩爾)。在相同的的溫度下攪拌過(guò)夜后，TLC(PE/EA＝2/1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物傾入水中，并用EtOAc萃取。用鹽水洗滌有機(jī)相，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)硅膠色譜(與洗脫)純化，得到純的化合物5(1.3克，收率：73.4％)。步驟5：化合物5(0.5克，1.35毫摩爾)DCM(10mL)溶液中，在-10℃氮?dú)庀?，加?NBBr3(2.5mL)，反應(yīng)4小時(shí)后，TLC(PE/EA的＝1/1)表明反應(yīng)完成。反應(yīng)中加入冰，然后過(guò)濾以除去未溶解的的材料。分離濾液，用DCM萃取。鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)預(yù)-TLC純化，得到純的化合物6(250mg，收率：51.97％)。步驟6：化合物6(70毫克，0.196毫摩爾)的DMF(10mL)溶液中，加入K2CO3(81.46毫克，0.589毫摩爾)和叔丁基(6-氯嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(tert-butyl(6-chloropyrimidin-4-yl)methyl(methyl)carbamate，55.70毫克，0.216毫摩爾)，將反應(yīng)混合物在50℃氮?dú)庀聰嚢柽^(guò)夜。TLC(PE/EA＝1/1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水洗滌，與EA萃取。洗滌有機(jī)相，用鹽水洗滌4次，在Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)TLC純化，得到純的化合物7(40毫克，39.51％)。第7步：化合物7(38毫克，0.071毫摩爾)和TFA(0.4毫升)的混合物，在氮?dú)馐覝叵聰嚢璋胄r(shí)。TLC(DCM/MeOH中＝10/1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)除去TFA。將殘余物由Na2CO3調(diào)節(jié)至pH為9，然后用DCM萃取。洗滌有機(jī)相，用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其通過(guò)TLC純化，得到純的化合物KDR8B(15毫克，47.75％)，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖21。以下通過(guò)試驗(yàn)例具體說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1斑馬魚(yú)血管發(fā)育抑制試驗(yàn)斑馬魚(yú)(Daniorerio)為鯉科(Cyprinidae)短擔(dān)尼魚(yú)屬(Danio)的一種硬骨魚(yú)。其基因與人類(lèi)基因的相似度高達(dá)85％，雌魚(yú)一次可產(chǎn)卵200～300枚，其受精和胚胎發(fā)育過(guò)程均在體外進(jìn)行，24小時(shí)內(nèi)就可發(fā)育成形，且胚胎通體透明，便于觀(guān)察體內(nèi)器官組織的變化。諸多特點(diǎn)使其成為了是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織認(rèn)可的5種魚(yú)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。目前，斑馬魚(yú)在人類(lèi)疾病研究中得到廣泛應(yīng)用，用于心血管系統(tǒng)方面的研究尤為多。實(shí)驗(yàn)方法：該實(shí)驗(yàn)使用通常作為篩查化合物對(duì)血管形成作用影響的斑馬魚(yú)為動(dòng)物模型。將出生后的斑馬魚(yú)胚胎經(jīng)挑選后，放于培養(yǎng)皿中并置于培養(yǎng)箱中撫育3-5天，本發(fā)明化合物在斑馬魚(yú)出生后按不同濃度(1μM，10μM，30μM，100μM)直接加入培養(yǎng)液中。24小時(shí)后檢查脊椎血管的發(fā)育情況并用熒光顯微鏡照相。130B為帕唑帕尼(Pazopanib)，作為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO作為陰性對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖1-4、表1a，1b。表1a：KDR系列小分子對(duì)FLK-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)血管發(fā)育的抑制作用濃度(uM)KDR3KDR4KDR6KDR8KDR8A10％0％0％0％0％100％0％0％0％0％300％10％0％0％0％10050％100％10％5％10％表1bKDR系列小分子對(duì)FLK-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)血管發(fā)育的抑制作用AI：血管抑制率由圖1-4可知，本發(fā)明化合物KDR4及V01-v6均能抑制斑馬魚(yú)血管發(fā)育，尤其是V01，v3，v6，其藥效活性顯著。由表1b可知，化合物DKR4的活性明顯優(yōu)于KDR3、KDR6、KDR8和KDR8A，化合物V01，V03的活性明顯優(yōu)于KDR4。試驗(yàn)例2本發(fā)明化合物的藥效實(shí)驗(yàn)1.對(duì)VEGFR2體外抑制試驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明化合物抑制VEGFR2激酶磷酸化的實(shí)驗(yàn)方法如下：1)將培養(yǎng)至P3-P5HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，每孔約2*105細(xì)胞2)待細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80％，加入候選小分子抑制劑(10nM，100nMor1μM)，孵育30min3)加入VEGF50ng/ml進(jìn)行刺激，持續(xù)10min4)加入非變性裂解液終止反應(yīng)、收集細(xì)胞裂解液、進(jìn)行蛋白定量5)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，將膜切下后用5％脫脂奶配制的TTBS緩沖液(Tris-bufferedsaline/0.01％Tween20)封閉2小時(shí)6)洗膜，用抗磷酸化VEGFR2抗體(1：1000稀釋)4℃封閉過(guò)夜7)第2天洗膜后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗與膜共孵育1小時(shí)8)洗膜后用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore)顯色，照相。試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖5。由圖5可知，本發(fā)明化合物KDR4及V01、V3均能抑制VEGFR2，其中，化合物V01、V3效果較KDR4更好。試驗(yàn)例3本發(fā)明化合物對(duì)脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用小鼠為c57/BL，采用激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管(ChoroidalNeovascularization，CNV)動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此模型目前也是應(yīng)用最廣的一種被用來(lái)研究藥物對(duì)CNV形成影響的動(dòng)物模型。采用532激光在C57/bl6小鼠(每個(gè)視網(wǎng)膜4個(gè)激光點(diǎn))行激光視網(wǎng)膜光凝來(lái)誘導(dǎo)的CNV形成。激光實(shí)施后立即進(jìn)行注射：一只小鼠右眼注射濃度150uM的KDR4，另一只小鼠右眼注射濃度1uM的V01，兩小鼠左眼注射均注射與藥物相同體積的PBS作為對(duì)照。注射后5天將動(dòng)物處死并獲取眼球。去除眼前節(jié)、玻璃體和視網(wǎng)膜后，制作脈絡(luò)膜鋪片并行Isolectin染色。采用Zeiss熒光顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行拍照和CNV面積的測(cè)量。結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。根據(jù)圖6可知，化合物KDR4(150uM)、V01(1uM)均能顯著抑制脈絡(luò)膜新生血管形成，可有效治療或緩解濕性黃斑變性。試驗(yàn)例4本發(fā)明化合物對(duì)激酶的影響蛋白激酶(proteinkinases)又稱(chēng)蛋白質(zhì)磷酸化酶(proteinphosphakinase)。一類(lèi)催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶。它能把腺苷三磷酸(ATP)上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基上某些絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上，從而改變蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性。蛋白質(zhì)的磷酸化是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)大部分重要的生命活過(guò)程都離不開(kāi)蛋白質(zhì)磷酸化。蛋白激酶分為5類(lèi)：蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶、蛋白組氨酸激酶、蛋白色氨酸激酶和蛋白天冬氨酰基/谷氨?；っ?。蛋白激酶在細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)和維持起到了重要作用，在許多疾病狀態(tài)中都觀(guān)察到了激酶活性異常，所述疾病狀態(tài)包括：惡性腫瘤，免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、關(guān)節(jié)炎和其它免疫紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)如老年性癡呆癥，阿默海茨癥AD等，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與超過(guò)400種人類(lèi)疾病與蛋白激酶相關(guān)。其中，VEGFR(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體)家族成員為受體酪氨酸激酶，如VEGFR1、VEGFR2等，該類(lèi)受體在惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中以及血管增生性疾病(如黃斑變性、腫瘤)等疾病的發(fā)展過(guò)程中有重要影響。PDGFR(血小板衍生生長(zhǎng)因子受體)家族成員為受體酪氨酸激酶，如PDGFRα和PDGFRβ以及集落刺激因子1受體、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體KIT等，目前也發(fā)現(xiàn)該類(lèi)激酶與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。如PDGFR的異常表達(dá)已在黑色素瘤、腦膜瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌中有發(fā)現(xiàn)，KIT的異?；罨瘎t是許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展的直接誘因。1)抑制劑量效應(yīng)研究化合物V01溶解于100％DMSO中，稀釋為3組系列濃度，DMSO在最后測(cè)試中均保持1％。測(cè)試最高濃度為50uM。用非選擇性蛋白激酶的活性抑制劑星形孢菌素(Staurosporine)作為參照，最高濃度為1uM。結(jié)果見(jiàn)表3、圖22。表2目標(biāo)供應(yīng)商[酶]，nM[ATP]，μM孵育時(shí)間，hrKDRInvitrogen0.25803表3對(duì)KDR的抑制活性化合物IC50(μM)95％置信率HillStaurosporine0.009420.001211.002392V010.02070.002871.0079532)抑制特異性研究對(duì)化合物VO1，測(cè)試了22種激酶活性抑制試驗(yàn)，測(cè)試濃度為5mM，重復(fù)兩次，在A(yíng)TPKm測(cè)試。V01首先溶于100％DMSO中，溶解濃度為最終測(cè)試濃度的100倍，所有最終測(cè)試時(shí)的DMSO都為1％。非選擇性蛋白激酶的活性抑制劑星形孢菌素(Staurosporine)作為對(duì)照，測(cè)試時(shí)用最大濃度10mM.具體試驗(yàn)方法及試劑如下表所示：表4激酶測(cè)試平臺(tái)供應(yīng)商激酶濃度(nM)ATP濃度(μM)反應(yīng)時(shí)間(hr)AKT2CaliperMSAINVITROGEN21303AURORA-BCaliperMSACARNA0.05103BRAFCaliperMSAUPSTATE1.44353CDK2CaliperMSAUPSTATE0.2503CHEK1CaliperMSACARNA0.5503DMPKCaliperMSAINVITROGEN0.51010EGFRCaliperMSABPS0.533FGFR2CaliperMSACARNA0.06753GSK-3-βCaliperMSAUPSTATE0.5103JAK2CaliperMSAINVITROGEN0.8123KDR(即VEGFR2)CaliperMSAINVITROGEN0.25803KITCaliperMSAINVITROGEN24006MAPK3CaliperMSAINVITROGEN1.2503MEK1CaliperMSAUPSTATE3.1353METCaliperMSAINVITROGEN1.5453P38-αCaliperMSAAMPHORA2.51303PDGFR-βCaliperMSAUPSTATE0.2303PI3KAADP-GloINVITROGEN1.25503PKC-αCaliperMSAINVITROGEN0.03203ROCK1CaliperMSACARNA353SRCCaliperMSAINVITROGEN1253SYKCaliperMSABPS1.5303V01對(duì)激酶兩次試驗(yàn)平均抑制率如下表：表5從試驗(yàn)結(jié)果可知，V01對(duì)蛋白激酶KDR的抑制率高達(dá)100％，對(duì)其他兩種與腫瘤相關(guān)的蛋白激酶也有一定抑制作用，其中，PDGFR-β抑制率為52.7％，KIT抑制率為68％，但V01對(duì)其余蛋白激酶抑制活性絕大部分小于5％。由此可見(jiàn)，和現(xiàn)有研發(fā)的小分子激酶抑制劑相比，本發(fā)明化合物對(duì)KDR具有高特異性和高效率的抑制作用，且對(duì)PDGFR-β和KIT這兩種與腫瘤有密切關(guān)聯(lián)的蛋白激酶也有一定的抑制作用，這就表明化合物V01對(duì)KDR、PDGFR-β和KIT這三種蛋白激酶異?；罨嚓P(guān)的各種腫瘤及老年濕性黃斑變性等疾病均有潛在治療活性。3)新生血管抑制的研究共測(cè)試了5只鼠.在眼角膜中央，用75％硝酸銀溶液和25％硝酸鉀棒誘導(dǎo)化學(xué)燒傷造模?；瘜W(xué)燒傷之后立即在右眼結(jié)膜下注射0.2ml化合物V01，然后每天滴0.2ml化合物V012次。7天后眼角膜拍照比較。由圖23所示，化合物V01能顯著減少了新生血管和出血。綜上所述，本發(fā)明化合物具有良好的抗血管新生作用，初步認(rèn)為該類(lèi)化合物是通過(guò)抑制VEGFR2(即KDR)產(chǎn)生活性的。該類(lèi)化合物可用于對(duì)新生血管、VEGFR2、PDGFR-β、KIT等蛋白激酶異常所致疾病的治療，如濕性黃斑變性、惡性腫瘤等。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3