技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于分離環(huán)六肽的方法，并且涉及所得到的二乙酸卡泊芬凈(caspofungindiacetate)的新晶形。
背景技術(shù)：
：環(huán)肽是其中的端胺基與端羧基形成內(nèi)部肽鍵的多肽。幾種環(huán)肽因其有益的藥用特性而聞名。一個(gè)范例是作為有效抗真菌劑的棘白菌素(echinocandin)類。環(huán)肽可以是天然存在的化合物，但也可以通過全合成或通過天然存在或天然生產(chǎn)的前驅(qū)體的合成或基因改性而得到；后一類稱為半合成的環(huán)肽。藥用棘白菌素的例子是環(huán)六肽阿尼芬凈(anidulafungin)、卡泊芬凈(caspofungin)、西洛芬凈(cilofungin)和米卡芬凈(micafungin)，它們可用于治療真菌感染，特別是由曲霉菌(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、假絲酵母(Candida)、球孢子菌(Coccidioides)和組織胞漿菌(Histoplasma)引起的真菌感染。阿尼芬凈(1-[(4R，5R)-4，5-二羥基-N2-[[4”-(戊氧基)[1，1’：4’，1”-四苯基]-4-基]羰基]-L-鳥氨酸]棘白菌素B；(1a)其中R1＝-OH，R2＝-C(O)-pC6H4-pC6H4-pC6H4-O(CH2)4CH3，R3＝-H，R4＝-CH3，R5＝-CH3)，卡泊芬凈(1-[(4R，5S)-5-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-(10，12-二甲基-1-肉豆蔻酰基)-4-羥基-L-鳥氨酸]-5-[(3R)-3-羥基-L-鳥氨酸]-紐莫康定B0；(1b)其中R1＝-NH(CH2)2NH2，R2＝-C(O)(CH2)8CH(CH3)CH2CH(CH3)CH2CH3，R3＝-H，R4＝-(CH2)2NH2，R5＝-H)和米卡芬凈(1-[(4R，5R)-4，5-二羥基-N2-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-異噁唑基]苯甲酰基]-L-鳥氨酸]-4-[(4S)-4-羥基-4-[4-羥基-3-(硫代氧基)苯基]-L-蘇氨酸]紐莫康定A0；(1c)其中R1＝-OH，R2＝-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-異噁唑基]苯甲?；鵠-L-鳥氨酸]，R3＝-OSO3H，R4＝-CH2C(O)NH2，R5＝-CH3)都是衍生自天然存在的棘白菌素(例如棘白菌素B、紐莫康定A0或紐莫康定B0)的半合成環(huán)六肽。盡管大自然可以提供半合成環(huán)肽的復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)性部分，但是在許多所有手性中心都要具有所需構(gòu)型的情形中，主要的缺點(diǎn)為在發(fā)酵期間通常形成貫穿該方法的副產(chǎn)物，最終成為雜質(zhì)。僅在很少數(shù)的例子中，可以按一定方式調(diào)控發(fā)酵過程以避免雜質(zhì)的形成。特別是當(dāng)這些雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)與主要產(chǎn)物密切相關(guān)時(shí)，它們的除去通常很冗長(zhǎng)并且通常需要沒有先例的方法，因?yàn)樗P(guān)注的主要產(chǎn)物是化學(xué)不穩(wěn)定的和/或易于外消旋。例如，由發(fā)酵得到的紐莫康定B0(1，其中R1＝-OH，R2＝-C(O)(CH2)8CH(CH3)CH2CH(CH3)CH2CH3，R3＝-H，R4＝-CH2C(O)NH2且R5＝-H)來制備卡泊芬凈是其中雜質(zhì)的除去成為重要問題的方法。已描述了在紐莫康定B0的發(fā)酵中出現(xiàn)的多種結(jié)構(gòu)相關(guān)的雜質(zhì)。實(shí)例為：具有額外的甲基官能團(tuán)的化合物(例如紐莫康定A0、紐莫康定A1、紐莫康定A2、紐莫康定A3、紐莫康定A4、紐莫康定A5、紐莫康定A6)，缺少一個(gè)或兩個(gè)羥基的化合物(例如紐莫康定B1、紐莫康定B2、紐莫康定B5、紐莫康定B6、紐莫康定E0)，具有4-羥基脯氨酸而不是3-羥基脯氨酸片段的化合物(紐莫康定C0)，具有額外的羥基的化合物(例如紐莫康定D0、紐莫康定D2)或近來所述的雜質(zhì)A(US2009/0324635)，其中在卡泊芬凈結(jié)構(gòu)中，羥基-L-鳥氨酸片段中的一個(gè)被L-絲氨酸片段代替。近年來，WO2010/008493中公開了一種用于制備氮雜環(huán)六肽鹽的方法，其包括：噴霧干燥或通過加入無水有機(jī)溶劑來沉淀。盡管該方法產(chǎn)生高純度的卡泊芬凈，但沉淀也具有用于形成固體顆粒的已知方法的缺點(diǎn)(可能易于包含不希望的雜質(zhì))。鑒于嚴(yán)格的監(jiān)管和健康相關(guān)的要求，但仍然需要不斷改進(jìn)的提純和分離方法。發(fā)明詳述第一方面，本發(fā)明公開了一種用于分離環(huán)六肽的方法，其包括下列步驟：(a)使包含環(huán)六肽和水的溶液與樹脂接觸；(b)從步驟(a)所得到的混合物中除去液相；(c)通過加入有機(jī)溶劑使其與在步驟(b)中除去水相之后所保留的材料接觸，來洗提所述環(huán)六肽；(d)從步驟(c)所得到的混合物中分離出樹脂；(e)使所述環(huán)六肽從除去所述樹脂之后所保留的溶液中結(jié)晶；(f)從步驟(e)所得到的混合物中分離所述環(huán)六肽。分離之后，步驟(f)后所得到的環(huán)六肽可以被干燥，從而得到水含量降低的產(chǎn)物。額外的干燥過程的優(yōu)點(diǎn)為：所得到的產(chǎn)物更易于處理，不易形成不想要的雜質(zhì)，并且因而純度更高。所述干燥可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的過程來進(jìn)行，例如加熱、施加降低的壓力、使氣體流經(jīng)過分離產(chǎn)物的上方或其組合。加熱可以是溫度范圍從15℃到80℃，或從20℃到60℃，或從30℃到40℃。合適的氣體是空氣或惰性氣體(例如氮?dú)?或稀有氣體(例如氬氣、氦氣、氖氣或氙氣)。特別地，所述環(huán)六肽是通式(1)的化合物。R1可以是-OR6或-NH(CH2)2NHR7，其中R6為-H或酰基、烷基、芳基、硫烷基或硫芳基(例如4-甲氧基苯硫基和苯硫基)并且R7為-H或?；⑼榛蚍蓟?。R2可以為-H或C(O)R8，其中R8為-H或包含10-25個(gè)碳原子的基團(tuán)，例如-pC6H4-pC6H4-pC6H4-O(CH2)4CH3、-(CH2)8CH(CH3)CH2CH(CH3)CH2CH3或-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-異噁唑基]苯甲?；鵠-L-鳥氨酸]。R3可以是-OH或-H。R4可以是-CH3或-(CH2)2NHR7或-CH2C(O)NHR7，其中R7如上所述。R5可以為-CH3或-H。優(yōu)選地，所述環(huán)六肽是阿尼芬凈(1a；R1＝-OH，R2＝-C(O)-pC6H4-pC6H4-pC6H4-O(CH2)4CH3，R3＝-H，R4＝-CH3，R5＝-CH3)，卡泊芬凈(1b；R1＝-NH(CH2)2NH2，R2＝-C(O)(CH2)8CH(CH3)CH2CH(CH3)CH2CH3，R3＝-H，R4＝-(CH2)2NH2，R5＝-H)，米卡芬凈(1c；R1＝-OH，R2＝-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-異噁唑基]苯甲?；鵠-L-鳥氨酸]，R3＝-OSO3H，R4＝-CH2C(O)NH2，R5＝-CH3)等。上述環(huán)六肽可以通過下列本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備，例如全化學(xué)合成或半合成，即，發(fā)酵，隨后進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)化學(xué)轉(zhuǎn)化。一個(gè)實(shí)例可以是如US5,552,521或US5,936,062中所述的使紐莫康定B0通過苯硫基紐莫康定B0胺轉(zhuǎn)化為卡泊芬凈。樹脂可以是任何色譜材料，例如疏水相互作用的色譜材料、反相色譜材料、離子交換色譜材料或這些材料中兩種或更多種的混合物。適用于本發(fā)明目的的樹脂的實(shí)例為AmberchromXT30、AmberchromCG300S、AmberchromCG300sd、AmberchromCG300XT、AmberchromCG-71、AmberchromCG-161、Toyopearl’sButyl-650、Ether-650、Hexyl-650、Phenyl-650等。環(huán)六肽可以通過多種方式與樹脂接觸。這可以通過在容器中使環(huán)六肽的溶液(例如水溶液)與樹脂結(jié)合來實(shí)現(xiàn)?？梢詳嚢杷玫降幕旌衔镆愿纳莆?。隨后樹脂和/或液體的除去可以通過離心、過濾或沉淀或類似的技術(shù)來進(jìn)行?；蛘?，可以將該樹脂填充到柱子中，并可以將該環(huán)六肽的溶液引到色譜柱上。在步驟(a)中使環(huán)六肽的溶液與樹脂接觸之后，可以洗滌樹脂。該洗滌步驟將除去未被樹脂吸附的雜質(zhì)?？梢杂枚喾N溶劑來進(jìn)行洗滌，對(duì)于大多數(shù)環(huán)六肽來說，水或水和與水混溶的溶劑的混合物是優(yōu)選的。在此方面，與水混溶的溶劑指的是在其中水的溶解度至少為5％(w/w)的溶劑。實(shí)例為醇類、酮類、乙腈等。具體而言，可以使用短鏈醇，其實(shí)例為乙醇、異丙醇、正丙醇和甲醇。洗滌步驟應(yīng)該在洗提步驟(c)之前進(jìn)行，可以在步驟(b)中的液體除去之前或之后進(jìn)行。步驟(a)中使用的溶液也可以包含與水混溶的溶劑。步驟(c)中用于洗提的有機(jī)溶劑可以是與水混溶的有機(jī)溶劑。溶劑可以與水混合，例如乙醇/水的混合物，其中水的量為1-20％(w/w)或5-15％(w/w)。步驟(a)和(c)中使用的溶劑可以是相同的，但也可以是不同的。溶劑不同的好處在于，當(dāng)需要從一種溶劑轉(zhuǎn)換為另一種溶劑時(shí)，提供了高靈活性。第一溶劑可能優(yōu)選用于合成目的，而另一種(即第二溶劑)可能優(yōu)選用于結(jié)晶目的。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，在應(yīng)用該方法之前(即，在步驟(a)中)溶液中環(huán)六肽的濃度在所述方法的過程期間可能增大。因此，步驟(a)的溶液中所述環(huán)六肽的濃度可能比在步驟(d)中除去所述樹脂之后所保留的溶液中所述環(huán)六肽的濃度低2到50倍。通常，濃度的增大對(duì)于隨后的結(jié)晶步驟(e)和分離步驟(f)來說是有利的，因?yàn)槟敢褐挟a(chǎn)物的損失降低。例如，步驟(a)中所述環(huán)六肽的濃度可能為0.1-5g.l-1，而在步驟(d)中除去所述樹脂之后所保留的溶液中的所述環(huán)六肽的濃度可能為5-40g.l-1。后者濃度范圍仍相對(duì)較低，因?yàn)樯形匆姷接嘘P(guān)環(huán)六肽從溶度范圍為5-40g.l-1的溶液中結(jié)晶的報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，分離(例如結(jié)晶)可以在步驟(d)之后進(jìn)行，而沒有中間濃縮步驟(中間濃縮步驟是現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法)。很明顯，本發(fā)明的方法避免了額外的工藝步驟，從而使得產(chǎn)量損失降低、雜質(zhì)減少。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，在本發(fā)明方法期間，可以用另一種液體代替或部分代替其中溶解了環(huán)六肽的液體。這對(duì)于控制最終結(jié)晶產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度來說可能很有利。例如，步驟(a)的溶液中的水的量可以為75％-95％，而在步驟(d)中除去所述樹脂之后所保留的溶液中的水的量可能小于10％，例如5％，或甚至小于0.5％。因此，本發(fā)明有利地提供了一種方法，通過該方法高度稀釋的環(huán)六肽可以以良好的產(chǎn)率到高的產(chǎn)率分離。該方法簡(jiǎn)單，不需要昂貴和/或復(fù)雜的設(shè)備，并且不需要耗能的蒸發(fā)技術(shù)。此外，條件很溫和，從而防止脆弱的環(huán)六肽發(fā)生不期望的降解。在適當(dāng)?shù)那闆r下，最終的環(huán)六肽可能以衍生自酸(例如乙酸、花生四烯酸、檸檬酸、谷氨酸、氫溴酸、鹽酸、馬來酸、蘋果酸、草酸、棕櫚酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、三氟乙酸)或堿(例如氫氧化鈣、氫氧化鉀和氫氧化鈉)的藥物可接受鹽的形式。例如，可用于卡泊芬凈(1b)的鹽是二乙酸鹽，可用于米卡芬凈(1c)的鹽是鈉鹽。第二方面，提供了二乙酸卡泊芬凈的晶形，其通過選自由下列組成的組中的數(shù)據(jù)來表征：(a)XRD粉末衍射圖，具有在2.92±0.2度、5.06±0.2度和5.88±0.2度的2θ角處的峰；(b)如圖1所描繪的XRD粉末衍射圖；(c)(a)和(b)的組合。值得注意的是，本發(fā)明的二乙酸卡泊芬凈的晶形具有從第一方面的結(jié)晶方法中所得到的新穎形態(tài)。與WO2010/008493中公開的沉淀產(chǎn)物相比，明顯的是，本發(fā)明的二乙酸卡泊芬凈的晶形在2θ角為9.0±0.2度的區(qū)域沒有顯露出明顯的峰。最強(qiáng)峰(2θ角為2.92±0.2度處)的強(qiáng)度與2θ角為9.0±0.2度的區(qū)域中任何峰的強(qiáng)度之比為至少10。在圖1所示的樣品中，所述比值為18。本發(fā)明的結(jié)晶的二乙酸卡泊芬凈的水含量可以為0.1％-10％(w/w)。本發(fā)明的環(huán)六肽中水含量的范圍的實(shí)例為0.1％-6％(w/w)，1％to8％(w/w)，2-6％(w/w)，或3.5％-5.5％(w/w)。通過HPLC測(cè)定，本發(fā)明的結(jié)晶的二乙酸卡泊芬凈的純度為至少99.0％。圖1所示的樣品的純度為99.58％。經(jīng)HPLC測(cè)定，雜質(zhì)低于0.25％。通常，如圖1所示的樣品中所示，雜質(zhì)為0.02％、0.04％、0.15％和0.19％。附圖說明圖1是化合物(1b)的XRD譜圖。X-軸：2-θ值(度)。Y-軸：強(qiáng)度(cps).可以識(shí)別出3個(gè)明顯的峰。峰的編號(hào)2-θ(deg)Flex寬度d-值強(qiáng)度I/Io12.9200.30630.231920,89810025.0600.32917.44992,7371435.8800.35315.01812,75114實(shí)施例綜述X射線粉末衍射分析用來自Rigaku的UltimaIVX射線粉末衍射儀來分析樣品。HPLC分析梯度：時(shí)間(min)0121522323440％A100848400100100％B0161610010000實(shí)施例1用苯硫基紐莫康定B0胺來制備粗制的二乙酸卡泊芬凈將苯硫基紐莫康定B0胺的溶液(1.6L；17.3g苯硫基紐莫康定B0胺；15mmol；44vol％水)冷卻到-10℃。攪拌下，在-10到-3℃的溫度下在20分鐘內(nèi)加入乙二胺(EDA；320mL；4.7mol)。開始時(shí)立即形成白色沉淀，其隨后溶解。反應(yīng)混合物在21-22℃下攪拌15小時(shí)。在10-20℃下加入額外的EDA(170mL；2.5mol)，并在環(huán)境溫度下繼續(xù)攪拌31小時(shí)。攪拌下，將反應(yīng)混合物和乙酸(1430mL；24.7mol)同時(shí)添加到1.5L預(yù)冷的0℃的水中，使溫度保持低于10℃，并使pH保持為5.1-5.5(淬火是放熱的)。在10℃和pH為5.3時(shí)，用庚烷(2x300mL)來萃取混合物。為了改善相分離，加入水(500mL)。合并庚烷相并用水(2x250mL)反萃取混合物。合并所有的水相，用水稀釋至9.45L，以使乙醇含量降低至小于10％。將硅膠100C18(900g)懸浮在75％的乙腈(2L)中。將混合物放入柱(高度19.6cm；內(nèi)徑10cm)中。得到1540mL的床體積。首先用3個(gè)床體積的100％的乙腈來洗滌柱，然后在約1bar的壓力下，用流速為80mL.min-1的3個(gè)柱床體積的0.15％的乙酸水溶液來平衡。按上述方法制備的卡泊芬凈溶液(9.45L)原樣用于加載在柱上。流速約為50mL.min-1。調(diào)整流速使壓力保持低于5bar。線性流速約為0.6cm.min-1。加載容量為每L樹脂10g二乙酸卡泊芬凈(12g總卡泊芬凈/L)。接著，用流速為70mL.min-1的0.15％的乙酸水溶液(3.2L)洗滌柱，之后用不同的溶劑組合物以相同的流速來洗提柱：-10％乙腈/0.15％乙酸(15L；9.7個(gè)床體積)-13％乙腈/0.15％乙酸(6375mL；4.1個(gè)床體積)-20％乙腈/0.15％乙酸(7125mL；4.6個(gè)床體積)通過用75％乙腈/0.15％乙酸(5625；3.7個(gè)柱床體積)洗滌使柱再生。用UV(280nm和254nm)連續(xù)監(jiān)測(cè)洗出液，級(jí)分37-69被合并，得到產(chǎn)率為94.7％且二乙酸卡泊芬凈的濃度為1.2g/l1.2g.L-1(基于產(chǎn)率和柱步驟之前的輸入量)的12.4L的卡泊芬凈溶液。所有級(jí)分中卡泊芬凈的質(zhì)量平衡為99.1％。實(shí)施例2二乙酸卡泊芬凈的疏水相互作用的色譜和結(jié)晶用AmberchromXT30樹脂填充直徑為10cm的柱，得到628mL的床體積和8cm的床層高度。用0.15％的乙酸使柱平衡。依次進(jìn)行兩次加載、洗滌和洗提。用UV(280nm和254nm)連續(xù)監(jiān)測(cè)洗出液。用0.15％的乙酸將實(shí)施例1中所制備的卡泊芬凈溶液(12.4L)稀釋至30L(＝進(jìn)料)。加載1：卡泊芬凈進(jìn)料(21L)以80mL.min-1的流速向上流動(dòng)加載在柱(16.7g卡泊芬凈/L樹脂)上。線性流速為1.0cm.min-1。壓力不超過2.5bar。洗滌1：使0.15％的乙酸(1660mL)向下流動(dòng)來洗滌柱。洗提1：使乙醇/0.15％乙酸(1000mL)向下流動(dòng)來洗提柱。從UV信號(hào)開始增加的點(diǎn)(約1個(gè)床體積之后)開始收集200mL的級(jí)分，并通過HPLC進(jìn)行分析，并Karl-Fischer分析進(jìn)行水分析(表1)。表1柱第1輪運(yùn)行的結(jié)果用0.15％的乙酸使柱平衡。加載2：卡泊芬凈進(jìn)料(10.345L)以70mL.min-1的流速向上流動(dòng)加載在柱(8g卡泊芬凈/L樹脂)上。線性流速為0.9cm.min-1。壓力不超過2.5bar。洗滌2：使0.15％的乙酸(947mL)向上流動(dòng)來洗滌柱。洗提2：使乙醇/0.15％乙酸(735mL)向下流動(dòng)來洗提柱。從UV信號(hào)開始增加的點(diǎn)(約1個(gè)床體積之后)開始收集級(jí)分，并通過HPLC進(jìn)行分析，并Karl-Fischer分析進(jìn)行水分析(表2)。表2柱第2輪運(yùn)行的結(jié)果兩次運(yùn)行中1到5(包括)的級(jí)分被合并，得到估算濃度為9.5g.L-1(基于產(chǎn)率和兩次運(yùn)行之前的輸入量)的1525mL的卡泊芬凈溶液。兩次運(yùn)行中的總產(chǎn)率為96.2％。通過Karl-Fischer分析合并的級(jí)分的水濃度：5.5％.上面所得到的溶液(參見表3)原樣用于結(jié)晶。表3濃縮和溶劑轉(zhuǎn)換之后卡泊芬凈溶液的HPLC結(jié)果于是，卡泊芬凈溶液(1.48L；9.5g.L-1；12mmol)通過G4玻璃過濾器過濾，之后加入乙酸(5mL；87mmol)。在環(huán)境溫度下，在約30分鐘內(nèi)緩慢加入乙酸乙酯(500mL)，使得溫度降低至16℃。在約1小時(shí)內(nèi)加入另一部分乙酸乙酯(500mL)，并再次滴加100mL的乙酸乙酯，連續(xù)攪拌30分鐘。混合物稍微變得更混濁。再次滴加100mL的乙酸乙酯，并連續(xù)攪拌45分鐘。最后，加入另一部分乙酸乙酯(50mL)，在20℃下使混合物攪拌45分鐘。乙酸乙酯/乙醇(94.5％)的比例為1.2/1(v/v)?；旌衔锸腔鞚岬?，并且明顯形成晶體。為了增大產(chǎn)率，首先以0.69mL.min-1的連續(xù)流速在45分鐘內(nèi)加入30mL乙酸乙酯，然后以1.67mL.min-1的連續(xù)流速在約12小時(shí)內(nèi)加入1220mL乙酸乙酯。乙酸乙酯/乙醇(94.5％)的最終比例為5/3(v/v)。過濾出晶體并用總計(jì)250mL的乙酸乙酯/乙醇/水(250/142/8，v/v/v)的混合物洗滌三次。濕的晶體(15.1g)在20℃下在真空中干燥9小時(shí)，得到12.3g晶體。這段時(shí)間之后，明顯檢測(cè)到乙醇的氣味。因此，使氮?dú)饬鹘?jīng)過晶體餅1小時(shí)，產(chǎn)生0.6g的重量損失。之后，晶體再干燥11小時(shí)，產(chǎn)生11.7g二乙酸卡泊芬凈，為白色結(jié)晶性粉末(參見表4)，水含量為4.9％。表4結(jié)晶的二乙酸卡泊芬凈的HPLC結(jié)果通過NMR按如下測(cè)定上面所得到的晶體中卡泊芬凈、乙醇、乙酸乙酯和乙酸的含量。在適當(dāng)?shù)男∑恐芯_稱量約15mg的樣品和標(biāo)樣(DMB)。通過渦流使樣品溶于MeOD中。在300K下使用30s的延遲時(shí)間在600MHz下測(cè)量樣品。使用5s的延遲時(shí)間和256次掃描(以增強(qiáng)信噪比)來測(cè)量用于計(jì)算芳族區(qū)域中雜質(zhì)的譜圖。分析進(jìn)行兩次。使用7.15ppm處的酪氨酸信號(hào)來量化卡泊芬凈。結(jié)果請(qǐng)參見表5。表5結(jié)晶的二乙酸卡泊芬凈的NMR結(jié)果％二乙酸卡泊芬凈91.1(游離堿∶82.1)乙醇0.2乙酸8.8(2∶1乙酸∶卡泊芬凈)乙酸乙酯＜0.2當(dāng)前第1頁1 2 3