本發(fā)明涉及一種淡紫擬青霉及其規(guī)模化制備方法，屬于擬青霉的制備
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)屬半知菌亞門(Deuteromyeotina)、絲孢綱(HypHomyeetes)、絲孢目(HypHomycetales)、叢梗孢科(Monilaeeae)、擬青霉屬(Paecilomyces)，是一種高效、廣譜的生防真菌，對多種線蟲，如根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、金色線蟲、異皮線蟲等，具有良好的防治效果。此外，淡紫擬青霉還具有可適應(yīng)不同氣候條件、對線蟲卵具有較高的寄生率、可以有效控制土壤線蟲數(shù)量、不污染環(huán)境、生產(chǎn)原料來源豐富、對人畜無害、靶標(biāo)生物不容易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是生產(chǎn)高標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品的首選藥劑。但是，目前生產(chǎn)淡紫擬青霉菌劑的主要培養(yǎng)材料(麩皮、玉米粉、豆粕、米糠等)的成本較高，進(jìn)而導(dǎo)致淡紫擬青霉產(chǎn)品的售價較高，加上生產(chǎn)過程中產(chǎn)孢量低、孢子活性損傷大等因素，限制了淡紫擬青霉產(chǎn)品的推廣及應(yīng)用。因此，如何實現(xiàn)低成本、高效益的規(guī)?；瘍?yōu)質(zhì)生產(chǎn)是淡紫擬青霉菌株應(yīng)用亟待解決的問題。玉米是我國主要農(nóng)作物之一，玉米秸稈除少部分用作飼料外，大部分被焚燒掉，不僅造成環(huán)境污染，而且易產(chǎn)生火災(zāi)等隱患。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種淡紫擬青霉，其對多種線蟲的防治效果好，用于生產(chǎn)高標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品；同時本發(fā)明提供了一種簡單易行的規(guī)?；苽浞椒?，效率高，成本低。本發(fā)明所述的淡紫擬青霉，該菌株為擬青霉(Paecilomyces)屬中的淡紫擬青霉菌株INTR-2，該淡紫擬青霉菌株已于2016年1月18日，保藏至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，分類命名為淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)，保藏編號為CGMCCNo.12080。淡紫擬青霉菌株是從山東省淄博市沂源縣大張莊鎮(zhèn)被禾谷孢囊線蟲(Heteroderaavenae)侵染的小麥根部土壤中采用Czapek’s培養(yǎng)基涂布分離所得的高產(chǎn)孢菌株。用所述的淡紫擬青霉防治禾谷孢囊線蟲病、金色線蟲病或異皮線蟲病等病害。所述的淡紫擬青霉的規(guī)?；苽浞椒ǎ遣捎靡汗屉p相發(fā)酵工藝，經(jīng)液體培養(yǎng)基種子發(fā)酵及以玉米秸稈為主要原料的固體培養(yǎng)基分盤發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵過程采用中央空調(diào)、溫控系統(tǒng)和高壓微霧加濕器進(jìn)行控溫控濕，發(fā)酵產(chǎn)物采用低溫烘干后磨料制粉。所述液體培養(yǎng)基由以下重量百分含量的原料制成：玉米粉0.01％-1％，玉米漿0.01％-2％，脲0.01％-1％，葡萄糖0.01％-3％，硫酸銨0.01％-2％，磷酸氫二銨0.01％-2％，酵母粉0.01％-3％。所述固體培養(yǎng)基由以下重量百分含量的原料制成：玉米秸稈10％-40％，米糠5％-30％，玉米粉30％-85％，硫酸銨0.01％-2％；固體培養(yǎng)基的含水量為30％-70％。所述的液固雙相發(fā)酵工藝，是先將淡紫擬青霉株接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，再采用自動化接種工藝將液體種子接種到以玉米秸稈為主要原料的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，自動化接種工藝中的接種量為1％-15％。所述分盤發(fā)酵是指當(dāng)?shù)蠑M青霉進(jìn)入快速生長期、溫度上升到30℃以上時，將半成品曲料轉(zhuǎn)移到不銹鋼篩盤中繼續(xù)發(fā)酵。所述固態(tài)發(fā)酵過程中，溫度控制在20-30℃，濕度控制在80％-99％。所述低溫烘干時，溫度控制在25-50℃。所述生產(chǎn)過程中所有與滅過菌的物料直接或間接接觸的設(shè)備均是采用純不銹鋼材料或其他不生銹、耐腐蝕、抗老化、易清洗的材料制成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)固體培養(yǎng)基所用的玉米秸稈來源廣泛、價格低廉，大大降低了生產(chǎn)成本。此外，將玉米秸稈變廢為寶、環(huán)境友好，極具應(yīng)用前景和推廣價值；(2)所有與滅過菌的物料直接或間接接觸的設(shè)備都是采用純不銹鋼制作，便于清洗消毒，且耐腐蝕、抗老化，解決了清洗和滅菌的死角問題，經(jīng)過多次實踐檢驗，實現(xiàn)設(shè)備檢測零雜菌的突破；(3)采用蒸球蒸料、接種機(jī)自動化接種工藝，在不增加耗能的情況下，勞動效率提高了5倍，每天運行的班次由傳統(tǒng)的1個增加至2個，產(chǎn)量翻了10翻，生產(chǎn)效率大幅度提高；(4)采用液體接種，均勻度大為改觀，不再出現(xiàn)局部生長過快或者過慢現(xiàn)象，且增加了物料的濕度，又避免了物料發(fā)粘狀況；此外，液體接種后可直接分盤發(fā)酵，省去堆積培養(yǎng)環(huán)節(jié)，節(jié)省勞動力，增加生產(chǎn)穩(wěn)定性；(5)采用分盤發(fā)酵的方式，將快速生長期的半成品曲料轉(zhuǎn)移到不銹鋼篩盤中繼續(xù)發(fā)酵，增加了物料的表面積，排除二氧化碳等廢氣，使曲料重新充分與氧氣接觸，又便于噴水降溫、加濕，更好的控制淡紫擬青霉的產(chǎn)酶發(fā)孢條件，因為當(dāng)?shù)蠑M青霉到達(dá)菌絲生長對數(shù)期，耗氧量達(dá)到峰值，同時產(chǎn)生大量的熱與二氧化碳等廢氣，通風(fēng)量的增加帶走了曲料的部分水分，溫度的急劇升高(30℃以上)、廢氣的大量產(chǎn)生、水分的丟失嚴(yán)重惡化了淡紫擬青霉的生長繁殖條件，導(dǎo)致傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品的各種酶活力低；(6)生產(chǎn)過程中，采用中央空調(diào)、溫控系統(tǒng)、高壓微霧加濕器進(jìn)行嚴(yán)格控溫控濕，中央空調(diào)的三級空氣過濾裝置，使進(jìn)風(fēng)完全無菌，其中散熱器、表冷器的使用，可實現(xiàn)冷暖風(fēng)的自由輸送，實現(xiàn)了溫度的自動精準(zhǔn)控制；高壓微霧加濕器具有耗電少、成本低、霧化效果佳的優(yōu)點，其產(chǎn)生的水粒子直徑僅為1-5μm，在空氣中水粒子分布均勻，不產(chǎn)生凝水，運行穩(wěn)定性好、加濕效率高(最高達(dá)到99％)等特點，能精準(zhǔn)控濕且易于自動化管理；因此，中央空調(diào)、溫控系統(tǒng)及高壓微霧加濕器的應(yīng)用解決了傳統(tǒng)工藝梅雨季節(jié)濕度大、溫度高、物料發(fā)粘、燒曲壞曲，寒冬季節(jié)干燥(北方)、溫控效果差、易干曲等難題，實現(xiàn)了固體發(fā)酵過程條件的精準(zhǔn)控制；(7)建立了一條全新的低溫烘干工藝，提高了烘干效率及孢子活性，烘干車間室內(nèi)地面安裝蒸汽盤管來提高室溫；車間密封，阻隔外界潮氣進(jìn)入；進(jìn)風(fēng)經(jīng)過三級空氣過濾后，再經(jīng)過除濕器除濕后方能進(jìn)入烘干車間，完全阻隔外界雜質(zhì)雜菌以及潮氣進(jìn)入；室內(nèi)每100m3設(shè)750w風(fēng)扇一臺，增加了室內(nèi)空氣流動性；排風(fēng)扇兩臺，及時將濕氣、舊風(fēng)排出；采用新的烘干工藝后，烘干時間由以前的48-72小時，縮短到現(xiàn)在的24-36小時，在提高了烘干效率的同時，也保證了產(chǎn)品質(zhì)量，成品水分由以前的10％-12％降為6％-8％，同時也避免了出現(xiàn)陰雨天氣久烘不干的壞曲現(xiàn)象；(8)采用本發(fā)明所述的規(guī)模化制備方法生產(chǎn)淡紫擬青霉，產(chǎn)孢量高達(dá)71770億個/g(干重)，且制備的產(chǎn)品活性高、保存周期長，室溫貯藏11個月后孢子萌發(fā)率仍能達(dá)到90％左右。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不限制本發(fā)明的實施。實施例1淡紫擬青霉菌株的分離與篩選：1.Czapek’s培養(yǎng)基(w/v)：蔗糖3％，NaNO30.3％，K2HPO40.1％，MgSO40.05％，KCl0.05％，F(xiàn)eSO40.001％，瓊脂2％，pH6.0～6.5。2.土壤采樣：采集被禾谷孢囊線蟲侵染的小麥根部土壤樣品。3.分離：將1g土壤樣品加入裝有100mL無菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中充分搖振，靜置后取上清用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個稀釋濃度吸取100μL均勻涂布到Czapek’s培養(yǎng)基平板上，26℃靜置培養(yǎng)4-5d，將菌落形態(tài)、顏色及菌絲鏡檢形態(tài)等特征與淡紫擬青霉相符且生長速度較快的單菌落轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至大量產(chǎn)孢。4.初篩：用無菌生理鹽水將平皿中的孢子洗脫下來并進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個稀釋濃度吸取100μL均勻涂布到Czapek’s培養(yǎng)基平板上，26℃靜置培養(yǎng)4-5d，將菌落形態(tài)、顏色及菌絲鏡檢形態(tài)等特征與淡紫擬青霉相符且生長速度較快的單菌落轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至大量產(chǎn)孢。5.重復(fù)步驟4(初篩)6次。6.復(fù)篩：挑選長勢最好的10個菌株進(jìn)行500mL搖瓶發(fā)酵，每個菌株做5個重復(fù)搖瓶，比較10個菌株的生長速度、產(chǎn)孢速度、最大生物量及最大產(chǎn)孢量，最終選擇產(chǎn)孢速度最快、產(chǎn)孢量最大的1株菌株進(jìn)行后續(xù)研究。實施例2淡紫擬青霉的分子生物學(xué)菌種鑒定：1.DNA提?。河肂iospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA。2.ITS序列擴(kuò)增：用真菌ITS序列通用引物對篩選菌株進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液5.0μL，dNTPs(2.5mM)4.0μL，引物ITS1和ITS4各2.0μL，ExTaq酶(5U/μL)2.0μL，DNA模板2.0μL，ddH2O34μL；PCR運行程序：94℃預(yù)變性5min，95℃變性60s、55℃退火60s、72℃延伸90s，34個循環(huán)，最后72℃終延伸10min。3.PCR產(chǎn)物純化：將PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，切下電泳膠上大小為700bp左右的主要PCR產(chǎn)物，并使用捷瑞生物工程(上海)有限公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。4.測序：將純化后的PCR產(chǎn)物送樣至上海生工進(jìn)行測序，所得分離菌株的ITS序列為：5’-CAGACGGAGTCTTTACGAGTTATACAACTCCCAAACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGACCGCCCCGGCCGCCGCGCAAGCGGCGCCGGACTCCAAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCAAAACTCTTTTGCATTACGCCCAACGGCGGGAATTTTTTCTCTGAGTGCATAAGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCTCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGACGGTCACGCCGTAAAACGCCCAACTTCTTAGAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAGACGCGAAGGGAAAAGG-3’5.比對：將上述ITS序列在NCBI上進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該序列與淡紫擬青霉(Purpureocilliumlilacinum)菌株INTR-2的ITS序列同源性為99％，Evalue值為0。因此，可確定該分離菌株即為淡紫擬青霉菌。6.保藏：我們隨后將該菌株送到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行保藏，保藏編號為CGMCCNo.12080。實施例3淡紫擬青霉的規(guī)?；a(chǎn)：1.菌種：所用淡紫擬青霉保藏編號為CGMCCNo.12080。2.斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。3.液體培養(yǎng)基：葡萄糖2％，酵母粉0.5％，硫酸銨0.5％，磷酸氫二銨0.5％，玉米漿0.3％，玉米粉0.2％，脲0.1％。4.固體培養(yǎng)基：玉米秸稈24％，米糠16％，玉米粉60％，0.1％的(NH4)2SO4水溶液將含水量調(diào)至50％左右。5.將26℃培養(yǎng)9d的淡紫擬青霉斜面接種到裝有400mL液體培養(yǎng)基的1L搖瓶中，26℃、150r/min培養(yǎng)7d。6.將5個1L搖瓶中的種子液接種到裝有60L液體培養(yǎng)基的100L種子發(fā)酵罐中，26℃、150r/min培養(yǎng)6d。7.將干固體培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。滅菌條件為：121℃，1h。滅菌完成后，打開中央空調(diào)進(jìn)風(fēng)(無菌風(fēng))，保持蒸料車間內(nèi)正壓力無菌風(fēng)的供應(yīng)，然后開蓋放料。滅菌物料經(jīng)破碎機(jī)，將結(jié)塊或發(fā)粘的料塊打散，再經(jīng)涼料機(jī)冷卻降溫。注：針對傳統(tǒng)設(shè)備設(shè)施滅菌不徹底，且易生銹、易與消毒液產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)等問題，現(xiàn)用的料斗、絞龍、破碎機(jī)、涼料機(jī)等蒸料機(jī)組所有與滅過菌的物料直接或間接接觸的設(shè)備都是采用純不銹鋼制作，便于清洗消毒、耐腐蝕、抗老化，解決了清洗和滅菌的死角問題。8.當(dāng)物料溫度降至28-30℃時，采用蒸球蒸料，接種機(jī)自動接種的方式，將種子發(fā)酵罐中的種子液接種到固體培養(yǎng)基中，攪拌均與后將初始含水量調(diào)至50％左右。9.通過中央空調(diào)、溫控系統(tǒng)、高壓微霧加濕器將環(huán)境溫度控制在26±1℃，濕度控制在90％-95％，培養(yǎng)5d后，將半成品曲料轉(zhuǎn)移到不銹鋼篩盤中繼續(xù)培養(yǎng)5d，溫度和濕度不變。10.發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行低溫烘干，室溫控制為春、秋、冬季30-32℃，夏季32-35℃，烘至含水量在10％以下。11.磨料制粉。12.淡紫擬青霉產(chǎn)孢量為71770億個/g(干重)，淡紫擬青霉發(fā)酵產(chǎn)物孢子萌發(fā)率隨室溫貯藏時間的變化情況見表1。表1淡紫擬青霉發(fā)酵產(chǎn)物孢子萌發(fā)率隨室溫貯藏時間的變化貯藏時間2個月5個月8個月11個月孢子萌發(fā)率(％)98.7％97.7％94.5％90.3％可見，該淡紫擬青霉規(guī)?；a(chǎn)工藝孢子產(chǎn)量高，發(fā)酵產(chǎn)品孢子損傷小，孢子活性維持時間長，利于工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用。實施例4淡紫擬青霉規(guī)模化生產(chǎn)產(chǎn)品防治禾谷孢囊線蟲病的田間試驗：1.菌種：所用淡紫擬青霉保藏編號為CGMCCNo.12080。2.實驗地：山東省淄博市小麥發(fā)病嚴(yán)重的地塊，將試驗地合理分為9個小區(qū)，每個小區(qū)20m2。試驗的小麥品種為山農(nóng)31號，按照常規(guī)方法播種。3.處理：試驗共有3組。即，對照組：噴灑清水10kg/ha；淡紫擬青霉組：噴灑淡紫擬青霉規(guī)模化生產(chǎn)菌劑100kg/ha；神農(nóng)丹組：噴灑5％神農(nóng)丹(涕滅威)10kg/ha(ha為面積單位：公頃)。每個試驗組做3個小區(qū)重復(fù)。4.蟲口調(diào)查方法：每個小區(qū)進(jìn)行隨機(jī)10個點取樣，每點取10株，染色調(diào)查根內(nèi)幼蟲數(shù)，染色方法詳見劉維志(1998)，根據(jù)幼蟲數(shù)計算相對防效。5.相對防效計算公式：相對防效(％)＝(對照組幼蟲數(shù)一處理組幼蟲數(shù))/對照組幼蟲數(shù)6.田間試驗結(jié)果：表2淡紫擬青霉規(guī)?；a(chǎn)產(chǎn)品對禾谷孢囊線蟲病的田間防效處理幼蟲數(shù)(10株)相對防效(％)淡紫擬青霉127.1863.19神農(nóng)丹187.6645.68對照345.46/由表2中的田間防效結(jié)果可知，用本發(fā)明提供的淡紫擬青霉菌株及以以玉米秸稈為原料的規(guī)?；a(chǎn)工藝生產(chǎn)的淡紫擬青霉產(chǎn)品對禾谷孢囊線蟲病具有良好的田間防治效果，其田間防效甚至顯著高于常用化學(xué)農(nóng)藥神農(nóng)丹。5’-CAGACGGAGTCTTTACGAGTTATACAACTCCCAAACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGACCGCCCCGGCCGCCGCGCAAGCGGCGCCGGACTCCAAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCAAAACTCTTTTGCATTACGCCCAACGGCGGGAATTTTTTCTCTGAGTGCATAAGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCTCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGACGGTCACGCCGTAAAACGCCCAACTTCTTAGAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAGACGCGAAGGGAAAAGG-3’當(dāng)前第1頁1 2 3