專(zhuān)利名稱(chēng)：制備與樹(shù)脂結(jié)合的環(huán)狀肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以片段為基礎(chǔ)制備與樹(shù)脂結(jié)合的環(huán)狀肽甲狀旁腺激素類(lèi)似物和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白類(lèi)似物的方法，所述類(lèi)似物含有至少一個(gè)在兩個(gè)不相鄰的氨基酸殘基側(cè)鏈之間的橋。更具體地講，本發(fā)明涉及固相合成所述環(huán)狀肽類(lèi)似物的方法以及該方法所用的肽片段。
人甲狀旁腺激素(hPTH)為鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)物，是一個(gè)84個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(hPTHrP)為與hPTH具有N末端同源性的139-171個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。hPTH和hPTHrP的N末端片段，尤其是由氨基酸1-34組成的那些保留了親代激素的全部生物學(xué)活性。
hPTH(1-34)具有下面的氨基酸序列Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe.
hPTHrP(1-34)具有下面的氨基酸序列
Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-His-Thr-Ala.
hPTH的生物學(xué)活性反映在第二信使系統(tǒng)的活化中G-蛋白偶聯(lián)的腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性和G-蛋白偶聯(lián)和未偶聯(lián)蛋白激酶C(PKC)活性。就人和卵巢切除的大鼠中的骨形成而言，N末端片段hPTH(1-34)OH和hPTH(1-34)NH2已分別被證實(shí)是合成代謝的。這種骨生長(zhǎng)的增加已證實(shí)與腺苷酸環(huán)化酶活性的刺激相偶聯(lián)。這些N末端片段的類(lèi)似物對(duì)于治療與骨細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)相關(guān)的生理疾病具有顯著的治療功效包括低血鈣；骨質(zhì)疏松；骨質(zhì)減少；和與骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)減少相關(guān)的疾病，如甲狀旁腺功能亢進(jìn)、甲狀旁腺功能減退和庫(kù)欣綜合癥；糖皮質(zhì)激素和免疫抑制誘導(dǎo)的骨質(zhì)減少；骨折和骨再折術(shù)恢復(fù)。
還已證實(shí)從hPTH(1-34)的N末端缺失多達(dá)6個(gè)氨基酸殘基明顯降低得到的類(lèi)似物刺激腺苷酸環(huán)化酶的能力，同時(shí)對(duì)受體結(jié)合幾乎沒(méi)有影響。因此，在N末端截短高達(dá)6個(gè)氨基酸殘基的hPTH(1-34)類(lèi)似物抑制PTH的作用，可用于治療特征為PTH過(guò)量的疾病，如甲狀旁腺過(guò)量亢進(jìn)和與甲狀旁腺功能減退相關(guān)的高血鈣危象、惡性高血鈣疾病、腎衰竭和高血壓。
hPTH(1-27)-(1-34)的無(wú)環(huán)類(lèi)似物公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,086,196中。hPTH(1-34)和hPTHrP(1-34)的無(wú)環(huán)類(lèi)似物公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,589,452中。[Nle8,Nle18,Tyr34或Phe34]hPTH(1-34)公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,656,250中。[Nle8,Nle18,Tyr34]hPTH(1-34)和其N(xiāo)末端截短衍生物公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,771,124和4,423,037中。PTH(1-34)的其它無(wú)環(huán)類(lèi)似物公開(kāi)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,723,577和5,434,246,WO 97/02834、EPA561412-A1、EPA 747817-A2、WO-94/02510、WO 9603437和WO9511988-A1中。hPTH(1-28)NH2至hPTH(1-31)NH2和[Leu27]hPTH(1-28)NH2至[Leu27]hPTH(1-33)NH2的類(lèi)似物描述在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,556,940中。包括PTH的N末端截短類(lèi)似物的PTH受體的無(wú)環(huán)拮抗劑公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,446,130、5,229,489、4,771,124和4,423,037中。
公開(kāi)了hPTH和hPTHrP的單環(huán)和雙環(huán)類(lèi)似物。環(huán)(Lys26-Asp30)[Leu27]hPTH(1-34)NH2和環(huán)(Lys27-Asp30)hPTH(1-34)NH2公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,556,940中。Barbier等(藥物化學(xué)雜志1997,40,1373)描述了環(huán)(Lys26-Asp30)[Leu27]hPTH(1-31)NH2、環(huán)(Glu22-Lys26)[Leu27]hPTH(1-31)NH2和環(huán)(Lys27-Asp30)hPTH(1-31)NH2。hPTH(1-34)或hPTHrP(1-34)的單環(huán)和雙環(huán)衍生物公開(kāi)在專(zhuān)利文件WO96/40193、DE19508672-A2和A.Bisello等，生物化學(xué)1997,36,3293中。M.Chorev等，生物化學(xué)1991,30,5698公開(kāi)了一種PTH受體的可能的拮抗劑，環(huán)(Lys13-Asp17)hPTH(7-34)NH2。且Kanmera等，“肽化學(xué)1993:Okada,Y.，編蛋白質(zhì)研究基礎(chǔ)，Osaka,1994,321-324”描述了hPTHrP的一系列含酰胺的類(lèi)似物。
WO 98/51324公開(kāi)了式Ⅰ的環(huán)肽化合物X-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-YⅠ或其可藥用鹽或前藥，其中X選自(a)R1a-A0-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(b)R1a-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(d)R1a-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(e)R1a-A5-A6-A7-A8-A9-,(f)R1a-A6-A7-A8-A9-,(g)R1a-A7-A8-A9-,(h)R1a-A8-A9-,(i)R1a-A9-,和(i)R1a-；Y選自
(a)-R3,(b)-A28-R3,(c)-A28-A29-R3,(d)-A28-A29-A30-R3,(e)-A28-A29-A30-A31-R3,(f)-A28-A29-A30-A31-A32-R3,(g)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3，和(h)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3；R1a為H、烷基、芳烷基或-COR2；R1b為R1a或下式的基團(tuán) 或 R2為烷基、鏈烯基、炔基、芳基或芳烷基；R3為式A35-OR4或A35-NR4R5的基團(tuán)；R4和R5彼此獨(dú)立地為H或低級(jí)烷基；R6和R9彼此獨(dú)立地為H或烷基；R7為烷基；R8為H、烷基或COR2；R10為H或鹵素；R11為烷基或芳烷基；m為1,2或3；n為3或4；A0不存在或?yàn)?-6個(gè)氨基酸殘基的肽；A1為Ser、Ala、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A2為Ala、Val或Gly或其等同的氨基酸；A3為Ala、Ser、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A4為Glu、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A5為Ile、His、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A6為Ala、Gln、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A7為Ala、Leu、Gly或其等同的氨基酸；A8為L(zhǎng)eu、Nle、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A9為His、Ala、D-Pro或Gly或其等同的氨基酸；A10為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A11為Ala、Gly、Leu或Lys或其等同的氨基酸；A12為Ala或Gly或其等同的氨基酸；A13為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A14為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、His、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A15為Ala、Gly、Ile、D-Pro或Leu或其等同的氨基酸；A16為Asn、Ala、Gly、D-Pro或Gln或其等同的氨基酸；A17為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A18為Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Leu、Lys、Orn、Nle、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A19為Arg或Glu或其等同的氨基酸；A20為Arg或其等同的氨基酸；A21為Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Lys、Orn、Ser、Thr、Val、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A22為Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Phe、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A23為L(zhǎng)eu、Phe或Trp或其等同的氨基酸；A24為L(zhǎng)eu或其等同的氨基酸；A25為Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、D-Pro、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A26為Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A27為L(zhǎng)eu或Lys或其等同的氨基酸；A28為Ile或Leu或其等同的氨基酸；A29為Ala、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gln、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A30為Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A31為Ile或Leu或Val或其等同的氨基酸；A32為His或其等同的氨基酸；A33為Asn或Thr或其等同的氨基酸；A34為Ala或Phe或其等同的氨基酸；A35不存在或?yàn)?-4個(gè)氨基酸的肽；和至少一個(gè)下面的氨基酸殘基對(duì)的側(cè)鏈經(jīng)酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接形成一個(gè)橋，這些氨基酸殘基對(duì)為A10與A14、A13與A17、A14與A18、A17與A21、A18與A22、A21與A25、A25與A29和A26與A30，并且下面各個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈最多導(dǎo)致形成一個(gè)橋，這些氨基酸殘基為A10、A13、A14、A17、A18、A21、A22、A25、A26、A29和A30；條件是當(dāng)下面的氨基酸殘基對(duì)A13與A17或A26與A30的側(cè)鏈經(jīng)酰胺鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接形成一個(gè)橋時(shí)，至少一個(gè)下面的氨基酸殘基對(duì)A10與A14、A14與A18、A17與A21、A18與A22、A21與A25和A25與A29的側(cè)鏈也經(jīng)酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接。
式Ⅰ的肽化合物的一個(gè)優(yōu)選亞組包括如下肽化合物，其中X選自(a)R1a-A0-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(b)R1a-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,
(d)R1a-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(e)R1a-A5-A6-A7-A8-A9-,(f)R1a-A6-A7-A8-A9-,(g)R1a-A7-A8-A9-,(h)R1a-A8-A9-,(i)R1a-A9-，和(j)R1a-；Y選自(a)-R3,(b)-A28-R3,(c)-A28-A29-R3,(d)-A28-A29-A30-R3,(e)-A28-A29-A20-A31-R3,(f)-A28-A29-A30-A31-A32-R3,(g)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3，和(h)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3；R1a為H、烷基、芳烷基或-COR2；R1b為R1a或式 或 R2為烷基、鏈烯基、炔基、芳基或芳烷基；R3為式A35-OR4或A35-NR4R5；R4和R5彼此獨(dú)立地為H或低級(jí)烷基；R6和R9彼此獨(dú)立地為H或烷基；R7為烷基；R8為H、烷基或COR2；R10為H或鹵素；R11為烷基或芳烷基；A0不存在或?yàn)?-6個(gè)氨基酸殘基的肽；A1為Ser、Ala、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A2為Ala、Val或Gly或其等同的氨基酸；A3為Ala、Ser、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A4為Glu、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A5為Ile、His、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A6為Ala、Gln、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A7為Ala、Leu、Gly或其等同的氨基酸；A8為L(zhǎng)eu、Nle、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A9為His、Ala、Gly、D-Pro或其等同的氨基酸；A10為Ala、Asn、Gly、Asp或D-Pro或其等同的氨基酸；A11為Ala、Gly、Leu或Lys或其等同的氨基酸；A12為Ala或Gly或其等同的氨基酸；A13為Ala、Gly、Lys或其等同的氨基酸；A14為Ala、His、Asp、Gly、Lys、Ser、D-Pro或其等同的氨基酸；A15為Ala、Gly、Ile、D-Pro或Leu或其等同的氨基酸；A16Asn、Ala、Gly、D-Pro或Gln或其等同的氨基酸；A17為Ala、Asp、Gly、Lys、Ser、D-Pro或其等同的氨基酸；A18為L(zhǎng)ys或其等同的氨基酸；A19為Arg或Glu或其等同的氨基酸；A20為Arg或其等同的氨基酸；A21為Arg、Asp、Lys、Val或其等同的氨基酸；A22為Asp、Glu、Lys、Orn或其等同的氨基酸；A23為L(zhǎng)eu、Phe或Trp或其等同的氨基酸；A24為L(zhǎng)eu或其等同的氨基酸；A25為Arg、Asp、Glu、His、Lys或其等同的氨基酸；A26為His、Lys或其等同的氨基酸；A27為L(zhǎng)eu或Lys或其等同的氨基酸；A28為Ile或Leu或其等同的氨基酸；A29為Ala、Asp、Glu、Gln或其等同的氨基酸；A30為Asp、Glu、Lys或其等同的氨基酸；A31為Ile或Leu或Val或其等同的氨基酸；A32為His或其等同的氨基酸；A33為Asn或Thr或其等同的氨基酸；A34為Ala或Phe或其等同的氨基酸；A35不存在或?yàn)?-4個(gè)氨基酸的肽。
上述肽化合物公開(kāi)于WO 98/51324，它們具有有用的特性，更具體地說(shuō)為藥物學(xué)特性。它們特別適用于治療能夠通過(guò)可與甲狀旁腺激素受體結(jié)合的伴隨或不伴隨刺激腺苷酸環(huán)化酶活性的化合物來(lái)調(diào)節(jié)的疾病。本發(fā)明涉及合成這些肽化合物的改進(jìn)的方法。
環(huán)狀肽的固相合成通常包括，在肽合成樹(shù)脂上順次加成氨基酸以得到與樹(shù)脂結(jié)合的具有所需環(huán)肽的全部或部分氨基酸序列的肽。然后將準(zhǔn)備環(huán)化的氨基酸側(cè)鏈殘基脫保護(hù)并進(jìn)行環(huán)化。如果環(huán)化在整個(gè)氨基酸序列完成之前進(jìn)行，則加入剩余的氨基酸，然后將完成了的肽從樹(shù)脂上裂解并進(jìn)行純化。
但是，制備肽和環(huán)肽的線(xiàn)性方法通常不很有效，因此在大量制備肽時(shí)成本很高。當(dāng)以線(xiàn)性方式裝配肽時(shí)，隨著肽中氨基酸殘基數(shù)量的增加，肽的純化會(huì)越來(lái)越困難。此外，對(duì)于環(huán)肽，在合成接近結(jié)束時(shí)制備側(cè)鏈橋?qū)?huì)給整個(gè)肽帶來(lái)與制備側(cè)鏈橋有關(guān)的問(wèn)題，包括收率低、副反應(yīng)和雜質(zhì)的去除。因此，在長(zhǎng)肽中摻入環(huán)狀單元增加了直鏈肽合成的難度。上文中所描述的公開(kāi)于WO 98/51324中的那些環(huán)狀hPTH類(lèi)似物的商業(yè)可行性合成需要克服了長(zhǎng)的和環(huán)狀成分的復(fù)雜因素，并且就藥物生產(chǎn)而言能夠進(jìn)行商業(yè)有用量的制備的合成方法。本發(fā)明涉及通過(guò)使用橋接和非橋接片段的方法更有效地制備環(huán)狀hPTH和HRPHrP類(lèi)似物。
在本文所述的方法中，單獨(dú)制備環(huán)狀肽片段用于和樹(shù)脂或與樹(shù)脂結(jié)合的肽偶聯(lián)。通過(guò)單獨(dú)制備環(huán)狀肽片段，可以進(jìn)行與樹(shù)脂結(jié)合的環(huán)肽的會(huì)聚合成，從而提高了所生成的環(huán)肽的收率和產(chǎn)量。與制備橋接片段有關(guān)的困難被局限在了較小的肽亞單位，所述肽亞單位可以在和固相合成樹(shù)脂偶聯(lián)之前進(jìn)行純化。該技術(shù)在某些優(yōu)選的hPTH和hPTHrP類(lèi)似物中的實(shí)踐需要合成新的肽片段和新的操作順序。發(fā)明詳述若無(wú)另外說(shuō)明，如上面以及整個(gè)說(shuō)明書(shū)所使用的下列術(shù)語(yǔ)將被理解為具有下面的含義。術(shù)語(yǔ)的定義“烷基”指鏈中含有約1-約20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈脂族烴基團(tuán)。支鏈指一個(gè)或多個(gè)低級(jí)烷基基團(tuán)與直鏈烷基鏈相連?！暗图?jí)烷基”指在可為直鏈或支鏈的鏈中含有約1-4個(gè)碳原子。烷基基團(tuán)實(shí)例為甲基、乙基、正丙基和異丙基、正、仲、異和叔丁基等。
“鏈烯基”指包含碳-碳雙鍵的脂族烴基基團(tuán)，其可為在鏈中含有約2-約20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈?！暗图?jí)鏈烯基”指在可為直鏈或支鏈的鏈中含有約2-4個(gè)碳原子。作為實(shí)例的鏈烯基基團(tuán)包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、環(huán)己基丁烯基和癸烯基。
“炔基”指包含碳-碳三鍵的脂族烴基基團(tuán)，其可為在鏈中含有約2-約20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈?！暗图?jí)炔基”指在可為直鏈或支鏈的鏈中含有約2-4個(gè)碳原子。作為實(shí)例的炔基基團(tuán)包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、3-甲基丁-2-炔基、正戊炔基、庚炔基、辛炔基和癸烯基。
“亞烷基”指通過(guò)除去兩個(gè)氫原子而從直鏈或支鏈飽和烴衍生的二價(jià)基團(tuán)，例如亞甲基、1,2-亞乙基、1,1-亞乙基、1,3-亞丙基、2,2-二甲基亞丙基等。
“苯基烷基”指經(jīng)亞烷基與母體分子部分相連的苯基。亞烷基優(yōu)選含有約1至約7個(gè)碳原子。代表性的苯基烷基包括芐基、2-苯基乙基、2-苯基丙基等。
“胺保護(hù)基”指本領(lǐng)域已知的易于除去的基團(tuán)，該基團(tuán)可以防止氨基在合成過(guò)程中發(fā)生不利的反應(yīng)并且可以被選擇性地除去。N-保護(hù)基的使用是防止基團(tuán)在合成過(guò)程中發(fā)生不利反應(yīng)的本領(lǐng)域中熟知的，并且許多這種保護(hù)基是已知的，參見(jiàn)，例如T.H.Greene和P.G.M Wuts，有機(jī)合成中的保護(hù)基，第2版，John Wiely & Sons,New York(1991)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。優(yōu)選的N-保護(hù)基是?；?，包括甲?；?、乙?；⒙纫阴；⑷纫阴；?、鄰-硝基苯乙酰基、鄰-硝基苯氧基乙?；?、三氟乙?；?、乙酰乙?；?-氯丁?；?、異丁?；?、鄰-硝基硝基肉桂酰基、吡啶甲?；?、?；惲蚯杷狨?、氨基己酰基、苯甲?；?，以及酰氧基，包括甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基、2,2,2-三氟乙氧羰基、2-三甲基硅烷基乙氧羰基、乙烯氧羰基、烯丙氧羰基、叔丁氧羰基(BOC)、1,1-二甲基丙炔氧羰基、芐氧羰基(CBZ)、對(duì)-硝基苯基亞磺?；?、對(duì)-硝基芐氧羰基、2,4-二氯芐氧羰基、烯丙氧羰基(Alloc)等。
“氨基酸”指如本文所定義的選自天然和非天然氨基酸的氨基酸。取決于側(cè)鏈的取代基，氨基酸可為中性、帶正電或帶負(fù)電?！爸行园被帷敝赴粠щ姾傻膫?cè)鏈取代基的氨基酸。作為實(shí)例的中性氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸?！皫д姷陌被帷敝冈谏韕H下側(cè)鏈取代基帶正電的氨基酸。作為實(shí)例的帶正電的氨基酸包括賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸。“帶負(fù)電的氨基酸”指在生理pH下側(cè)鏈取代基帶凈負(fù)電的氨基酸。作為實(shí)例的帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。優(yōu)選的氨基酸為α-氨基酸。最優(yōu)選的氨基酸為在α-碳原子上具有L-立體化學(xué)的α-氨基酸。
“氨基酸殘基”指摻入到肽或肽片段中的各氨基酸單元。
“天然氨基酸”指選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的α-氨基酸。
“非天然氨基酸”指沒(méi)有核酸密碼子的氨基酸。非天然氨基酸的實(shí)例包括例如上述天然α-氨基酸的D-異構(gòu)體；Aib(氨基丁酸)、bAib(3-氨基異丁酸)、Nva(正纈氨酸)、β-Ala、Aad(2-氨基己二酸)、bAad(3-氨基己二酸)、Abu(2-氨基丁酸)、Gaba(γ-氨基丁酸)、Acp(6-氨基己酸)、Dbu(2,4-二氨基丁酸)、α-氨基庚二酸、TMSA(三甲基硅基-Ala)、aIle(別異亮氨酸)、Nle(正亮氨酸)、叔亮氨酸、Cit(瓜氨酸)、Orn、Dpm(2,2’-二氨基庚二酸)、Dpr(2,3-二氨基丙酸)、α-或β-Nal、Cha(環(huán)己基-Ala)、羥基脯氨酸、Sar(肌氨酸)等；環(huán)狀氨基酸；Nα-烷基化的氨基酸，如MeGly(Nα-甲基甘氨酸)、EtGly(Nα-乙基甘氨酸)和EtAsn(Nα-乙基天冬酰胺)；和α碳原子具有兩個(gè)側(cè)鏈取代基的氨基酸。
“等同的氨基酸”指在根據(jù)本發(fā)明的肽中可被另一個(gè)氨基酸替換而沒(méi)有任何顯著的功能喪失的氨基酸。在進(jìn)行這些改變中，根據(jù)側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性進(jìn)行類(lèi)似氨基酸的替換，例如考慮如本文所描述的大小、電荷、親水性、hydropathicity和疏水性。
如被本文引作參考的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,554,101所詳細(xì)描述的，氨基酸殘基被確定具有下面的親水性值A(chǔ)rg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)和Trp(-3.4)。應(yīng)理解一個(gè)氨基酸殘基可替換具有類(lèi)似親水性值的另一個(gè)氨基酸(例如在+或-2.0的值之間)，并且仍獲得生物學(xué)等同的多肽。
用類(lèi)似的方法，可根據(jù)親水性指數(shù)的相似性進(jìn)行替換。根據(jù)其疏水性和電荷特性各氨基酸殘基被確定了一個(gè)親水性值。那些親水性指數(shù)為Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)和Arg(-4.5)。在根據(jù)親水性指數(shù)進(jìn)行替換中，優(yōu)選+或-2.0之間的值。
“肽”和“多肽”指單體為經(jīng)酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。本發(fā)明優(yōu)選的肽化合物為包含α-氨基酸的那些。首選的本發(fā)明的肽含有在α-碳具有L立體化學(xué)的α-氨基酸。
“環(huán)肽”指含有一個(gè)或多個(gè)本文所定義的環(huán)肽片段的肽。
“肽片段”指母肽的肽亞單位。肽片段可以包括靶肽的直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的亞單位。
“直鏈的肽”指其中的氨基酸是通過(guò)一個(gè)氨基酸的N-末端與另一個(gè)氨基酸的C-末端之間的酰胺鍵彼此連接的肽或多肽。
“支鏈的肽”指其中的一個(gè)或多個(gè)帶有羧基或胺側(cè)鏈的組成氨基酸通過(guò)這些側(cè)鏈與其它肽取代基連接的肽或多肽。
“環(huán)狀肽片段”指本文所定義的肽片段，其中，一個(gè)氨基酸殘基上的取代基與肽片段中另一個(gè)氨基酸殘基上的取代基相連。連接優(yōu)選是在肽片段中的兩個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈之間，優(yōu)選通過(guò)酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接。兩個(gè)氨基酸側(cè)鏈之間的鍵在此指定為 連接環(huán)肽的兩個(gè)氨基酸殘基的酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵在側(cè)鏈功能基之間形成。因此，酰胺鍵在酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈羧基和堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基之間形成；酯鍵在酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈羧基和含羥基氨基酸殘基的側(cè)鏈羥基之間形成；二硫鍵由含有側(cè)鏈巰基的氨基酸殘基形成；羊毛硫氨酸橋通過(guò)將相應(yīng)的二硫化物脫硫形成。
由按照以上描述形成的酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵所產(chǎn)生的橋中的原子數(shù)量將根據(jù)側(cè)鏈的長(zhǎng)度和鍵的類(lèi)型(即酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵)而改變。所述的橋優(yōu)選含有2-12個(gè)原子，更優(yōu)選6-10個(gè)原子。橋中所含原子的最優(yōu)選的數(shù)量為7，該橋優(yōu)選含有Lys和Asp殘基的側(cè)鏈功能基之間的酰胺鍵。
“樹(shù)脂“指用活潑基團(tuán)修飾的固體載體，從而該固體載體可以和本文所定義的氨基酸、肽或環(huán)肽片段的羧基或N-末端偶聯(lián)。代表性的樹(shù)脂包括Merrifield樹(shù)脂(氯甲基化的聚苯乙烯)、羥甲基樹(shù)脂、2-氯三苯甲基氯化物樹(shù)脂、三苯甲基氯化物樹(shù)脂、Rink酸樹(shù)脂(4-芐氧基-2′,4′-二甲氧基二苯基甲醇樹(shù)脂)、三苯甲醇樹(shù)脂、PAM樹(shù)脂(4-羥基甲基-苯基乙酰氨基甲基樹(shù)脂)、Wang樹(shù)脂(對(duì)-芐氧基芐醇樹(shù)脂)、MBHA樹(shù)脂(對(duì)-甲基二苯甲基胺樹(shù)脂)、BHA樹(shù)脂(二苯甲基胺樹(shù)脂)、Rink酰胺樹(shù)脂(4-(2′,4＇-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基樹(shù)脂)和PAL樹(shù)脂(5-(4-Fmoc-氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酸-MBHA樹(shù)脂)。優(yōu)選的樹(shù)脂是氯代三苯甲基樹(shù)脂、Rink酸樹(shù)脂和Rink酰胺樹(shù)脂。
“固體載體”指對(duì)本文所述的反應(yīng)物和反應(yīng)條件呈惰性，并且在所用的溶媒中基本不溶的底物。代表性的固體載體包括無(wú)機(jī)底物如硅藻土、硅膠和可控孔度玻璃；有機(jī)聚合物，包括聚苯乙烯，包括1-2％共聚苯乙烯二乙烯基苯(凝膠形式)和20-40％共聚苯乙烯二乙烯基苯(大孔形式)、聚丙烯、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、纖維素等；復(fù)合無(wú)機(jī)/聚合物組合物如固定在硅藻土顆?；|(zhì)內(nèi)聚丙烯酰胺。參見(jiàn)，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第2版，Pierce Chemical Co.(Chicago,IL,1984)。
此外，“固體載體”還包括固定在第二種惰性載體上的上述固體載體，所述第二種惰性載體是，例如技術(shù)手冊(cè)，MultipinTMSPOC,Chiron Technologies(1995)和其中的參考文獻(xiàn)中所描述的針，所述的針含有基于聚乙烯或聚丙烯的接有氨基功能基化的甲基丙烯酸酯共聚物的可檢測(cè)的頭和惰性的干。
此外，“固體載體”還包括聚合物載體，例如Janda等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，92,6419-6423(1995)和S.Brenner,WO 95/16918中記載的聚乙二醇載體，該載體可溶于多種溶劑，但可以通過(guò)加入導(dǎo)致沉淀的溶劑析出沉淀。
本文使用的天然和非天然氨基酸和其殘基的名稱(chēng)遵循由IUPAC有機(jī)化學(xué)命名委員會(huì)建議的和IUPA-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)在“α-氨基酸命名法(推薦，1974)”生物化學(xué)，14(2),(1975)中提出的命名規(guī)則。鑒于用于本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中的氨基酸和其殘基的命名和縮寫(xiě)不同于所述的那些，不同的名稱(chēng)和縮寫(xiě)將使所述內(nèi)容變得清楚。
如本發(fā)明方法中制備的代表性的肽化合物指例如環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2，相連的氨基酸殘基位于“環(huán)”后面的圓括號(hào)中，取代的天然序列的氨基酸放置在方括號(hào)中。hPTH代表人PTH,PTHrP代表人甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白。第二個(gè)圓括號(hào)中的數(shù)字指從N末端開(kāi)始氨基酸殘基在肽化合物中的數(shù)目(即hPTH的前31個(gè)氨基酸)。
優(yōu)選的實(shí)施方案如反應(yīng)方案1所示，與樹(shù)脂結(jié)合的環(huán)肽的制備涉及將環(huán)狀和無(wú)環(huán)的肽片段與樹(shù)脂、樹(shù)脂結(jié)合的氨基酸或樹(shù)脂結(jié)合的肽偶聯(lián)。
反應(yīng)方案1 是適于肽合成的樹(shù)脂。T是H2N、氨基酸或環(huán)狀或無(wú)環(huán)的肽；E和Q均是或彼此獨(dú)立地是N末端保護(hù)的氨基酸，或N末端保護(hù)的環(huán)狀或無(wú)環(huán)的肽片段。
偶聯(lián)優(yōu)選在肽片段的羧基末端和樹(shù)脂、樹(shù)脂結(jié)合的氨基酸或樹(shù)脂結(jié)合的肽之間完成。當(dāng)肽片段與樹(shù)脂結(jié)合的氨基酸或肽偶聯(lián)時(shí)，偶聯(lián)優(yōu)選通過(guò)環(huán)肽片段的羧基末端和與樹(shù)脂結(jié)合的氨基酸或肽的N末端之間的酰胺鍵來(lái)完成。
為了使偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行，必需將肽片段的羧基活化。有多種活化方法可用于本發(fā)明的實(shí)踐，包括，例如預(yù)形成的對(duì)稱(chēng)酸酐(PSA)、預(yù)形成的混合酸酐(PMA)、酰氯、活潑酯；以及將羧酸就地活化的方法，參見(jiàn)Fields & Noble,1990，“利用9-芴基甲氧羰基氨基酸進(jìn)行固相肽合成”，國(guó)際肽與蛋白質(zhì)研究雜志(Int.J.Pept.Protein Res.),35:161-214。
代表性的活化試劑包括，氯甲酸異丙酯、二異丙基碳二亞胺(DIC)、DIC與1-羥基苯并三唑(HOBT)的混合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、二(2-氧代-3-惡唑烷基)膦酰氯(BOP-Cl)、苯并三唑-1-基氧基-三((二甲氨基)鏻)六氟磷酸鹽(BOP)、苯并三唑-1-基氧基-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、溴代-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸鹽(PyBROP)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、2-[2-氧代-1-(2H)-吡啶基]-1,1,3,3-二亞戊基脲鎓四氟硼酸鹽(TOPPipU)、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、DCC與HOBT的混合物等。用于偶聯(lián)反應(yīng)的適宜溶劑包括二氯甲烷、DMF、DMSO、甲苯、THF等。偶聯(lián)時(shí)間為約1至約48小時(shí)，這取決于待偶聯(lián)的樹(shù)脂和羧酸衍生物、活化試劑、溶劑和溫度。偶聯(lián)在約-10℃至約50℃下進(jìn)行，優(yōu)選在大約室溫下進(jìn)行。
為了防止干擾上述的偶聯(lián)反應(yīng)，將環(huán)肽部分的N末端用對(duì)酸或堿敏感的基團(tuán)保護(hù)。所述保護(hù)基應(yīng)當(dāng)在酰胺鍵形成的條件下是穩(wěn)定的，同時(shí)又很容易被除去而不會(huì)破壞伸長(zhǎng)的肽鏈，或使其中所含的任何手性中心外消旋化。適宜的保護(hù)基是9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、芐氧羰基(Cbz)、二苯基異丙氧羰基、叔戊氧羰基、異冰片基氧羰基、(α,α)二甲基-3,5-二甲氧基芐氧羰基、鄰硝基苯基亞磺?；?、2-氰基-叔丁氧羰基等。優(yōu)選9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)基。
同樣，對(duì)環(huán)肽片段中的活潑側(cè)鏈功能基也需要進(jìn)行保護(hù)。特別優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基是，對(duì)于賴(lài)氨基和精氨酸的側(cè)鏈氨基基團(tuán)為2,2,5,7,8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?pmc)、硝基、對(duì)甲苯磺酰基、4-甲氧基苯基磺酰基、Cbz、Boc、Alloc(烯丙基氧羰基)和金剛烷基氧羰基；對(duì)于酪氨酸芐基、鄰溴芐基氧羰基、2,6-二氯芐基、異丙基、叔丁基(t-Bu)、環(huán)己基、環(huán)戊基和乙?；?Ac)；對(duì)于絲氨酸叔丁基、芐基和四氫吡喃基；對(duì)于組氨酸三苯甲基、芐基、Cbz、對(duì)甲苯磺?；?,4-二硝基苯基；對(duì)于色氨酸甲?；虰oc；對(duì)于天冬酰胺和谷氨酰胺Trt(三苯甲基)；對(duì)于天冬氨酸和谷氨酸O-t-Bu和O-烯丙基和O-芐基。
片段與樹(shù)脂或樹(shù)脂結(jié)合肽的偶聯(lián)優(yōu)選在約室溫下、用約2摩爾當(dāng)量(相對(duì)于樹(shù)脂)Fmoc-保護(hù)的、用約等摩爾量的苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)和羥基苯并三唑水合物活化的環(huán)肽片段在約4當(dāng)量二異丙基乙基胺的存在下在二甲基甲酰胺中于約16-48小時(shí)內(nèi)完成。
必需對(duì)偶聯(lián)的完成程度進(jìn)行評(píng)估。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)于公知的監(jiān)測(cè)試驗(yàn)是熟知的，例如茚三酮(Kaiser試驗(yàn))、苦味酸、2,4,6-三硝基-苯磺酸(TNBS)、熒光胺和氯醌試驗(yàn)，這些試驗(yàn)是基于試劑與游離氨基反應(yīng)生成發(fā)色化合物。如果使用亞氨基酸(例如Pro和Hyp)，優(yōu)選的方法是靛紅監(jiān)測(cè)。Fields & Noble，文獻(xiàn)出處同上。在反應(yīng)過(guò)程中可以對(duì)反應(yīng)的完成程度進(jìn)行定量，參見(jiàn)，例如Salisbury等(國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)文本W(wǎng)O 91/03485)。
對(duì)于Fmoc合成，優(yōu)選Kaiser和TNBS試驗(yàn)。在Kaiser試驗(yàn)中，可以將樹(shù)脂肽樣品用來(lái)自Pierce Chemical的茚三酮試劑按照Sarin等提出的方法(1981，分析生物化學(xué)，117:147-157)進(jìn)行試驗(yàn)。同樣，也可將樹(shù)脂肽樣品用可從Fluka獲得的三硝基苯磺酸(TNBS)按照Takajashi提出的方法(1984，化學(xué)通訊，1:127)進(jìn)行試驗(yàn)。
如果有試驗(yàn)表明偶聯(lián)反應(yīng)未完成，則可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法強(qiáng)行使反應(yīng)結(jié)束，包括，(a)用1-5倍過(guò)量的保護(hù)的氨基酸重復(fù)進(jìn)行偶聯(lián)，(b)用不同的或添加的溶劑(例如三氟乙烷)重復(fù)進(jìn)行偶聯(lián)，或者(c)加入離液序列高的鹽如NaCIO4或LiBr(Klis & Stewart,1990，“肽化學(xué)，結(jié)構(gòu)和生物學(xué)”，Rivier & Marshall編，ESCOM Publ.,p.904-906)。
優(yōu)選的樹(shù)脂結(jié)合環(huán)肽片段具有式Ⅱ的結(jié)構(gòu) 其中 是樹(shù)脂；P是胺保護(hù)基；A不存在或是式 的基團(tuán)；B是式-A23-A24-A25的基團(tuán)；C是式-A26-A27-A28-A29-A30-的基團(tuán)；D是-A31-、-A31-A32-、-A31-A32-A33-或-A31-A32-A33-A34-；其中 是內(nèi)酰胺、酯、二硫化物或羊毛硫氨酸橋；A13、A17、A18和A22是氨基酸殘基；A14是His(Trt)或Ser(tBu)；A15和A28彼此獨(dú)立地是Ile或Leu；Ser(tBu)或Leu；A16是Asn(Trt)或Gln(Trt)；A19是Arg(Pmc)或Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Arg(Pmc)或Val；A23是Phe或TrP(Boc)；A24是Leu；A25是Arg(Pmc)或His(Trt)；A26和A30是氨基酸殘基，其中A26和A30的側(cè)鏈選擇性地通過(guò)酰胺、二硫化物或羊毛硫氨酸鍵結(jié)合；A27是Leu或Lys(Boc)；A29是Ala或Gln(Trt)；A31是Ile或Val；A32是His(Trt)；A33是Asn(Trt)或Thr(tBu)；A34是Ala或Phe。
另一種優(yōu)選的樹(shù)脂結(jié)合環(huán)肽片段具有式Ⅱ的結(jié)構(gòu)，其中， 是內(nèi)酰胺橋，并且A26和A30的側(cè)鏈選擇性地通過(guò)酰胺鍵結(jié)合。
另一種優(yōu)選的樹(shù)脂結(jié)合環(huán)肽具有式Ⅱ的結(jié)構(gòu)，其中， 是內(nèi)酰胺橋；A13和A18是Lys；A17和A22是Asp；A26是Lys(Boc)；A30是Asp(OtBu)；或者A26和A30的側(cè)鏈選擇性地通過(guò)酰胺鍵結(jié)合。
另一種優(yōu)選的樹(shù)脂結(jié)合環(huán)肽片段具有式Ⅲ的結(jié)構(gòu) 其中， 是內(nèi)酰胺橋；A18是Lys；A19是Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Val；A22是Asp；A23是Trp(Boc)；A24是Leu；A25是Arg(Pmc)；A26是Lys(Boc)；A27是Leu；A28是Leu；A29是Gln(Trt)；A30是Asp(OtBu)；A31是Val。
按照以上描述制得的樹(shù)脂結(jié)合肽還可以進(jìn)行進(jìn)一步的加工，例如與一個(gè)或多個(gè)另外的環(huán)肽片段偶聯(lián)、與一個(gè)或多個(gè)肽片段偶聯(lián)、順次加成單個(gè)的氨基酸或以上描述的各種組合。
然后將完成的環(huán)肽從樹(shù)脂上裂解并純化?？梢栽趶臉?shù)脂上裂解之前、之后或同時(shí)除去保護(hù)基?？蓪⑼耆摫Ｗo(hù)的肽通過(guò)以下方法之一或其組合進(jìn)行純化酸-堿提取、重結(jié)晶、冷凍干燥、采用以下類(lèi)型之一或其全部的一系列色譜步驟在乙酸鹽形式的弱堿性樹(shù)脂上進(jìn)行離子交換；在未衍生化的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如AMBERLITEXAD)上進(jìn)行疏水性吸附色譜；硅膠吸附色譜；在羧甲基纖維素上進(jìn)行離子交換色譜；在例如SEPHADEXG-25、LH-20上進(jìn)行分配色譜或進(jìn)行逆流分配；高效液相色譜(HPLC)、特別是在辛基-或十八烷基硅烷基-硅膠結(jié)合相柱填料上進(jìn)行反相HPLC。肽片段的制備所述片段通過(guò)合成肽主鏈進(jìn)行制備，所述肽主鏈?zhǔn)箻?gòu)成片段的氨基酸以其適當(dāng)?shù)捻樞蜓b配。片段的肽主鏈可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法進(jìn)行合成。對(duì)于固相肽合成，多種技術(shù)的綜述可以參見(jiàn)J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，W.H.Freeman Co.(SanFrancisco),1963和J.Meienhofer，激素蛋白和肽，第2卷，46頁(yè)，Academic Press(New York),1973。對(duì)于經(jīng)典的溶液合成，可以參見(jiàn)G.Schroder和K.Lupke，肽，第1卷，Acacemic Press(New York),1965。
正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的，在固體載體上進(jìn)行肽合成通常涉及從羧基或C-末端開(kāi)始構(gòu)建肽，其中，α-氨基被保護(hù)了的C-末端氨基酸與固相聚合物相連。然后裂解掉N-保護(hù)基，將同樣是N-保護(hù)的下一個(gè)氨基酸通過(guò)與連接在上述固體載體上的氨基酸之α-氨基之間的肽鍵偶聯(lián)。重復(fù)前一氨基酸的脫保護(hù)和下一氨基酸的偶聯(lián)的循環(huán)，直至肽完成。將氨基酸的所有活潑側(cè)鏈通過(guò)能夠經(jīng)受得住偶聯(lián)和Nα-脫保護(hù)過(guò)程但可以在合成結(jié)束時(shí)被除去的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。當(dāng)用固相方法制備肽片段時(shí)，通過(guò)從樹(shù)脂上裂解得到用于與其它片段偶聯(lián)的片段。
環(huán)肽片段按照類(lèi)似的方式制備。但是，在主鏈裝配后進(jìn)行(1)將待環(huán)化的側(cè)鏈功能基選擇性地脫保護(hù)，(2)環(huán)化，和(3)選擇性地除去所有剩余的保護(hù)基。
使用Fmoc氨基酸是肽合成的一種策略。Boc(叔丁氧羰基保護(hù)的氨基)策略還可用于制備與固體載體結(jié)合的肽(例如Geysen等，1987，免疫學(xué)方法雜志102:259-274.)。
用于肽合成的氨基酸可以是Merrifield(1963，美國(guó)化學(xué)會(huì)志85:2149-2154)所描述的常規(guī)的Boc(Nα-氨基保護(hù)的Nα-叔丁氧羰基)氨基酸，或是Carpino和Han(1972，有機(jī)化學(xué)雜志37:3403-3409)所描述的對(duì)堿不穩(wěn)定的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc Nα-氨基保護(hù)的氨基酸均可以從Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge Research Biochemical、Bachem或Peninsula Labs或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它化學(xué)品公司得到。此外，本發(fā)明的方法也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它Nα-保護(hù)基。固相肽合成可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法完成(參見(jiàn)Stewart和Young,1984，固相合成，第2版，Pierce Chemical Co.,Rockford,IL；Fields和Noble,1990，國(guó)際肽、蛋白研究雜志，35:161-214)，或用例如ABS所售的自動(dòng)合成儀合成。
盡管C-末端至N-末端肽合成是常規(guī)的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，也可以從N-末端至C-末端來(lái)合成肽片段。內(nèi)酰胺橋的制備內(nèi)酰胺橋接的環(huán)肽片段通過(guò)在以上所述的活化劑的存在下，在酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈羧基和堿性氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基之間形成酰胺鍵制得。優(yōu)選的酸性氨基酸殘基包括Asp、Glu、-NHCH[(CH2)3CO2H]CO-和-NHCH[(CH2)4CO2H]CO-。首選Asp。優(yōu)選的堿性氨基酸殘基包括His、Lys、Orn、-NHCH(CH2NH2)CO-和-NHCH[(CH2)2NH2]CO-，首選Lys。
當(dāng)環(huán)肽片段的肽前體含有一個(gè)以上的酸性或堿性氨基酸殘基時(shí)，應(yīng)對(duì)環(huán)肽片段中其它的酸性或堿性氨基酸的保護(hù)基進(jìn)行選擇，以便使待環(huán)化的氨基酸可以被選擇性地脫保護(hù)。優(yōu)選所需的酸性和堿性氨基酸殘基同時(shí)被脫保護(hù)。此外，除了對(duì)用于脫保護(hù)選定的堿性和酸性氨基酸殘基所用的試劑穩(wěn)定外，其余氨基酸殘基上的保護(hù)基還應(yīng)對(duì)所用的環(huán)化條件是穩(wěn)定的。
當(dāng)用于指?jìng)?cè)鏈保護(hù)基時(shí)，術(shù)語(yǔ)“正交性”指如本文所述的在分子上具有兩種或多種類(lèi)型保護(hù)基，每一種在特定的條件下被最佳地除去，而同時(shí)對(duì)用來(lái)除去其它類(lèi)型保護(hù)基的條件保持穩(wěn)定的情況。因此，可除去一種類(lèi)型的所有保護(hù)基，而保持所有其它保護(hù)基的完整性。
優(yōu)選的具有所需正交性的保護(hù)基為對(duì)于待環(huán)化的酸性氨基酸殘基烯丙基；對(duì)于待環(huán)化的堿性氨基酸殘基烯丙基氧羰基(alloc)；對(duì)于任何其它酸性氨基酸殘基叔丁基(tBu)；對(duì)于任何其它堿性氨基酸殘基叔丁基氧羰基(Boc)。
在用固相或液相技術(shù)合成了環(huán)肽片段的肽主鏈后，通過(guò)用鈀，優(yōu)選四(三苯基膦)鈀(0)在N-甲基苯胺的存在下處理，同時(shí)除去烯丙基和烯丙氧羰基保護(hù)基。接著如本文對(duì)酰胺鍵形成所描述的完成酰胺橋的形成。
用于制備本發(fā)明的樹(shù)脂結(jié)合環(huán)肽的優(yōu)選的環(huán)肽片段具有式ⅩⅤ、ⅩⅥ或ⅩⅦ的結(jié)構(gòu)， 其中 是內(nèi)酰胺、二硫化物或羊毛硫氨酸橋；P是胺保護(hù)基；A13、A17、A18、A22、A26和A30是氨基酸殘基；A14是His(Trt)或Ser(tBu)；A15是Ser(tBu)或Leu；A16是Asn(Trt)或Gln(Trt)；A19是Arg(Pmc)或Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Arg(Pmc)或Val；A27是Leu或Lys(Boc)；A28是Ile或Leu；A29是Ala或Gln(Trt)。
更優(yōu)選的環(huán)肽片段具有式Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ的結(jié)構(gòu)，其中 是內(nèi)酰胺橋；P是Fmoc；
A13、A18和A26是Lys；A17、A22和A30是Asp；A14是His(Trt)或Ser(tBu)；A15是Ser(tBu)或Leu；A16是Asn(Trt)或Gln(Trt)；A19是Arg(Pmc)或Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Arg(Pmc)或Val；A27是Leu或Lys(Boc)；A28是Ile或Leu；A29是Ala或Gln(Trt)。
用于制備本發(fā)明的樹(shù)脂結(jié)合環(huán)肽的仍更優(yōu)選的環(huán)肽片段是Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH。
適于用本發(fā)明的方法制備的環(huán)狀肽甲狀旁腺激素類(lèi)似物和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白類(lèi)似物公開(kāi)于1．Condon等，U.S.系列號(hào)60/046,472(1997年5月14日申請(qǐng))；2．Willick等，U.S.專(zhuān)利號(hào)5,556,940(1997年9月17日)；3．Chorev等，U.S專(zhuān)利號(hào)5,717,062(1998年2月10日)；4．Vickery等，WO 96/40775(1996年12月19日公開(kāi))。
適于用本發(fā)明的方法制備的優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)X-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30-A31-Y1其中X選自(a)R1a-A1-A2-A3-A4-A5-A6-,(b)R1b-A2-A3-A4-A5-A6-,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-,(d)R1b-A4-A5-A6-,(e)R1b-A5-A6-,(f)R1b-A6-和(g)R1b-，其中R1a選自(1)H,(2)由1-6個(gè)氨基酸組成的肽，(3)烷基，(4)苯基烷基，(5)-COR2，其中R2選自烷基、鏈烯基、鏈炔基、苯基、萘基和苯基烷基，R1b選自(1)H,(2)烷基，(3)苯基烷基和(4)-COR2，其中R2選自烷基、鏈烯基、鏈炔基、苯基、萘基和苯基烷基，A1選自Ser和Ala或其等同的氨基酸殘基，A2、A3、A4和A6是氨基酸殘基，A5選自Ile和His或其等同的氨基酸殘基；A7、A9、A11和A12是氨基酸殘基；A8是Leu或Nle或其等同的氨基酸殘基；A10是Asp或Asn或其等同的氨基酸殘基；A13和A17是氨基酸殘基，其中A13和A17的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接；
A14是His或Ser或其等同的氨基酸殘基；A15和A28彼此獨(dú)立地是Ile或Leu或其等同的氨基酸殘基；A16是Asn或Gln或其等同的氨基酸殘基；A18和A22是氨基酸殘基，其中A18和A22的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接；A19是Arg或Glu或其等同的氨基酸殘基；A20是Arg或其等同的氨基酸殘基；A21是Arg或Val或其等同的氨基酸殘基；A23是Phe或Trp或其等同的氨基酸殘基；A24是Leu或其等同的氨基酸殘基；A25是Arg或His或其等同的氨基酸殘基；A26和A30是氨基酸殘基，其中A26和A30的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接；A27是Leu或Lys或其等同的氨基酸殘基；A29是Ala或Gln或其等同的氨基酸殘基；A31是Ile或Val或其等同的氨基酸殘基；Y選自(a)R3,(b)A32-R3,(c)-A32-A33-R3和(d)-A32-A33-A34-R3-，其中R3是-OH或-NR4R5，其中R4和R5彼此獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基，A32是His或其等同的氨基酸殘基，A33是Asn或Thr或其等同的氨基酸殘基，A34是Ala或Phe或其等同的氨基酸殘基。
式Ⅰ的肽具有有用的藥物特性。它們特別適用于治療能夠通過(guò)可與甲狀旁腺激素受體結(jié)合的伴隨或不伴隨刺激cAMP酶活性的化合物來(lái)調(diào)節(jié)的疾病。參見(jiàn)U.S.系列號(hào)60/046,472。
適于用本發(fā)明方法制備的代表性的優(yōu)選環(huán)肽包括但不僅限于，環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.2,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.3,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.4,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.5,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.6,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.7,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.10,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.11,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.12,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.13,Nle8,Lys18Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.14,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.15,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.16,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys13-Asp17,Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp17.22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-34)NH2二環(huán)(Lys13-Asp17,Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp17.22,Leu27]hPTH(1-34)NH2二環(huán)(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-34)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Lys18,Asp22]hPTHrP(1-34)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Lys18,26,30,Asp22,Leu23,28,31,Glu25,29]hPTHrP(1-34)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(7-34)NH2環(huán)(Lys18-Asp22[Lys18,Asp22]hPTHrP(7-34)NH2二環(huán)(Lys13,Asp17,Lys18-Asp22)[Nle8.Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(7-34)NH2，和二環(huán)(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(7-34)NH2.
適于用本發(fā)明方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中的氨基酸殘基是在α-碳上具有L立體化學(xué)的α-氨基酸殘基。
適于用本發(fā)明方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中的X選自(a)R1a-A1-A2-A3-A4-A5-A6-，其中R1a是H或Pro,A1是Ser或Ala,A2是Val,A3是Ser,A4是Glu,A5是Ile或His,A6是Gln,(b)R1b-A2-A3-A4-A5-A6-，其中A2、A3、A4、A5和A6如上所定義，R1b是H,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-，其中R1b、A3、A4、A5和A6如上所定義，(d)R1b-A4-A5-A6-，其中R1b、A4、A5和A6如上所定義，(e)R1b-A5-A6-，其中R1h、A5和A6如上所定義，(f)R1b-A6-，其中R1b和A6如上所定義，(g)R1b-，其中R1b如上所定義，A7是Leu；A8是Leu或Nle；A9是His；A10是Asp或Asn；A11是Leu；A12是Gly；A13、A17、A18、A22和A30彼此獨(dú)立地選自Ser、Thr、Lys、Cys、同型-Cys、Orn、Asp、Glu、-NHCH(CH2NH2)CO-、-NHCH[(CH2)2NH2]CO-、-NHCH[(CH2)3]CO2H]CO-和-NHCH[(CH2)4CO2H]CO-；A14是His或Ser；A15是Ser或Leu；A16是Asn或Gln；A19是Arg或Glu；A20是Arg；A21是Arg或Val；A23是Phe或Trp；A24是Leu；A25是Arg或His；A26是His或彼此獨(dú)立地選自Ser、Thr、Lys、Cys、同型-Cys、Orn、Asp、Glu、-NHCH(CH2NH2)CO-、-NHCH[(CH2)2NH2]CO-、-NHCH[(CH2)3]CO2H]CO-和-NHCH[(CH2)4CO2H]CO-；A27是Leu或Lys；A28是Ile或Leu；A29是Ala或Gln；A31是Ile或Val；Y選自(a)-R3，其中R3是-OH或-NR4R5，其中R4和R5彼此獨(dú)立地選自氫和1-4個(gè)碳原子的烷基，(b)-A32-R3，其中R3如上所定義，A32是His,(c)-A32-A33-R3，其中R3和A32如上所定義，A33是Asn或Thr和(d)-A32-A33-A34，其中A34是Ala或Phe。
適于用本發(fā)明方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中(ⅰ)A18和A22的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接，(ⅱ)A13和A17的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接，并且A18和A22的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接，(ⅲ)A18和A22的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接，并且A26和A30的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接，或(ⅳ)A13和A17的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接，A18和A22的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接，并且A26和A30的側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵連接。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中A13選自Lys和Ala,A17選自Ser和Asp,A18是Lys,A22是Asp,A26是Lys,A30是Asp。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中X是R1a-A1-A2-A3-A4-A5-A6-。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中A1是Ala,A8是Nle,A27是Leu。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中R1a是H,Y是NH2。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中R1a是H,Y是-A32-A33-A34-NH2。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中X選自(a)R1b-A2-A3-A4-A5-A6-,(b)R1b-A3-A4-A5-A6-,(c)R1b-A4-A5-A6-,(d)R1b-A5-A6-,(e)R1b-A6-和(f)R1b-。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中A8是Nle,A27是Leu。
適于用本發(fā)明的方法制備的另一種優(yōu)選的環(huán)肽具有式Ⅰ的結(jié)構(gòu)，其中X是H,Y是-A32-A33-A34-NH2。
適于用本發(fā)明的方法制備的更優(yōu)選的環(huán)肽選自環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.2,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.3,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.4,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.5,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.6,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.7,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.10,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.11,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.12,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.13,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.14,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.15,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1.16,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys13-Asp17,Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp17.22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2
適于用本發(fā)明方法制備的仍更優(yōu)選的環(huán)肽選自環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys13-Asp17,Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp17.22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二環(huán)(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2適于用本發(fā)明方法制備的仍更優(yōu)選的環(huán)肽是環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2。
參照以下實(shí)施例可以更好地理解以上的描述，給出這些實(shí)施例是為了說(shuō)明，而并非想要限定本發(fā)明的范圍。
用7.89g(18.9mmole)Fmoc-Asp(O-烯丙基)-OH、82g(39.9mmole)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)和10.2g(78.8mmole)二異丙基乙基胺在150mL二氯甲烷中完成Fmoc-Asp(O-烯丙基)-OH與15g 1.05毫當(dāng)量/g填充量(共15.75mmole)的1％交聯(lián)氯代三苯甲基樹(shù)脂的偶聯(lián)。將混合物振搖，然后潷干并將樹(shù)脂用每份150mL的二氯甲烷/甲醇/二異丙基乙基胺(17∶2∶1)洗滌3次，然后用每份150mL的二氯甲烷洗滌3次。將樹(shù)脂的樣品進(jìn)行TNBS試驗(yàn)，試驗(yàn)呈陰性。將Fmoc-保護(hù)的樹(shù)脂結(jié)合的氨基酸用150mL 5％哌啶在二氯甲烷-二甲基甲酰胺(1∶1)中的溶液處理10分鐘，然后用150mL20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液處理30分鐘，除去N-末端9-芴基甲氧羰基。將樹(shù)脂結(jié)合的氨基酸按照以上描述進(jìn)行洗滌。將Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH(在該步驟后取出10％)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Lys(ε-Alloc)-OH分別按照相同的方式偶聯(lián)，并采用相同的操作順序，但在TNBS試驗(yàn)之前用3至5次的二甲基甲酰胺洗滌代替3次的二氯甲烷洗滌。無(wú)需重復(fù)偶聯(lián)。將最終的樹(shù)脂結(jié)合肽用150mL四氫呋喃和150mL乙醚洗滌，然后真空干燥得到27.23g。b．Lys18和Asp22的烯丙基和Alloc的脫除Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基樹(shù)脂的合成。
將10g以上制得的Fmoc-(Lys-Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)樹(shù)脂用100mL二甲亞砜/二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1∶1∶0.2v/v/v)振搖20分鐘使其溶脹，然后將樹(shù)脂小心地潷干。加入2.9g四(三苯膦)鈀(0)在240mL二甲亞砜/二甲基甲酰胺(1∶1,v∶v)中的溶液，然后加入60mL二氯甲烷和16.2g(150mmole)N-甲基苯胺，然后將混合物振搖2小時(shí)。將樹(shù)脂潷干并用每份100mL的二氯甲烷洗滌3次。將樹(shù)脂用100mL二甲亞砜/二甲基甲酰胺(1∶1v∶v)溶脹，然后小心地潷干并直接用于Lys18-Asp23環(huán)化。c．Lys18-Asp22內(nèi)酰胺橋的形成Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基樹(shù)脂的合成。
將以上實(shí)施例的樹(shù)脂肽用5.2g(10mmole)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)和2.6g(20mmole)二異丙基乙基胺在100mL二甲亞砜/二甲基甲酰胺(1∶1v∶v)中處理，然后將混合物振搖4小時(shí)。將樹(shù)脂潷干并用每份100mL的二甲基甲酰胺洗滌3次，然后取出一部分潷干的樹(shù)脂進(jìn)行TNBS試驗(yàn)(陰性)。將樹(shù)脂用四氫呋喃和乙醚各100mL洗滌，然后真空干燥。d．Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp的樹(shù)脂裂解和產(chǎn)物分離。
將以上Lys18-Asp22內(nèi)酰胺橋形成實(shí)施例中制得的樹(shù)脂肽在振搖器中用130mL乙酸/二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇(1∶8∶1)處理20分鐘。將液體部分與樹(shù)脂分離，并用500mL甲基叔丁基醚和100mL乙醚處理，然后將混合物離心。除去上清液，向殘余物中加入乙醚，然后離心。除去上清液并將殘余物干燥過(guò)夜得到2.77g黃色固體(MS:1172；41％化學(xué)計(jì)量學(xué)收率，粗品)。將其通過(guò)快速色譜純化(85∶15至60∶40二氯甲烷∶甲醇)得到1g Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH(15％收率，以樹(shù)脂計(jì))，純度為85A％。方法B在溶液中合成a．順序裝配BOC-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成室溫下，向3L的三頸燒瓶中加入1,1-二甲基乙氧羰基-(L)-天冬氨酸芐酯(50g,154.5mmol)、二氯甲烷(96mL)、烯丙醇(9.438,162.3mmol)和4-N,N-二甲氨基吡啶(10mg)。將反應(yīng)混合物冷卻至8℃，然后在8-11℃下于1.5小時(shí)內(nèi)加入二環(huán)己基碳二亞胺(32g,154.5mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液。加入二環(huán)己基碳二亞胺溶液的同時(shí)，析出二環(huán)己基脲的沉淀。將反應(yīng)混合物于11-12℃攪拌2小時(shí)，此時(shí)HPLC顯示原料消失。濾出二環(huán)己基脲并將濾液濃縮。將油狀殘余物加入甲基叔丁基醚(250mL)中，然后將溶液過(guò)濾除去殘余的二環(huán)己基脲，用30mL 0.2N鹽酸、30mL水、20mL飽和碳酸氫鈉水性溶液、30mL水和2×50mL鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，過(guò)濾然后濃縮得到55.88g油狀的BOC-(L)AsP(O-烯丙基)-OBzl。(M計(jì)算值363.4；M+1實(shí)測(cè)值364)。HCl-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成在裝有機(jī)械攪拌器的3L三頸燒瓶中，將BOC-Asp(O-烯丙基)-OBzl(110.5g,302.7mmol)的500mL乙酸乙酯溶液冷卻至5℃，并向反應(yīng)混合物中通入氯化氫氣體2.5小時(shí)，在此期間內(nèi)反應(yīng)溫度達(dá)到約22℃。HPLC顯示無(wú)原料存在。向溶液中通入氮?dú)膺^(guò)夜，形成白色沉淀，過(guò)濾收集沉淀并用100mL乙酸乙酯洗滌。將殘余物真空干燥得到84g白色結(jié)晶固體狀(顯微鏡觀察)HCl.Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計(jì)算值263；M+1實(shí)測(cè)值264)。BOC-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成向BOC-Val-OH(25.4g,116.7mmol)的乙酸乙酯(85mL)溶液中加入羥基苯并三唑水合物(16.55g,122.5mmol)的二甲基甲酰胺(122.3mL)溶液。將混合物冷卻至5℃，然后在1小時(shí)內(nèi)加入二環(huán)己基碳二亞胺(25.2g,122.5mmol)的乙酸乙酯(58.7mL)溶液，在此期間內(nèi)，溫度升至約18℃并有二環(huán)己基脲沉淀生成。停止冷卻并將混合物攪拌2小時(shí)，然后在25分鐘內(nèi)加入HCl-H2N-Asp(OAll)-OBzl(35g,116.7mmol)的189mL二甲基甲酰胺溶液。在0.5小時(shí)內(nèi)緩慢加入N-甲基嗎啉(12.8mL)使反應(yīng)混合物的pH達(dá)到7，然后將混合物室溫?cái)嚢?6小時(shí)。將反應(yīng)混合物過(guò)濾除去二環(huán)己基脲，將濾液用甲基叔丁基醚稀釋?zhuān)瑪嚢?小時(shí)然后過(guò)濾。將濾液用100mL水、100mL 0.5M檸檬酸水溶液、100mL水、100mL飽和碳酸氫鈉水溶液、100mL鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，過(guò)濾然后濃縮得到41.3g油狀的BOC-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計(jì)算值462；M+1實(shí)測(cè)值463)。HCl.Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成向2-4℃的BOC-Val-Asp(OAll)-OBzl(31.7g,68.5mmol)的乙酸乙酯(300mL)溶液中通入氯化氫氣體2小時(shí)。停止冷卻并將混合物攪拌48小時(shí)。向溶液中劇烈地通入氮?dú)?小時(shí)。將反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得到38.3g白色固體，將其用乙酸乙酯結(jié)晶得到24.2g HCl.Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計(jì)算值362M+1實(shí)測(cè)值363)。FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成在裝有機(jī)械攪拌器的3L三頸燒瓶中加入17.25g(26mmol)FMOC-Arg(PMC)和300mL乙腈，然后將混合物室溫?cái)嚢柚敝列纬赏该鞯娜芤骸＜尤氡讲⑷蚧趸?三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)，將溶液冷卻至2℃，加入2.6g(26mmol)N-甲基嗎啉，形成白色的焦油。緩慢加入二甲基甲酰胺(52mL)直至焦油溶解，然后將混合物于3℃攪拌30分鐘。在2-3℃下于20分鐘內(nèi)加入HCl.Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(10.4g,26mmol)的39mL二甲基甲酰胺溶液，然后加入N-甲基嗎啉(7.5mL)達(dá)到pH7。停止冷卻，將混合物攪拌2.5小時(shí)。然后將混合物用250mL水和250mL乙酸乙酯稀釋。分出乙酸乙酯層，用水(2×100mL)和鹽水(2×100mL)洗滌然后濃縮得到白色固體，將其用175mL乙酸乙酯結(jié)晶，得到18.5g FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(95A％)。將乙酸乙酯濾液濃縮并將膠狀殘余物用乙酸乙酯研制另外得到3.12g產(chǎn)物。(M計(jì)算值1007；M+1實(shí)測(cè)值1008)。Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成室溫下，向FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(16g,15.9mmol)的二氯甲烷(267mL)溶液中加入哌啶(23g,27mmol,26.7mL)。將反應(yīng)液攪拌2.5小時(shí)然后用水(2×60mL)和鹽水(2×60mL)洗滌，干燥(硫酸鎂)，過(guò)濾然后濃縮得到半固體。將所述半固體加入400mL乙酸乙酯中，將溶液攪拌3天然后過(guò)濾。將濾液用水洗滌(2×60mL)，干燥(硫酸鎂)，過(guò)濾然后濃縮得到23.5g含有哌啶-亞甲基茚加合物雜質(zhì)的產(chǎn)物(MS分析)。將固體溶于400mL乙酸乙酯，過(guò)濾，用水洗滌(2×60mL)，干燥(硫酸鎂)然后濃縮得到固體，將其真空干燥過(guò)夜得到12.55g白色固體狀A(yù)rg(PMC)-Val-Asp(OAll)-OBzl。(M計(jì)算值784M+1實(shí)測(cè)值785)。FMOC-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成2℃下，向FMOC-Glu(tBu)(6.73g,15.8mmol)和苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP,8.18g,15.8mmol)的105mL乙腈溶液中加入N-甲基嗎啉(1.58g,15.8mmol)并將反應(yīng)混合物于2-4℃攪拌30分鐘。在2℃下于20分鐘內(nèi)加入L)Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(12.4g,15.8mmole)的70mL乙腈溶液。然后加入N-甲基嗎啉達(dá)到pH7。停止冷卻，使混合物升溫至室溫，然后繼續(xù)攪拌共3小時(shí)。將乳狀的反應(yīng)混合物過(guò)濾(慢)并將白色殘余物在濾紙上干燥過(guò)夜得到10.8g FMOC-Glu(OBut)-Arg(PMC)-Val-Asp(烯丙基)-OBzl。將濾液濃縮得到膠狀物，將其加入30mL乙腈中并放置48小時(shí)，另外得到3.45g產(chǎn)物。FMOC-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的總收率為14.3g。(M計(jì)算值1192；M+1實(shí)測(cè)值1192.4)。Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成室溫下，向FMOC-Glu(OBut)-Arg(PMC)-Val-Asp(OAll)-OBzl(12.3g,10.3mmol)的105mL二氯甲烷溶液中加入哌啶(3.5g,41.3mmol)。將混合物攪拌2小時(shí)，然后用庚烷稀釋?zhuān)瑵饪s至一半的體積，然后在冰箱中放置過(guò)夜。從油狀殘余物中潷析出液體，然后將殘余物加入二氯甲烷中。將溶液用0.5M檸檬酸水溶液、水和鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)，過(guò)濾然后濃縮。將粗品固體用庚烷研制兩次然后過(guò)濾得到9.0g白色粉末狀Glu(OtBu)-(L)Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計(jì)算值970.2；M+1實(shí)測(cè)值971)。FMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成。
5℃下，將FMOC-Lys(Alloc)(4.2g,9.3mmol)和苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP,4.8g,9.3mmol)在69mL乙腈中的懸浮液用N-甲基嗎啉(0.94g,9.3mmol)處理，然后將形成的溶液于5℃攪拌30分鐘。加入Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(烯丙基)-OBzl(9g,9.3mmole)在52mL乙腈中的懸浮液，使反應(yīng)混合物變成白色混濁液。加入N-甲基嗎啉直至反應(yīng)混合物達(dá)到pH7，然后將反應(yīng)混合物升溫至室溫并攪拌1.33小時(shí)。將混合物過(guò)濾并將固體殘余物用乙腈洗滌(2×40mL)，然后在氮?dú)饬飨抡婵崭稍镞^(guò)夜得到12.8g灰白色硬的固體，將其用200mL甲基叔丁基醚研制，過(guò)濾收集并真空干燥得到9.7gFMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M計(jì)算值1404.7；M+1實(shí)測(cè)值1406)。b．從Lys18和Asp22上脫除Alloc和烯丙基FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl的合成。
室溫下，向裝有機(jī)械攪拌器并通氮?dú)饬鞯?L三頸燒瓶中加入167mL二氯甲烷和1.37g(1.18mmol,0.2當(dāng)量)Pd(PPh3)4。向橙色的溶液中通入氮?dú)?分鐘，然后加入8.3g(5.91mmol,1.0當(dāng)量)FMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的66.4mL二甲基甲酰胺溶液，然后加入13.3g,(124mmol,21當(dāng)量)甲基苯胺。將溶液室溫?cái)嚢?小時(shí)。將混合物用700mL甲基叔丁基醚稀釋導(dǎo)致固體形成。將懸浮液攪拌1小時(shí)然后過(guò)濾。將固體殘余物用200mL甲基叔丁基醚研制，過(guò)濾然后干燥得到5.0淺黃色固體。由濾液得到1.1g淺黃色固體狀的第二批產(chǎn)物，總收率6.1g FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl。(M計(jì)算值1280.6；M+1實(shí)測(cè)值1281)。c．Lys18-Asp22內(nèi)酰胺橋的形成FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl的合成。
室溫及氮?dú)夥障拢瑢?.0g(4.69mmol)FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl在1L三頸燒瓶中溶于300mL二甲基甲酰胺，然后加入3.44g(6.61mmol,1.41當(dāng)量)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)、0.89g(6.57mmol,1.40當(dāng)量)羥基苯并三唑水合物和1.73g(13.4mmol；2.85當(dāng)量)二異丙基乙基胺。將橙色溶液室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后用300mL水稀釋形成油狀殘余物。潷析出混濁的液體(主要含雜質(zhì))。將油狀殘余物在100mL水中攪拌過(guò)夜，過(guò)濾收集形成的硬的固體，得到4.2g淺黃色固體。由濾液得到1.0g黃色固體狀第二批產(chǎn)物，總收率5.2g FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl。(M計(jì)算值1262M+1實(shí)測(cè)值1262.5)。d．芐酯的脫除FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH的合成。
將5.9g(4.7mmol)FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OBzl的25mL二甲基甲酰胺溶液用5.9g木炭處理并過(guò)濾，然后用0.59g 10％Pd/C處理并在Parr裝置中置于50psig氫氣下。1.5小時(shí)后，將混合物過(guò)濾，再次用木炭處理，過(guò)濾，再次加入0.59g 10％ Pd/C并和置于50psig氫氣下2小時(shí)。將混合物過(guò)濾并將濾液用50mL水稀釋?zhuān)?×200mL二氯甲烷萃取。將合并的二氯甲烷萃取液濃縮得到1.2g油狀的FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH。(M計(jì)算值1171；M+1實(shí)測(cè)值1172.3)。3．純化將400mg FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH樣品溶于10mL 1∶1三氟乙醇/異丙醇。將樣品分成兩個(gè)5mL栓注射到用55％B(A=0.1％vl/vl三氟乙酸水溶液；B=v/v75％乙腈/25％異丙醇+0.1％三氟乙酸)平衡的制備HPLC柱(Microsorb MV C18.300Ang,8u,41.4×250mm)上。將填料以70mL/分鐘的流速洗脫，洗脫梯度為在30分鐘內(nèi)從55％B至65％B，在1分鐘內(nèi)從65％B至95％B，然后用95％B進(jìn)行恒溶劑成分柱洗脫10分鐘。用UV在210nM監(jiān)測(cè)流出液。收集純度為93.5A％或更高的餾份，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮。將殘余物冷凍干燥得到200mg FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OH(M計(jì)算值1171:M+1實(shí)測(cè)值1172.6)。步驟3 將FMOC-[Trp23(BOC),Arg25(PMC),Lys26(BOC),Leu27,Gln29(Trt)]HPTH(23-31)-氯代三苯甲基樹(shù)脂(1g,0.185mmole)在10mL二甲基甲酰胺中振搖30分鐘進(jìn)行溶脹，然后潷干，用10mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺(v/v)處理并振搖30分鐘。將樹(shù)脂潷干并用3×20mL二甲基甲酰胺洗滌。加入240mg(0.205mmole,1.1當(dāng)量)FMOC-環(huán)(Lys18-Asp22)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH、312mg(0.6mmole,3當(dāng)量)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)和156mg(1.2mmole,6當(dāng)量)二異丙基乙基胺的10mL二甲基甲酰胺溶液，并將混合物攪拌16小時(shí)。將樹(shù)脂潷干并用3×20mL二甲基甲酰胺洗滌(TNBS陽(yáng)性)，再次用FMOC-環(huán)(Lys18-Asp22)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH/PyBOP/iPr2NEt處理16小時(shí)，然后將樹(shù)脂潷干并用3×10mL二甲基甲酰胺洗滌(TNBS陰性)。按照方法A步驟2中的描述用試劑K將一部分標(biāo)題肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，得到側(cè)鏈脫保護(hù)了的肽片段。(LC-MS:M計(jì)算值2001；M實(shí)測(cè)值2000.5)。剩余的物質(zhì)用于步驟4。步驟4 所需的樹(shù)脂結(jié)合肽通過(guò)將1.38g(0.244mmole，以Trp23的滴度計(jì))步驟3的樹(shù)脂結(jié)合肽按照步驟1除去Fmoc保護(hù)基，然后按照步驟1順次進(jìn)行FMOC脫除和用各0.5亳摩爾的FMOC-Ser(OtBu)-OH、FMOC-Asn(Trt)-OH、FMOC-Leu-OH、FMOC-His(Trt)-OH和FMOC-Lys(BOC)-OH偶聯(lián)的循環(huán)，在每次偶聯(lián)時(shí)使用190mg(0.5mmole)O-苯并三唑-1-基-N,N,N＇,N＇-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和2mmole N-甲基嗎啉的25mL二甲基甲酰胺溶液。偶聯(lián)在室溫下進(jìn)行約1小時(shí)。將最終的樹(shù)脂肽用每份25mL的二甲基甲酰胺、四氫呋喃和乙醚洗滌，然后真空干燥(1.93g)。將一部分標(biāo)題肽按照以下描述從樹(shù)脂上裂解(試劑K)得到側(cè)鏈脫保護(hù)了的肽片段(LC-MS:M計(jì)算值2579.4；M實(shí)測(cè)值2580.7)，純度52A％。步驟5Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OHFMOC-[Ala1,Ser3(OtBu),Glu4(OtBu),Gln6(Trt),His9(Trt),Asn10(Trt)Nle8]hPTH(1-12)標(biāo)題肽通過(guò)將2.65g(5mmole)Fmoc-Leu-OH與5g(3mmole)1％交聯(lián)的0.6毫當(dāng)量/g的Gly-2-氯代三苯甲基樹(shù)脂用3.9g(7.5mmole)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)、1.94g(15mmole)二異丙基乙基胺在50mL二甲基甲酰胺/四氫呋喃(v/v)中振搖0.5小時(shí)偶聯(lián)制得。將樹(shù)脂潷干，然后用二甲基甲酰胺/四氫呋喃洗滌5次并用甲醇洗滌1次(茚三酮陰性)。將樹(shù)脂用二甲基甲酰胺洗滌一次，然后用60mL20％哌啶/二甲基甲酰胺處理2次，每次15分鐘，在各次處理之間用3×60mL二甲基甲酰胺和1×60mL甲醇處理。在第二次處理后，茚三酮呈強(qiáng)陽(yáng)性。重復(fù)該循環(huán)，每次循環(huán)采用單次的0.5小時(shí)哌啶二甲基甲酰胺處理，并使用各2.5摩爾當(dāng)量的FMOC-Asn(Trt)、FMOC-His(Trt)、FMOC-Nle、FMOC-Leu、FMOC-Gln(Trt)、FMOC-Ile、FMOC、Glu(OtBu)、FMOC-Ser(OtBu)、FMOC-Val和FMOC-Ala以及各2.5摩爾當(dāng)量的PyBOP和二異丙基乙基胺。通過(guò)與100mL乙酸/三氟乙烯/和二氯甲烷(1∶1∶8)一起振搖1小時(shí)將樹(shù)脂裂解。從樹(shù)脂中潷析出液體，然后將樹(shù)脂用200mL二氯甲烷洗滌；然后將洗滌液與液體的主要部分合并。將其依次從己烷、乙酸乙酯和異丙醇中蒸發(fā)。將殘余物用乙醚研制，然后干燥(真空，過(guò)夜)得到2.24g標(biāo)題肽(HPLC:83A％純度)。將樹(shù)脂再次在裂解條件下處理，將液體按照第一次裂解后的方式處理，最后得到2.75g第二批的標(biāo)題肽(HPLC:00A％純度)，總收率為4.95g(2.1mmole,70％收率，以樹(shù)脂計(jì))。[LC-MS(M計(jì)算值1514.8；M實(shí)測(cè)值1514.7]。該物質(zhì)直接用于步驟6。步驟6 將步驟5制得的肽(900mg,0.114mmole)在振搖下在15mL二甲基甲酰胺中溶脹40分鐘，然后將樹(shù)脂潷干并用15mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺(v/v)處理45分鐘。將樹(shù)脂潷干并用3×30mL二甲基甲酰胺處理(樹(shù)脂TNBS試驗(yàn)陽(yáng)性)。向其中加入15mL二甲基甲酰胺、775mg(0.33mmole，以23位的滴度計(jì)，為2.7摩爾當(dāng)量)FMOC-[Ala1,Ser3(OtBu),Glu4(OtBu),Gln6(Trt),His9(Trt),Asn10(Trt)Nle8]hPTH(1-12)(由步驟4制得)、151mg(0.29mmole,0.2摩爾當(dāng)量)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸鹽(PyBOP)、39mg(0.25摩爾)羥基苯并三唑水合物和75mg(0.58mmole)二異丙基乙基胺，然后將混合物振搖3天。將樹(shù)脂潷干，用3×30mL二甲基甲酰胺洗滌(TNBS，弱陽(yáng)性和陰性小珠的混合物)，然后用15mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺(v/v)處理，潷干，用每份15mL的二甲基甲酰胺、四氫呋喃和乙醚各洗滌3次，然后干燥并按照步驟7從樹(shù)脂上脫保護(hù)、裂解。步驟7 將步驟6制得的樹(shù)脂按照方法A步驟1的描述處理以除去Ala1上的FMOC，然后在33/2/2/1/2三氟乙酸、苯酚、茴香硫醚、乙二硫醇和水的混合物(試劑K，總稀釋度10mL/g樹(shù)脂-肽)中同時(shí)進(jìn)行裂解和脫保護(hù)3小時(shí)。將樹(shù)脂潷干，將反應(yīng)混合物加入到冷的叔丁基甲基醚(50mL/g樹(shù)脂-肽)中使產(chǎn)物從濾液中沉淀出來(lái)。將混合物放置15分鐘，然后離心(2000rpm,5分鐘)。潷析出液體，將剩余的固體用乙醚洗滌，通過(guò)離心分離混合物的上清液并將上清液除去。將得到的固體在0.1％三氟乙酸水溶液(6mL/g樹(shù)脂肽)中攪拌1小時(shí)，以確保完全除去對(duì)酸敏感的基團(tuán)。將溶液冷凍干燥得到414mg白色固體狀標(biāo)題肽(37A％純度，26.3％純度(wt/wt)，以Trp23計(jì)，26.3％收率)。(LC-MS:M計(jì)算值3632.0；M+1實(shí)測(cè)值3633.4)。步驟8純化將1g以上制得的物質(zhì)溶于10mL水并將該溶液注射到2＂×25cm預(yù)先用75/5/20 0.1％三氟乙酸水溶液(A)/0.1％三氟乙酸的乙腈溶液(B)/異丙醇(C)平衡的制備HPLC(10微米，120A或300A)上。將柱子以115mL每分鐘，以在30分鐘內(nèi)從75A/5B/20C到60A/20B/20C的梯度洗脫，然后用30％A,60％B,20％C沖洗并再次用75A/5B/20C平衡。用UV在280nm檢測(cè)流出液。將含有大約75面積百分比純度的標(biāo)題肽的餾份合并，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(約35℃)濃縮。將濃縮的含水溶液泵到相同的制備柱上并再次用相同的30分鐘梯度洗脫。將含有90A％或更高的面積百分比純度標(biāo)題肽的餾份合并，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(約35℃)濃縮。然后將濃縮的溶液泵到預(yù)先用75％ 0.1M乙酸銨水溶液(用乙酸調(diào)至pH6)(D)/15％乙腈(E)/10％異丙醇(C)平衡的制備柱上。將柱子以115mL/分鐘，以在30分鐘內(nèi)從75D/15E/10C至60D/30E/10C的梯度洗脫，然后用30D/60E/20C沖洗。將含有95A％或更高的面積百分比純度標(biāo)題肽的餾份合并然后冷凍干燥，得到固體狀乙酸鹽形式的純化產(chǎn)物(從1g粗品得到約100-200mg@大約95A％純度)。在每一階段，用分析HPLC在C18柱(4.6mm×25cm,5微米，120A或300A)上分析餾份的含量和純度，梯度為30分鐘內(nèi)25-40％B(A=0.1％三氟乙酸/水；B=0.1％三氟乙酸/乙腈)，流速為1mL/分鐘，用TV在220nm檢測(cè)。
序列表<110>Sledeski,Adam W.
Mencel,James J.<120>制備樹(shù)脂結(jié)合的環(huán)肽的方法<130>A3113A-WO<140><141><150>60/081,897<151>1998-04-15<160>47<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>1Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>2<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>2Ala Ala Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>3<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>3Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>4<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>4Ala Val Ser Ala Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>5<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Xaa Mis Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>6<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>6Ala Val Ser Glu Ile Ala Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>7<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>7Ala Val Ser Glu Ile Gln Ala Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>8<211>31<213>未知<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>8Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Ala His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>9<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>9Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Ala Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>10<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>10Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Ala Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>11<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>11Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Ala Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>12<211>31<212>PRT<213>未知<220><22l>MOD_RES<222>(8)<223>N1e<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>12Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Ala His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<21O>13<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>13Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys Ala Leu Asnl 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>14<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>14Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Ala Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>15<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>15Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>16<211>31<2112>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(13)..(17)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>16Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Asp Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>17<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(26)..(30)<223>“在26位的Lys與在30位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>17Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>18<211>34<212>PRT<213>未知<220><221>MOD RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>18Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>19<211>34<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<221>肽<222>(13)..(17)<223>“在13位的Lys與在17位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>19Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Asp Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>20<211>34<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>20Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Lys Arg Arg Arg Asp Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala<210>21<211>34<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>21Ala Val ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Lys Arg Arg Arg Asp Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala<210>22<211>28<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys與在16位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Nle<400>22Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn ser Lys Glu Arg Val Asp1 5 10 15Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe20 25<210>23<211>28<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys與在16位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>23Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Lys Arg Arg Arg Asp1 5 10 15Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala20 25<210>24<211>28<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(7)..(11)<223>“在7位的Lys與在11位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys與在16位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>24Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Asp Lys Glu Arg Val Asp1 5 10 15Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn phe20 25<210>25<211>28<212>PRT<213>未知<220><22l>MOD_RES<222>(2)<223>Nle<220><221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys與在16位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(20)..(24)<223>“在20位的Lys與在24位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸為酰胺，即CONH2”<400>25Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Lys Glu Arg Val Asp1 5 10 15Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe20 25<210>26<211>34<212>PRT<213>未知<400>26Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>27<211>34<212>PRT<213>未知<400>27Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala<210>28<211>9<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Trp(BOC)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(4)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(7)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(8)<223>Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(9)<223>“此C-末端氨基酸通過(guò)酰胺鍵與氯三苯甲基樹(shù)脂鍵合”<400>28Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>未知<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Trp(BOC)<220><221>肽<222>(3)<223>產(chǎn)物=Arg(PMC)<220><221>肽<222>(4)<223>產(chǎn)物=Lys(BOC)<220><221>肽<222>(7)<223>產(chǎn)物=Gln(Trt)<220><221>肽<222>(8)<223>產(chǎn)物=Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(9)<223>其它“此C-末端氨基酸通過(guò)酰胺鍵與Rink酰胺MBHA樹(shù)脂鍵合”<400>29Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val1 5<210>30<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<400>30Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>31<211>14<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(6)<223>Trp(BOC)<220><221>肽<222>(8)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(9)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(12)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(13)<223>Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(14)<223>“此C-末端氨基酸通過(guò)酰胺鍵與Rink酰胺MBHA樹(shù)脂鍵合”<400>31Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val<210>32<211>19<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys(BOC)<220><221>肽<222>(2)<223>His(Trt)<220><221>肽<222>(4)<223>Asn(Trt)<220><221>肽<222>(5)<223>Ser(OtBu)<220><221>肽<222>(6)..(10)<223>“在6位的Lys與在10位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(7)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(8)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(6)..(10)<223>“在6位的Lys與在10位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(11)<223>Trp(BOC)<220><221>肽<222>(13)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(14)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(17)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(18)<223>Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(19)<223>“此C-末端氨基酸通過(guò)酰胺鍵與氯三苯甲基樹(shù)脂鍵合”<400>32Lys His Leu Asn Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu1 5 10 15Gln Asp Val<210>33<211>11<212>PRT<213>未知<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Ala<220><221>肽<222>(3)<223>Ser(OtBu)<220><221>肽<222>(4)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(6)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(9)<223>His(.Trt)<220><221>肽<222>(10)<223>Asn(Trt)<400>33Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu His Asn Leu Gly1 5 10<210>34<211>30<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Ala<220><221>肽<222>(3)<223>Ser(OtBu)<220><221>肽<222>(4)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(6)<223>Gln (Trt)<220><221>肽<222>(9)<223>His(Trt)<220><221>肽<222>(10)<223>Asn(Trt)<220><221>肽<222>(13)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(14)<223>His(Trt)<220><221>肽<222>(16.)<223>Asn(Trt)<220><221>肽<222>(17)<223>Ser(OtBu)<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys與在22位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(19)<223>Glu(ptBu)<220><221>肽<222>(20)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(22)..(30)<223>“在13位的Lys與在30位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(23)<223>Trp(BOC)<220><221>肽<222>(25)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(26)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(29)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(18)<223>Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(30)<223>“此C-末端氨基酸通過(guò)酰胺鍵與Rink酰胺MBHA樹(shù)脂鍵合”<400>34Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser1 5 10 15Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>35<211>2<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(2)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(1)<223>BOC-Val<220><221>肽<222>(2)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>35Val Asp1<210>36<211>2<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>“N-末端氨基酸是以鹽酸鹽的形式”<220><221>肽<222>(2)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(2)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>36Val Asp1<210>37<211>3<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Arg(PMC)<220><221>肽<222>(3)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(3)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>37Arg Val Asp1<210>38<211>3<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(3)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(3)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>38Arg Val Asp1<210>39<211>4<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(2)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(4)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(4)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>39Glu Arg Val Asp1<210>40<211>4<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(2)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(4)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(4)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>40Glu Arg Val Asp1<210>41<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys(Alloc)<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(5)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>41Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>42<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>42Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>43<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(5)<223>“此C-末端氨基酸是以與芐醇形成的酯的形式”<400>43Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>44<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“在1位的Lys與在5位的Asp的側(cè)鏈之間通過(guò)酰胺鍵連接”<400>44Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>45<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys(Alloc)<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>Asp(OAllyl)<220><22l>肽<222>(5)<223>“C-末端Asp與氯三苯甲基樹(shù)脂鍵合”<400>45Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>46<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“C-末端Asp與氯三苯甲基樹(shù)脂鍵合”<400>46Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>47<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)<223>“C-末端Asp與氯三苯甲基樹(shù)脂鍵合”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“C-末端Asp與氯三苯甲基樹(shù)脂鍵合”<400>47Lys Glu Arg Val Asp1 權(quán)利要求
1．制備下式化合物的方法 其中J、L和M是直鏈肽片段K1不存在或?yàn)榄h(huán)狀肽片段,且K2是環(huán)狀肽片段；該方法包括如下步驟(1)通過(guò)向樹(shù)脂上順次連接適宜保護(hù)的氨基酸殘基制備M-，制得M- Ⅲ其中是適宜的肽合成樹(shù)脂，M是多肽片段(2)通過(guò)常規(guī)的肽合成單獨(dú)制備式Ⅳ的N-末端保護(hù)的環(huán)狀多肽片段 其中P是適宜的胺保護(hù)基，(3)將Ⅲ與Ⅳ偶聯(lián)得到式Ⅴ的肽 (4)如果K2不存在，則(a)以式Ⅵ的單個(gè)多肽的形式制備多肽片段J和L 然后將多肽Ⅵ與肽Ⅴ偶聯(lián)得到式Ⅶ的肽 或者，選擇性地，(b)向式Ⅴ的肽片段中順次加入多肽J和L的保護(hù)了的單個(gè)氨基酸單元，或者，選擇性地，(c)以多肽片段的形式單獨(dú)制備J和/或L，并偶聯(lián)到從式Ⅴ的片段開(kāi)始的正在延伸的肽上；(5)當(dāng)存在環(huán)肽K1時(shí)，則(a)通過(guò)常規(guī)的肽合成方法單獨(dú)制備式Ⅷ的多肽片段 其中P是適宜的胺保護(hù)基，(b)制備式Ⅸ的肽片段 并將該片段與肽片段Ⅴ偶聯(lián)得到式Ⅹ的肽片段 且(c)將環(huán)狀肽片段Ⅷ與式Ⅹ的肽片段偶聯(lián)得到式Ⅺ的肽片段 (d)制備式Ⅻ的肽片段 將片段Ⅻ與片段Ⅺ偶聯(lián)，然后(6)將樹(shù)脂裂解并脫保護(hù)。
2．權(quán)利要求1的方法，其中，式Ⅰ的肽是下式的環(huán)肽化合物X-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Y其中X選自(a)R1a-A0-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(b)R1a-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(d)R1a-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(e)R1a-A5-A6-A7-A8-A9-,(f)R1a-A6-A7-A8-A9-,(f)R1b-A6-A7-A8-A9-,(g)R1a-A7-A8-A9-,(h)R1a-A8-A9-,(i)R1a-A9-，和(j)R1a-；Y選自(a)-R3,(b)-A28-R3,(c)-A28-A29-R3,(d)-A28-A29-A30-R3,(e)-A28-A29-A30-A31-R3,(f)-A28-A29-A30-A31-A32-R3,(g)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3,和(h)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3；R1a為H、烷基、芳烷基或-COR2；R1b為R1a或下式的基團(tuán) 或 R2為烷基、鏈烯基、炔基、芳基或芳烷基；R3為式A35-OR4或A35-NR4R5的基團(tuán)；R4和R5彼此獨(dú)立地為H或低級(jí)烷基；R6和R9彼此獨(dú)立地為H或烷基；R7為烷基；R8為H、烷基或COR2；R10為H或鹵素；R11為烷基或芳烷基；m為1,2或3；n為3或4；A0不存在或?yàn)?-6個(gè)氨基酸殘基的肽；A1為Ser、Ala、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A2為Ala、Val或Gly或其等同的氨基酸；A3為Ala、Ser、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A4為Glu、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A5為Ile、His、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A6為Ala、Gln、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A7為Ala、Leu、Gly或其等同的氨基酸；A8為L(zhǎng)eu、Nle、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A9為His、Ala、D-Pro或Gly或其等同的氨基酸；A10為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A11為Ala、Gly、Leu或Lys或其等同的氨基酸；A12為Ala或Gly或其等同的氨基酸；A13為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Tbr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A14為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、His、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A15為Ala、Gly、Ile、D-Pro或Leu或其等同的氨基酸；A16為Asn、Ala、Gly、D-Pro或Gln或其等同的氨基酸；A17為Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A18為Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Leu、Lys、Orn、Nle、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A19為Arg或Glu或其等同的氨基酸；A20為Arg或其等同的氨基酸；A21為Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Lys、Orn、Ser、Thr、Val、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A22為Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Phe、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A23為L(zhǎng)eu、Phe或Trp或其等同的氨基酸；A24為L(zhǎng)eu或其等同的氨基酸；A25為Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、D-Pro、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A26為Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A27為L(zhǎng)eu或Lys或其等同的氨基酸；A28為Ile或Leu或其等同的氨基酸；A29為Ala、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gln、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A30為Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A31為Ile或Leu或Val或其等同的氨基酸；A32為His或其等同的氨基酸；A33為Asn或Thr或其等同的氨基酸；A34為Ala或Phe或其等同的氨基酸；A35不存在或?yàn)?-4個(gè)氨基酸的肽；和至少一個(gè)下面的氨基酸殘基對(duì)的側(cè)鏈經(jīng)酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接形成一個(gè)橋，這些氨基酸殘基對(duì)為A10與A14、A13與A17、A14與A18、A17與A21、A18與A22、A21與A25、A25與A29和A26與A30，并且下面各個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈最多導(dǎo)致形成一個(gè)橋，這些氨基酸殘基為A10、A13、A14、A17、A18、A21、A22、A25、A26、A29和A30；條件是當(dāng)下面的氨基酸殘基對(duì)A13與A17或A26與A30的側(cè)鏈經(jīng)酰胺鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接形成一個(gè)橋時(shí)，至少一個(gè)下面的氨基酸殘基對(duì)的側(cè)鏈A10與A14、A14與A18、A17與A21、A18與A22、A21與A25和A25與A29也經(jīng)酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵或羊毛硫氨酸鍵連接。
3．權(quán)利要求1的方法，用于制備環(huán)(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2該方法包括如下步驟(a)制備樹(shù)脂結(jié)合肽片段AFmoc-Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹(shù)脂 (A)；(b)制備環(huán)肽片段B (c)將步驟(a)的肽片段A與步驟(b)的肽片段(B)偶聯(lián)形成中間體肽AB (d)向肽AB上順次加成Ser(OtBu)、Asn(Trt)、Leu、His(Trt)和Lys(Boc)形成中間體肽C (e)制備肽片段D:Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OH (D)；(f)將片段C和D偶聯(lián)形成樹(shù)脂結(jié)合肽EFmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly- 和(g)將樹(shù)脂裂解并脫保護(hù)。
4．適于在權(quán)利要求3的方法中作為中間體的肽，所述的肽選自Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹(shù)脂，F(xiàn)moc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH，環(huán)(Lys18-Asp22)Fmoc-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹(shù)脂，環(huán)(Lys18-Asp22)Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹(shù)脂，F(xiàn)moc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OH，環(huán)(Lys18-Asp22)Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-樹(shù)脂，BOC-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,HCl·Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,Arg(PMC)-Val-Asp(OAll)-Obzl,FMOC-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,Glu(OtBu)-(L)Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,FMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-Obzl,FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Gtu-Arg-Val-Asp-Obzl,FMOC-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OH,Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)-氯代三苯甲基樹(shù)脂，F(xiàn)moc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基樹(shù)脂，和Fmoc-環(huán)(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基樹(shù)脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及以片段為基礎(chǔ)固相合成與樹(shù)脂結(jié)合的環(huán)狀肽甲狀旁腺激素類(lèi)似物和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白類(lèi)似物的方法,所述類(lèi)似物含有至少一個(gè)在兩個(gè)不相鄰的氨基酸殘基側(cè)鏈之間的橋,本發(fā)明還涉及該方法所用的肽片段。
文檔編號(hào)C07K5/078GK1323313SQ99811970
公開(kāi)日2001年11月21日 申請(qǐng)日期1999年4月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月15日
發(fā)明者A·W·斯萊迪斯基, J·J·曼西爾 申請(qǐng)人:阿溫蒂斯藥物制品公司