生產(chǎn)環(huán)肽的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】生產(chǎn)環(huán)肽的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及通過(guò)借助于?；D(zhuǎn)移酶使環(huán)脂肽的?；溍擋；鶑亩a(chǎn)環(huán)肽化合 物或其鹽的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 環(huán)肽或環(huán)狀肽是其中末端氨基和末端羧基形成內(nèi)部肽鍵的多肽。一些環(huán)肽因它們 的有益藥物屬性而眾所周知。在自然界中，環(huán)肽的長(zhǎng)度可從僅幾個(gè)氨基酸至數(shù)百個(gè)氨基酸。 環(huán)肽可以是天然存在的化合物，但也可以通過(guò)全合成獲得或者通過(guò)天然存在或被天然產(chǎn)生 的前體的合成或基因修飾來(lái)獲得。后一類(lèi)被稱(chēng)為半合成環(huán)肽。當(dāng)環(huán)肽帶有一個(gè)或多個(gè)脂 質(zhì)尾或酰基鏈時(shí)，這種環(huán)肽被稱(chēng)為環(huán)脂肽（cycliclipop印tide)。具有抗生素活性的環(huán)脂 肽化合物例如達(dá)托霉素和安福霉素，環(huán)脂肽的一個(gè)極佳實(shí)例是棘白菌素（echinocandins) 類(lèi)，它們是有效的抗真菌劑。棘白菌素是帶有N-連接的酰基脂質(zhì)側(cè)鏈且分子量約為1200Da 的兩親性六肽。藥學(xué)上有用的棘白菌素的實(shí)例是環(huán)六肽阿尼芬凈（anidulafungin)、卡泊芬 凈（caspofungin)、西洛芬凈（cilofungin)和米卡芬凈（micafungin)，它們?cè)谥委熣婢?染（尤其是由Aspergillus,Blastomyces,Candida,Coccidioides和Histoplasma弓|起的 那些）中有用。阿尼芬凈（l-[(4R，5R)-4,5-二羥基-N2-[[4〃-(戊氧基）[1，1'：4'，1〃-三 聯(lián)苯]-4-基]羰基]-1^-鳥(niǎo)氨酸]棘白菌素抝、卡泊芬凈（1-[(41?，55)-5-[(2-氨乙基）氨 基]-N2- (10, 12-二甲基-1-氧代十四烷基）-4-羥基-L-鳥(niǎo)氨酸]-5- [ (3R) -3-羥基-L-鳥(niǎo) 氨酸]-紐莫康定8。）和米卡芬凈（1-[(41?，510-4,5-二羥基-吧-[4-[5-[4-(戊氧基）苯 基]-3-異惡唑基]苯甲?；鵠-L-鳥(niǎo)氨酸]-4- [ (4S) -4-羥基-4- [4-羥基-3-(磺酰氧基） 苯基]-L-蘇氨酸]紐莫康定心）均為半合成環(huán)六肽，它們可衍生自天然存在的棘白菌素， 例如棘白菌素B、紐莫康定Ap紐莫康定4或FR901379。
[0004] 天然環(huán)脂肽通常由微生物產(chǎn)生。達(dá)托霉素由土壤細(xì)菌Streptomycesroseosporus 產(chǎn)生。安福霉素由Streptomycescanus產(chǎn)生。天然棘白菌素（例如棘白菌素B,棘白菌素 C，阿枯菌素Ay，紐莫康定B。和FR901379)也通常由多種微生物產(chǎn)生。例如，棘白菌素B 由真菌Aspergillusnidulans產(chǎn)生，F(xiàn)R901379 由真菌Coleophomaempetri產(chǎn)生。
[0005] 環(huán)脂肽的酰基鏈已被證明是抗真菌活性和毒性的重要決定因素（Debono M.&GordeeR.S. ,Annu.Rev.Microbiol. 48, 471 (1994))。例如，天然存在的環(huán)狀抗真 菌脂肽FR901379帶有附接在N-末端的脂肪酸?；鶊F(tuán)，它展示出有效的體內(nèi)抗真 菌活性(Iwamoto,T. ,FujieA. ,Nitta,K. ,Hashimoto,S. ,Okuhara,M. ,Kohsaka,M. ,J. Antibiot.￡L1092(1994))。不幸的是，就像一些其它天然存在的棘白菌素一樣，F(xiàn)R901379 也顯示出高溶血活性。酶法移除脂肪酸鏈并替換為辛氧基苯甲?；；滐@示：FR901379 的原始活性被保留，但溶血活性顯著降低。另一個(gè)實(shí)例是米卡芬凈，其是通過(guò)將FR901379 的脂質(zhì)尾交換成復(fù)雜的3, 5-二苯基取代異惡挫?；鶊F(tuán)產(chǎn)生的（Fujie,PureAppl. Chem.I2,4期，603-614頁(yè)（2007))。因此，環(huán)脂肽的天然?；湹拿擋；试S引入替換性 側(cè)鏈，這改善抗真菌效力和降低溶血活性。
[0006] 借助于源自Actinoplanesutahensis的阿枯菌素A酰基轉(zhuǎn)移酶，環(huán)脂肽（例如棘 白菌素）的脫?；驯唤ⅰP4228072(A)公開(kāi)了催化脂質(zhì)環(huán)肽代謝產(chǎn)物（例如棘白菌素B和阿枯菌素）的脂質(zhì)?；糠值拿擋；拿浮P4075585描述了可在Streptomyces(作 為宿主生物體）中培養(yǎng)這種?；D(zhuǎn)移酶。從培養(yǎng)溶液中收集阿枯菌素A?；D(zhuǎn)移酶之后， 其被直接用于使底物脫?；?。在優(yōu)化酶法脫酰基的過(guò)程中，已發(fā)現(xiàn)Streptomycesspp.的 一些?；D(zhuǎn)移酶更為有效。EP0885957A1描述了源自Streptomyces屬的環(huán)脂肽酰基轉(zhuǎn)移 酶，其能夠使環(huán)脂肽化合物（例如上述棘白菌素FR901379或其類(lèi)似物）的?；溍擋；?； 以及描述了生產(chǎn)環(huán)肽化合物的方法，所述方法包括使用所述?；D(zhuǎn)移酶。
[0007] 上述用于環(huán)脂肽的脫?；姆椒ǖ娜秉c(diǎn)為：不能在工業(yè)上優(yōu)選的生產(chǎn)宿主（例 如Escherichiacoli或Bacillus)中以有功能的形式和以足量產(chǎn)生上述?；D(zhuǎn)移酶。 在Streptomyces或Actinoplanesutahensis中生產(chǎn)?；D(zhuǎn)移酶在工業(yè)設(shè)定中不是優(yōu)選 的，這是因?yàn)橛捎谶@些生物體中的低表達(dá)水平而導(dǎo)致相對(duì)較低的酶產(chǎn)量并且這些生物體 較不適用于發(fā)酵器系統(tǒng)。例如，在發(fā)酵器系統(tǒng)中使用Streptomyceslividans常常導(dǎo)致 粘度方面的問(wèn)題，這阻止高細(xì)胞密度的獲得。此外，當(dāng)在Streptomyces或Actinoplanes utahensis中生產(chǎn)上述?；D(zhuǎn)移酶時(shí)，存在下游處理方面的問(wèn)題。在這些生物體中，酶似 乎附接于生物質(zhì)，在酰基轉(zhuǎn)移酶的純化過(guò)程中，利用高鹽濃度萃取是必需的（EP0885957 Al,Kreuzman等人，2000,JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology, 24, 173 -180,Ueda等人，2011,JournalofBioscienceandBioengineering112, 409-414Ueda 等人，2011,JournalofAntibiotics紐,169-175)。考慮到腐蝕和環(huán)境問(wèn)題，在大規(guī)模工 業(yè)生產(chǎn)中使用鹽從培養(yǎng)液中釋放酶是不期望的。
[0008] 考慮到嚴(yán)格管理和健康相關(guān)的要求，存在對(duì)經(jīng)改進(jìn)的純化和分離方法的需求。因 此，本發(fā)明旨在通過(guò)提供應(yīng)用以下酰基轉(zhuǎn)移酶的方法在工業(yè)規(guī)模上改善環(huán)脂肽的脫?；?， 所述酰基轉(zhuǎn)移酶能夠在工業(yè)上優(yōu)選的生產(chǎn)宿主中以有功能的形式被生產(chǎn)。
[0009] 發(fā)明詳沐
[0010] 本發(fā)明涉及生產(chǎn)環(huán)肽化合物或其鹽的方法，所述方法包括：使環(huán)脂肽化合物或其 鹽與來(lái)源于屬于Pseudomonas屬的微生物的酰基轉(zhuǎn)移酶接觸，以使所述環(huán)脂肽的脂質(zhì)酰基 部分脫?；Ｍㄟ^(guò)在從環(huán)脂肽生產(chǎn)環(huán)肽的方法中使用Pseudomonas?；D(zhuǎn)移酶，可以以更 高效的方式從環(huán)脂肽生產(chǎn)環(huán)肽，因?yàn)镻seudomonas酰基轉(zhuǎn)移酶能夠在工業(yè)上優(yōu)選的生產(chǎn)生 物體中以高效和大規(guī)模的方式被生產(chǎn)。因此，本發(fā)明提供抗菌環(huán)肽的生產(chǎn)過(guò)程的重要改善。
[0011] 脫?；?，獲得的環(huán)肽可經(jīng)受下述額外步驟：再?；霏h(huán)肽以產(chǎn)生再?；?環(huán)肽。以這種方式，可以獲得期望的抗菌產(chǎn)物。再酰化環(huán)肽通常涉及合成環(huán)肽的新?；?的過(guò)程，隨后是將所述酰基鏈與環(huán)肽的游離氨基連接的過(guò)程。再?；?，可進(jìn)一步處理再 酰化的環(huán)肽的?；溡援a(chǎn)生進(jìn)一步處理的再?；沫h(huán)肽。這可通過(guò)任何合適的化學(xué)、半化 學(xué)或酶法方法實(shí)現(xiàn)。再?；^(guò)程之后通常是純化由此得到的新環(huán)脂肽至合適的質(zhì)量和/或 晶體形式。
[0012] 合成新酰基鏈的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，例如全化學(xué)合成或 半合成，即發(fā)酵之后一次或多次化學(xué)轉(zhuǎn)化。再酰化環(huán)肽的方法的一個(gè)實(shí)例可以是從1-溴辛 烷和4-羥基苯甲酸化學(xué)合成?；?，隨后將由此得到的2, 4, 5-三氯苯基4-(正辛氧基） 苯甲酸酯與FR901379的脫?；苌锏挠坞x氨基連接，如Fujie，PureAppl.Chem.迫，4 期，603-614頁(yè)（2007)中所述。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)環(huán)脂肽的方法可例如產(chǎn)生米卡芬凈或其鹽。因此，上述再?；?的環(huán)肽或進(jìn)一步處理的再?；沫h(huán)肽可以是米卡芬凈或其鹽。生產(chǎn)米卡芬凈的方法起始于 FR901379的生產(chǎn)。這可以通過(guò)下述實(shí)現(xiàn)：通過(guò)Coleophomaempetri發(fā)酵，隨后進(jìn)行下游 處理以獲得FR901379或其鹽的所需純度。
[0014] 為了獲得米卡芬凈，首先必須移除FR901379的?；鶄?cè)鏈。為了這個(gè)目的，實(shí)現(xiàn)在 工業(yè)上優(yōu)選的生產(chǎn)菌株中表達(dá)源自Pseudomonas的酰基轉(zhuǎn)移酶，隨后進(jìn)行下游處理和酶的 配制。然后進(jìn)行生物催化過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)R901379的?；鶄?cè)鏈被移除從而產(chǎn)生米卡 芬凈前體。
[0015] 為了從米卡芬凈前體合成米卡芬凈，首先必須有可用的恰當(dāng)側(cè)鏈。對(duì)于米卡芬凈， 所述側(cè)鏈為3, 5-二苯基-取代異惡唑。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)合成側(cè)鏈。隨 后，通過(guò)常規(guī)化學(xué)、半化學(xué)或酶法方法將側(cè)鏈與米卡芬凈前體連接。任選地進(jìn)一步處理新酰 基鏈之后，純化米卡芬凈以獲得合適的質(zhì)量和晶體形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可已知的用于將 期望的環(huán)肽純化至合適的質(zhì)量和/或晶體形式的任意合適方法均可被應(yīng)用。
[0016] 環(huán)脂肽
[0017] 環(huán)脂肽化合物可以是環(huán)脂肽例如達(dá)托霉素或安福霉素或其衍生物，或者棘白菌素 類(lèi)的環(huán)脂肽。優(yōu)選地，環(huán)脂肽是棘白菌素衍生物。棘白菌素是通式（1)的化合物，
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 生產(chǎn)環(huán)肽化合物或其鹽的方法，所述方法包括：使環(huán)脂肽化合物或其鹽與來(lái)源于屬 于Pseudomonas屬的微生物的酰基轉(zhuǎn)移酶接觸，以使所述環(huán)脂肽脫?；?br>2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括再?；霏h(huán)肽產(chǎn)生再?；h(huán)肽的額外步驟。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中進(jìn)一步處理所述再酰化環(huán)肽的?；?，產(chǎn)生進(jìn)一步處 理的再?；h(huán)肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述?；D(zhuǎn)移酶獲自被編碼來(lái)源于 Pseudomonas的酰基轉(zhuǎn)移酶的載體轉(zhuǎn)化的生物體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述生物體選自由Escherichia coli,Bacillus, Pseudomonas alcaligenes, Pichia pastoris和Kluyveromyces Iactis組 成的組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中由所述載體編碼的?；D(zhuǎn)移酶是具有SEQIDN0:1 所示氨基酸序列或與SEQIDN0:1所示氨基酸序列有50-100%范圍內(nèi)的序列同一性的氨基 酸序列的蛋白質(zhì)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列含有下列序列基序： i) D-X4-[V 或 T]-X2-L-[L 或 M]-X3-G(SEQ ID N0:3); ii)[L或 I]-P-G-L-P-X2-N(SEQ ID N0:4); iii) R-V-L-X2-W(SEQIDNO:5);和 iv)H-T-V-D-X3-H(SEQIDNO:6)， 其中乂"是長(zhǎng)度為"n"的未指明氨基酸殘基的序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體編碼SEQIDNO: 1所示的氨基酸 序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述?；D(zhuǎn)移酶來(lái)源于Pseudomonas aeruginosa〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述環(huán)脂肽是棘白菌素衍生物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述棘白菌素衍生物選自由阿枯菌素A， cryptocandin，棘白菌素B，F(xiàn)R209602，F(xiàn)R901379,紐莫康定A、B和C以及孢利芬凈組成的 組。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述再?；h(huán)肽或所述進(jìn)一步處理的再 ?；h(huán)肽是米卡芬凈或其鹽。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生產(chǎn)環(huán)肽化合物或其鹽的方法，所述方法包括：使環(huán)脂肽化合物或其鹽與來(lái)源于屬于Pseudomonas屬的微生物的酰基轉(zhuǎn)移酶接觸，以使所述環(huán)脂肽的脂質(zhì)?；糠置擋；?。
【IPC分類(lèi)】C12P21-02, C07K1-12, C07K7-50, C12N9-52
【公開(kāi)號(hào)】CN104768966
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380049118
【發(fā)明人】簡(jiǎn)·米特斯卡·拉恩·范·德, 理查德·克爾曼, 魯?shù)婪颉ぜ共ㄌ厮埂が旣悺ぢ芬滋? 馬可·亞歷山大·伯格·范·丹
【申請(qǐng)人】中化帝斯曼制藥有限公司荷蘭公司
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2013年9月20日
【公告號(hào)】EP2897971A1, US20150218221, WO2014044803A1