本發(fā)明屬于多肽藥物合成制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及特異性微波合成制備醋酸曲普瑞林的方法。
背景技術(shù)：
中文名：醋酸曲普瑞林，英文名：Triptorelin Acetate
結(jié)構(gòu)式：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2·HAC，分子式：C64H82N18O13，分子量：1311.46。
醋酸曲普瑞林是一種人工合成的促黃體素釋放素類似物，在天然LHRH的基礎(chǔ)上，利用D-Trp將LHRH肽鏈第六位上的Gly取代，產(chǎn)生一種生物學(xué)活性作用較強(qiáng)的合成促性腺激素釋放激素的相似物，其結(jié)構(gòu)的改良增強(qiáng)了它和垂體受體的親和性并且減緩靶組織的鈍化作用，并且相較于天然LHRH，具備了更長的體內(nèi)半衰期和更強(qiáng)的生物學(xué)穩(wěn)定性。在臨床上主要用于治療子宮肌瘤，兒童真性性早熟，女性子宮內(nèi)膜異位癥，在不孕癥的治療時可用于體外受精-胚胎移植過程。
目前，國內(nèi)外關(guān)于醋酸曲普瑞林的合成純化方法報道不多，以下是四篇關(guān)于合成純化方法的專利情況；
在專利CN201410743707.1中公開了一種曲普瑞林的純化方法：采用固相制備曲普瑞林全保護(hù)的第一肽片段序列，液相制備曲普瑞林的全保護(hù)的第二肽片段序列并脫除其氨基端保護(hù)基；液相中，脫除了氨基端保護(hù)基的全保護(hù)的第二肽片段序列與第一肽片段序列得到全保護(hù)的曲普瑞林；脫去全保護(hù)的曲普瑞林的側(cè)鏈保護(hù)基得到曲普瑞林粗肽，液相純化換鹽得到醋酸曲普瑞林，其是利用固液相結(jié)合片段縮合的方法制備曲普瑞林；
缺點(diǎn)：合成過程中需要經(jīng)過多次切割，合成周期長，工藝復(fù)雜。
在專利CN200710044419.7公開了另一種曲普瑞林的純化方法：采用固相合成法合成曲普瑞林，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得粗品，粗品經(jīng)C18制備柱分離純化，凍干后，制得曲普瑞林精品；
缺點(diǎn)：得到的曲普瑞林總收率僅有25％左右。
在專利CN201310013712.2又一公開了一種曲普瑞林的純化方法，是將待純化的曲普瑞林用溶劑溶解并過濾得濾液，將所得濾液加載到離子交換柱上，用流動相洗脫并使曲普瑞林轉(zhuǎn)化成其鹽，收集主峰流出液；將所得流出液加載到硅膠柱上，用流動相洗脫，收集主峰洗脫液，除去溶劑，即得；
缺點(diǎn)：純化方法復(fù)雜，純化時間長、生產(chǎn)成本高，不利于規(guī)?；a(chǎn)；
在專利CN201310074154.0再公開了一種曲普瑞林的純化方法：首先用含有機(jī)溶劑的水溶液溶解樣品，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以磷酸或硫酸的緩沖鹽為A相，乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫；然后，采用反相HPLC方法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，將曲普瑞林磷酸鹽轉(zhuǎn)成醋酸鹽、凍干得到醋酸曲普瑞林；
缺點(diǎn):曲普瑞林的總收率僅在30％左右。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種純化收率高、過程簡單、時間短的合成制備醋酸曲普瑞林的方法，具體是通過以下方案實(shí)現(xiàn)的：
特異性微波合成制備醋酸曲普瑞林的方法，操作步驟如下：
步驟一：以溶脹、脫保護(hù)并洗滌后的取代度為0.3～0.5mmol/g的Rink Amide-AM Resin氨基樹脂為起始樹脂載體，依次與活化的保護(hù)氨基酸溶液于恒溫震蕩器中反應(yīng)，通過固相合成法的縮合反應(yīng)接入相對應(yīng)的保護(hù)氨基酸，得到曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂；
步驟二：對曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂溶液進(jìn)行脫保護(hù)并洗滌，得到固體顆粒；該固體顆粒用于進(jìn)行切割反應(yīng)，沉降后，得到曲普瑞林粗肽Ⅱ；
步驟三：對曲普瑞林粗肽Ⅱ進(jìn)行純化，純化選用C4填料制備柱，以A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸或乙腈為流動相，以B.Cone/％(5→70)，0→60min的梯度程序進(jìn)行多肽的分離提純，得到醋酸曲普瑞林。
所述固相合成法的縮合反應(yīng)溫度為20-40℃，縮合反應(yīng)所使用的活化劑為DIC，縮合劑為HOBT。
在氨基酸縮合反應(yīng)后，再用微波進(jìn)行10-20秒的合成反應(yīng)，提高縮合效率。
氨基樹脂的溶脹溶劑為DCM，浸泡2小時以上。
將保護(hù)氨基酸依次和HOBT放入離心管中，并加入DMF試劑，得到混合試液；向混合試液溶液中滴加DIC，混合完全，溶解得到所述活化的保護(hù)氨基酸溶液；
步驟一和步驟二中所述的脫保護(hù)并洗滌的操作如下：
(1)將溶液抽干后，加入體積為反應(yīng)器容積1/3-1/2的20％哌啶和DMF的混合溶液，將裝有混合溶液的反應(yīng)器置于轉(zhuǎn)速為30r/min的脫色搖床上，振搖20min后，將溶液抽干；(2)再向抽干溶液后的反應(yīng)器中加入體積為反應(yīng)器容積1/3-1/2的DMF溶液，并再次將反應(yīng)器置于脫色搖床上，振搖60s-90s后，將溶液抽干；(3)重復(fù)(2)的操作三次。
步驟二中所述的切割反應(yīng)的反應(yīng)試劑為TFA、TIS和H2O的混合液。
所述切割反應(yīng)是在20r/min的振搖條件下進(jìn)行的，反應(yīng)時間為38-42min。
對切割反應(yīng)后含有曲普瑞林粗肽Ⅱ的溶液用-20℃低溫預(yù)冷的無水乙醚溶液進(jìn)行離心沉降，得到乳膠狀的粗肽Ⅱ。
所述的保護(hù)氨基酸為：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Pyr-OH。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果：
(1)本發(fā)明中通過降低流動性PH值以提高離子配對能力，有利于純化并提高純度，并且優(yōu)化了純化梯度，縮短了純化時間，節(jié)省了純化流動相的使用，降低了生產(chǎn)成本；以乙酸代替三氟乙酸調(diào)節(jié)流動相PH，避免了最終產(chǎn)品中含有三氟乙酸，降低產(chǎn)品毒性，簡化了工藝流程。
(2)本發(fā)明利用Fmoc固相合成原理，開發(fā)了固相合成技術(shù)，采用常見易得、低成本的試劑縮合反應(yīng)，并采用特有的純化工藝條件，使得曲普瑞林粗品收率高達(dá)80％以上，其純品收率達(dá)到50％，大大提高了曲普瑞林的收率；本發(fā)明操作簡單，合成周期短，生產(chǎn)成本低，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
(3)本發(fā)明改善了異構(gòu)化現(xiàn)象，利用微波技術(shù)特有能量打破序列由于合成產(chǎn)生的二級結(jié)構(gòu)，從而提高多肽的生物活性，實(shí)現(xiàn)了高活性、高收率的生產(chǎn)工藝目的。
(4)本發(fā)明采用純化工藝進(jìn)行曲普瑞林粗肽的純化，產(chǎn)品純度達(dá)到99％，產(chǎn)品收率達(dá)到50％以上，在保證收率的同時大大縮短了生產(chǎn)周期，降低了生產(chǎn)成本，有利于大量生產(chǎn)，具有良好的市場應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1:特異性微波合成制備醋酸曲普瑞林的方法，操作步驟如下：
(1)：起始樹脂載體的目標(biāo)氨基樹脂的制備
將取代度為0.38mmol/g的Rink Amide-AM Resin氨基樹脂0.1g，從開口端加入至多肽合成反應(yīng)器中，取DCM試劑加入至反應(yīng)器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹2h；
將氨基樹脂溶液抽干后，加入1/3反應(yīng)器體積的20％哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將脫保護(hù)溶液抽干；再加入1/3反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖1min，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌樹脂，重復(fù)操作2次；使用茚三酮顯色檢測，合格后得到目標(biāo)氨基樹脂；
(2)：保護(hù)氨基酸的制備
將保護(hù)氨基酸依次和HOBT放入離心管中，并加入DMF試劑，得到混合試液；向混合試液溶液中滴加DIC，混合完全，溶解得到活化的保護(hù)氨基酸溶液；
保護(hù)氨基酸為：
Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Pyr-OH；
以Fmoc-Gly-OH為例，稱取22mg Fmoc-Gly-OH和12mg HOBT于離心管中，加2ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加10ul DIC，混合均勻得到活化的保護(hù)氨基酸溶液；
(3)：曲普瑞林樹脂I的合成
將上述的保護(hù)氨基酸溶液依次加到抽干的裝有目標(biāo)氨基樹脂的反應(yīng)器中，保護(hù)氨基酸的投料量為所投氨基樹脂摩爾數(shù)的2倍，活化劑為DIC，縮合劑為HOBT；將反應(yīng)器置于30℃的恒溫震蕩器中反應(yīng)10min，使用微波縮合15s。采用上述同樣方法，依次接入第2-10個氨基酸對應(yīng)的Fmoc-保護(hù)氨基酸，即得到曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂；
曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂為：
Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-氨基樹脂。
(4)：曲普瑞林粗肽Ⅱ的合成
將曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂溶液抽干后，加入1/2反應(yīng)器體積的20％哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將溶液抽干；再加入1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖1min，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂，重復(fù)操作三次。
將反應(yīng)器中的樹脂溶液用真空泵抽干至顆粒狀，配置10ml切割試劑：9.5ml TFA+0.25ml TIS+0.25ml H2O，加入到反應(yīng)器中，于20r/min的搖晃條件下切割反應(yīng)40min；
切割反應(yīng)后，多肽的沉降選用-20℃低溫預(yù)冷的無水乙醚，離心沉降三次，得到乳膠狀的粗肽樣品；
將粗品凍干后稱重，得到粉末狀樣品32mg，根據(jù)粗品的量和合成測定實(shí)際取代度(SD＝0.3mmol/g)計(jì)算的理論量，計(jì)算粗品收率達(dá)到82.3％，比現(xiàn)有技術(shù)僅50-60％的收率有大幅度成倍的提高。
(5)：曲普瑞林粗肽Ⅱ的純化
用20％乙腈和水的混合溶液溶解曲普瑞林粗品Ⅱ，經(jīng)反相高效液相色譜法純化得到曲普瑞林多肽，純化條件為：C4填料制備柱，流動相為A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸/乙腈，流速9ml/min，檢測波長210nm，制備梯度程序
收集樣品峰溶液，凍干后稱重得樣品為21.4mg，經(jīng)分析計(jì)算，曲普瑞林純度達(dá)到99.2％，其純品收率達(dá)到53.6％。
實(shí)施例2:
(1)：起始樹脂載體的目標(biāo)氨基樹脂的制備
將取代度為0.45mmol/g的Rink Amide-AM Resin氨基樹脂2g，從開口端加入至多肽合成反應(yīng)器中，取DCM試劑加入至反應(yīng)器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹8h；
將氨基樹脂溶液抽干后，加入1/2反應(yīng)器體積的20％哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將脫保護(hù)溶液抽干；再加入1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖90s，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌樹脂，重復(fù)操作2次,使用茚三酮顯色檢測，合格后得到目標(biāo)氨基樹脂；
(2)：保護(hù)氨基酸的制備
將保護(hù)氨基酸依次和HOBT放入離心管中，并加入DMF試劑，得到混合試液；向混合試液溶液中滴加DIC，混合完全，溶解得到活化的保護(hù)氨基酸溶液；
保護(hù)氨基酸為：
Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Pyr-OH；
以Fmoc-Gly-OH為例，稱取500mg Fmoc-Gly-OH和250mg HOBT于離心管中，加12ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加200ul DIC，混合均勻得到活化的保護(hù)氨基酸溶液；
(3)：曲普瑞林樹脂I的合成
將上述的保護(hù)氨基酸溶液依次分別加到抽干的裝有目標(biāo)氨基樹脂的反應(yīng)器中，保護(hù)氨基酸的投料量為所投氨基樹脂摩爾數(shù)的2倍，活化劑為DIC，縮合劑為HOBT；將反應(yīng)器置于30℃的恒溫震蕩器中反應(yīng)45min，使用微波縮合20s。采用上述同樣方法，依次接入第2-10個氨基酸對應(yīng)的Fmoc-保護(hù)氨基酸，即得到曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂；
曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂為：
Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-Gly-氨基樹脂。
(4)：曲普瑞林粗肽Ⅱ的合成
將曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂溶液抽干后，加入1/2反應(yīng)器體積的20％哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將溶液抽干；再加入1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖90s，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌曲普瑞林前體肽Ⅰ-氨基樹脂，重復(fù)操作三次。
將反應(yīng)器中的樹脂用真空泵抽干至顆粒狀，配置100ml切割試劑：95mlTFA+2.5ml TIS+2.5ml H2O，加入到反應(yīng)器中，于20r/min的搖晃條件下切割反應(yīng)40min；多肽的沉降選用-20℃低溫預(yù)冷的無水乙醚，離心沉降三次，得到乳膠狀的粗肽樣品；
將粗品凍干后稱重，得到粉末狀樣品746mg，根據(jù)粗品的量和合成測定實(shí)際取代度(SD＝0.36mmol/g)計(jì)算的理論量，計(jì)算粗品收率達(dá)到81.3％，比現(xiàn)有技術(shù)僅50-60％的收率有大幅度成倍的提高。
(5)：曲普瑞林粗肽Ⅱ的純化
用20％乙腈和水的混合溶液溶解曲普瑞林粗品Ⅱ，經(jīng)反相高效液相色譜法純化得到曲普瑞林多肽，純化條件為：C4填料制備柱，流動相為A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸/乙腈，流速9ml/min，檢測波長210nm，制備梯度程序
收集樣品峰溶液，凍干后稱重得樣品為441.5mg，經(jīng)分析計(jì)算，曲普瑞林純度達(dá)到99.1％，其純品收率達(dá)到53.1％。
本發(fā)明采用了固相合成技術(shù)，使用常見易得、低成本的試劑縮合反應(yīng)，并采用特有的純化工藝條件，使得曲普瑞林粗品收率高達(dá)80％以上，其純品收率達(dá)到50％，合成周期短、生產(chǎn)成本低、副產(chǎn)物少、收率高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
實(shí)施例1和實(shí)施例2中使用的保護(hù)氨基酸從樹脂起算第1-10個氨基酸相對應(yīng)的保護(hù)氨基酸及分子量如下表1所示；
表1
實(shí)施例1和實(shí)施例2中使用的英文縮寫的含義如下表2所示。
表2
以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。