專利名稱：糖肽的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到1-氨基_天冬酰胺結合型糖鏈衍生物(以下稱為氨基化復合型糖鏈衍生物)和糖肽。
背景技術：
很多存在于生物體內(nèi)的肽(蛋白質(zhì))都含有糖鏈。糖鏈由于是單糖和單糖通過糖苷鍵結合成鏈狀，所以可以象

圖1那樣表示。與肽(蛋白質(zhì))結合的糖鏈根據(jù)其與氨基酸結合的樣式大致分為2類。與天冬酰胺(Asn)側鏈結合的天冬酰胺結合型(N-聯(lián)型)以及和絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)的側鏈 羥基結合的粘蛋白結合型(0-聯(lián)型)。所有的天冬酰胺結合型糖鏈鏈具有含5個糖殘基的 基本骨架，根據(jù)連接的糖鏈的非還原末端的糖殘基的種類不同，可以象圖2那樣分為高甘 露糖型、復合型、混成型亞類。這樣的糖鏈通過與肽(蛋白質(zhì))結合覆蓋該分子的表面，可以調(diào)節(jié)肽(蛋白質(zhì))的 溶解性，不僅增加對蛋白酶的抗性，使來自于血中的代謝延遲，而且起到維持肽(蛋白質(zhì)) 三維結構的作用。作為代表例，如稱為人的(促)紅細胞生成素(EPO)的糖肽(糖蛋白)。該糖肽 (糖蛋白)帶有復合型天冬酰胺結合型糖鏈，通過作用于紅細胞系前體細胞，促進其增殖和 分化，是具有維持末梢血中紅血球數(shù)的功能的血球分化激素。有關肽(蛋白質(zhì))上的糖鏈 結構和生理活性的相關性進行了各種各樣的研究，判明在體外即使沒有結合糖鏈的EPO也 具有生理活性，而在體內(nèi)如果沒有糖鏈就沒有生理活性。這樣的糖肽(糖蛋白)以及將各種各樣的肽(蛋白質(zhì))作為醫(yī)藥品使用的研究雖然正在開展，但要解決的問題依然存在。肽(蛋白質(zhì))制劑等由于在血中可被蛋白水解酶 (蛋白酶)簡單分解后被代謝，所以不能維持充分的血中濃度。本發(fā)明的目的就在于提供可維持充分血中濃度的氨基化復合型糖鏈衍生物和糖肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及到以下發(fā)明。1.氨基化復合型糖鏈衍生物。2.式(1)表示的氨基化復合型糖鏈衍生物。<formula>formula see original document page 4</formula>[式中，R1表示-NH- (CO) -CH2X-, -NH- (CO) - (CH2)b_CH2X、異硫氰酸酯基、-NH- (CO) ,-(CH2)b-CO2H, -NH-(CO) a-(CH2)b-CH0o X 表示鹵素原子、a 為 0 或 1，b 表示 1 4 的整數(shù)。 R2和R3是氫原子、式⑵ (5)表示的基團，可以相同，也可以不同。但是R2和R3都是氫 或式(5)的情況，R2或R3是氫原子，另一個R2或R3為式(5)的情況除外。]
<formula>formula see original document page 4</formula>3.上述的氨基化復合型糖鏈衍生物，其中R1是-NH-鹵化乙酰基。4.上述氨基化復合型糖鏈衍生物與氨基酸的巰基結合的糖肽。5.糖肽的制造方法，其特征是使上述氨基化復合型糖鏈衍生物與氨基酸的巰基結合。
6.糖肽，其特征是上述氨基化復合型糖鏈衍生物與氨基酸的巰基結合的糖肽是 抗體。7.糖肽的制造方法，其特征是將糖肽的糖從氨基酸上切下，然后結合上述氨基 化復合型糖鏈衍生物。8.糖肽的制造方法，其特征是將糖肽的糖從氨基酸上切下，然后結合上述氨基 化復合型糖鏈衍生物后得到的糖肽是抗體。本發(fā)明的氨基化復合型糖鏈衍生物是將與復合型天冬酰胺結合型糖鏈的1位的 碳結合的羥基用-NH-(C0)-CH2X-、-NH-(CO)-(CH2)b-CH2X、異硫氰酸酯基、-NH-(CO)a-(CH2) b-C02H、-NH-(CO)a-(CH2) b-CH0(X表示鹵素原子、a為0或1，b表示1 4的整數(shù))中任一 個置換后的化合物。復合型天冬酰胺結合型糖鏈可以舉出如式(6)表示的糖鏈。
<image>image see original document page 5</image>(式中，R4和R5是氫原子、上述式⑵ (5)表示的基團，可以相同，也可以不同。 但是R4和R5都是氫或式(5)時，R4或R5是氫原子，另一個R4或R5為式(5)的情況除外。)該復合型天冬酰胺結合型糖鏈可以根據(jù)例如國際公開公報W003/008431號公報 合成。另外也可以使用酶從糖蛋白切出糖鏈的方法或化學切斷的方法。作為酶可以使用糖 肽酶A或N-聚糖酶。作為化學切斷法可以通過胼分解制造糖鏈。氨基化復合型糖鏈衍生物是將與復合型天冬酰胺結合型糖鏈的1位的碳結 合的羥基用-NH- (CO) -CH2X-, -NH- (CO) - (CH2)b_CH2X、異硫氰酸酯基、-NH- (CO) a- (CH2) b-C02H、-NH-(CO)a-(CH2)b-CHO (X表示鹵素原子、a為0或1，b表示1 4的整數(shù))中任一 個置換后的化合物。例如，可以用下面式(1)表示。其中作為鹵素原子可舉出如氟、氯、溴、 碘。
<image>image see original document page 5</image>(式中，R1 R3與上述相同)氨基化復合型糖鏈衍生物可以用眾所周知的方法進行制造，例如只要使帶 有-NH- (CO) - (CH2) b_CH2X、異硫氰酸酯基、-NH- (CO) a- (CH2) b_C02H、-NH- (CO) a- (CH2) b_CH0 (X 表示鹵素原子、a為O或1，b表示1 4的整數(shù))的化合物與氨基化復合型糖鏈衍生物反 應就可以制造。具體來說，當R1為-NH-溴乙酰基時，在縮合劑存在下，于溶劑中使1-氨基-復合型天冬酰胺結合型糖鏈與溴乙酸反應。作為溶劑，只要是1-氨基-復合型天冬酰 胺結合型糖鏈和溴乙酸溶解的溶劑就可以，例如水、DMF等。作為縮合劑，例如1-均三甲基 苯基磺?；?3-硝基-1，2，4-三氮雜茂環(huán)(MSNT)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳 二亞胺(DIP⑶I)等，相對于1摩爾1-氨基-復合型天冬酰胺結合型糖鏈優(yōu)選使用1 10 摩爾縮合劑。而相對于1摩爾ι-氨基_復合型天冬酰胺結合型糖鏈優(yōu)選使用1 10摩爾 溴乙酸。反應通常在0 80°C下、優(yōu)選10 60°C下，更優(yōu)選15 35°C下進行，通常進行 30分鐘 5小時就可以。反應結束后，可以適當?shù)赜帽娝苤姆椒╗例如高效液相層析 (HPLC)]進行精制。本發(fā)明的結合了 1-氨基_復合型天冬酰胺結合型糖鏈的糖肽是在任意的氨基酸經(jīng)肽鍵結合的肽上通過該肽的巰基使1-氨基-復合型天冬酰胺結合型糖鏈結合的糖肽。本發(fā)明中所說的肽指的是2個或2個以上同種或異種氨基酸經(jīng)一方的羧基與另一 方的氨基之間脫水形成酰胺鍵、即肽鍵(-C0-NH-)生成的化合物。由約10個以下氨基酸構 成的比較小的肽稱為寡肽，10個以上氨基酸構成的肽稱為多肽。多肽中包括蛋白質(zhì)。肽可以通過固相合成法、液相合成法、對由細胞合成、天然存在的肽進行分離提取 的方法等可以獲得。本發(fā)明的結合了 1-氨基_復合型天冬酰胺結合型糖鏈的糖肽可以通過使氨基化 復合型糖鏈衍生物與含有巰基的肽反應進行制造。反應通常在0 80°C下、優(yōu)選10 60°C 下，更優(yōu)選15 35°C下進行，通常進行30分鐘 5小時就可以。反應結束后，可以適當?shù)?用眾所周知的方法[例如高效液相層析(HPLC)]進行精制。具體來說，使氨基化復合型糖 鏈衍生物和含有巰基的肽于磷酸緩沖液中、在室溫下反應。反應結束后通過HPLC進行精制 就可以獲得本發(fā)明的結合了 ι-氨基_復合型天冬酰胺結合型糖鏈的糖肽。另外，通過上述制造方法使氨基化復合型糖鏈衍生物與事先結合了糖或糖鏈的含 有巰基的糖肽反應，可以獲得含有多個糖或糖鏈的結合了 ι-氨基-復合型天冬酰胺結合型 糖鏈的糖肽。另外，通過使氨基化復合型糖鏈衍生物與事先結合了糖或糖鏈的含有巰基的糖肽 反應，通過切斷預先含有的糖或糖鏈，可以獲得結合了 ι-氨基_復合型天冬酰胺結合型糖 鏈的糖肽。此時，在對預先含有的糖或糖鏈進行切斷時，例如優(yōu)選使用酶進行酶切。可以在 氨基化復合型糖鏈衍生物導入前，也可以在導入后切都可以，最好是在切斷的同時將氨基 化復合型糖鏈衍生物導入肽中。作為進行切斷的酶只要是切斷肽和糖或糖鏈的還原末端的 酶(糖水解酶)就可以，例如可以使用PNGase F等。反應通常在0 80°C下、優(yōu)選10 60°C下，更優(yōu)選15 35°C下進行，通常進行30分鐘 5小時就可以。反應結束后，可以適 當?shù)赜帽娝苤姆椒╗例如高效液相層析(HPLC)]進行精制。本發(fā)明的結合了 1-氨基-復合型天冬酰胺結合型糖鏈的糖肽比天然存在的復合 型天冬酰胺結合型糖肽在對糖水解酶的抗性上更優(yōu)越(難被水解)。因此，在血中的穩(wěn)定性 提高，血中壽命延長。本發(fā)明的結合了氨基化復合型糖鏈衍生物的糖肽由于肽的氨基酸序列、糖鏈的結 合位置或糖鏈的結構和種類均一，所以該糖肽作為生理活性分子時(例如抗體)，生理活性 分子的生理活性是均一的。本發(fā)明的結合了氨基化復合型糖鏈衍生物的糖肽的制造方法可以對有選擇地與肽的巰基結合的氨基化復合型糖鏈衍生物在任意位置有選擇地導入復合型天冬酰胺結合 型糖鏈。本發(fā)明的結合了氨基化復合型糖鏈衍生物的糖肽的制造方法可以制造高分子量 (例如分子量1萬以上)的糖肽。本發(fā)明的結合了氨基化復合型糖鏈衍生物的糖肽的制造方法可以不破壞糖肽的折疊將任意的復合型天冬酰胺結合型糖鏈有選擇地導入任意位置。附圖的簡單說明圖1是表示糖鏈的結構的1個例子的圖。圖2是表示天冬酰胺結合型糖鏈的分類的圖。圖3是表示Anti-CD20嵌合抗體(Mutant)和Anti_CD20嵌合抗體(Mutant)糖鏈 修飾物的電泳圖。具有實施方式以下給出參考例和實施例，對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明并不限定于這些例子。參考例1 ( 二唾液酸糖鏈天冬酰胺的合成)使粗精制的SGP(唾液酸基糖肽(* 7 U ；ι 1J ^ ^ F ))500mg和疊氮鈉 IOmg (319 μ mol)溶解于 25ml Tris-鹽酸-氯化鈣緩沖液(TRIZMA BASE 0. 05mol/l，氯化鈣 0. 01mol/l, pH7. 5)。然后向該溶液中加于5ml Tris-鹽酸-氯化鈣緩沖液中溶解了 50mg 的肌動蛋白酶-E (蛋白質(zhì)分解酶，科研制藥)，于37°C下靜置。115小時后，將溶液冷凍干 燥。將殘留物用凝膠過濾柱層析精制2次，得到252mg 二唾液酸糖鏈天冬酰胺。1H-WRO(TC) δ 5. 13(s，lH，Man4-H-l)，5. 07(d，1H，J = 9. 5Hz，Glc NAc 1_H_1)， 4. 95(s，lH，Man4-H-1) ,4. 77 (s, 1H, Man3-H_l)，4. 61 (d，1H，J = 7. 6Hz, Glc NAc 2_H_1)， 4. 60(d，2H，J = 7. 6Hz，Glc NAc 5，5_H_1)，4. 44 (d，2H，J = 8. 0Hz，Gal 6，6-H-l)，4. 25 (bd， 1H, Man3-H-2)，4. 20(bdd,1H, Man4-H_2)，4. 12(bd,1H,Man4-H_2)，2. 94(dd,1H,J = 4. 5Hz, 17. 2Hz, Asn-β CH) ,2. 85 (dd, 1H, J = 7. OHz, 17. 2Hz, Asn-β CH) ,2. 67，2. 66(dd，2H，J =4. 6Hz, 12. 4Hz, Neu Ac7，7-H_3eq)，2. 07(s，3H，Ac)，2. 06(s，6H，Ac X 2) ,2. 02(s，6H， AcX 2)，2. 01 (s，3H, Ac)，1. 71 (dd, 2H, J = 12. 4Hz, 12. 4Hz, Neu Ac7, 7_H_3ax)
<formula>formula see original document page 7</formula>
參考例2 (用Fmoc基保護了天冬酰胺的氨基氮的二唾液酸糖鏈天冬酰胺的合成)
使參考例1中得到的二唾液酸糖鏈天冬酰胺80mg(0. 034mmol)溶解于2. 7ml 蒸餾水和4. Iml丙酮混合溶液中，然后加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸鹽 (Fmoc-OSn) 34. 7mg(0. 103mmol)和碳酸氫鈉 11. 5mg(0. 137mmol)，于室溫下攪拌 2 小時。通 過TLC確認反應結束后，對溶液進行減壓濃縮，除去丙酮。將殘留物充填到結合了十八烷基 甲硅烷基的硅膠柱(0DS柱)進行精制，得到目的Fmoc- 二唾液酸糖鏈天冬酰胺60. Img,收 率 68%。1H-WRGO "C )8. 01 (2H, d, J = 7. 5Hz, Fmoc)，7. 80 (2H, d, J = 7. 5Hz, Fmoc)， 7. 60 (2H, dd, J = 7. 5Hz, Fmoc)，7. 53 (2H, dd, J = 7. 5Hz, Fmoc)，5. 23 (1H, s, Man4-H1)， 5. 09(lH，d，J = 9.4Hz，Glc NAc I-H1)，5. 04 (1H，s，MaM-H1)，4. 86 (1H，s，MaM-H1)，4. 70 4. 66 (m, Glc NAc 2-^61 c NAc 5,5-^) ,4. 54 (2H, d, J = 7. 9Hz, Gal 6,6-^) ,4. 44 (1H, d, Fmoc CH)，4. 34 (1H，bd, Man3_H2) ,4. 29, (1H, bd, Man. 4_H2)，4. 20 (1H, bd, Man4_H2)， 2. 77 (2H, dd, Neu Ac7,7-H3eq)，2. 80 (1H, bdd, Asn- β CH)，2. 62 (1H, bdd, Asn- β CH)， 2. 14(18Η, s X 6，-Ac)，1. 80 (2Η, dd, Neu Ac7，7_H3ax)
<formula>formula see original document page 8</formula>參考例3 (HOOC-Arg-Glu-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-NH2 的合成)將HMPA-PEGA樹脂370mg加入到固相合成用柱子，用CH2Cl2, DMF充分洗滌后用于反應。使Fmoc-Arg(OtBu)-OHU-均三甲基苯基磺?；?3-硝基_1，2，4_三氮雜茂環(huán) (MSNT)、N-甲基咪唑溶解于CH2Cl2中后攪拌5分鐘，然后加入到已經(jīng)加入樹脂的固相合成 用柱中，于室溫攪拌3小時。攪拌后將樹脂用亞甲基氯化物、異丙醇、DMF進行清洗、干燥。 然后用20分鐘用20%乙酸酐DMF溶液將固相上未反應的羥基進行乙?；忾]。用DMF將 樹脂洗滌后，通過使用20%哌啶/DMF溶液攪拌20分鐘，脫去Fmoc基，得到樹脂-Arg-NH2。 用DMF洗滌后，使其干燥。在該樹脂上對谷氨酸(Glu)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨 酸(Cys)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)、纈氨酸(Val)同樣進行 縮合和 Fmoc 基的脫保護，得到樹脂-Arg-Glu-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-NH
2°谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、絲氨酸(Ser)、 蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、纈氨酸(Val)這些氨基酸使用對羧基進行了 pfp酯化的Fmoc-AA-Opfp (AA =氨基酸)，通過3，4- 二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪_3_基(Dhbt)縮 合。所有的縮合都是在DMF溶液中進行。將樹脂洗滌后，加95% TFA水溶液，于室溫下攪拌3小時后切去樹脂。將樹脂過濾 除去后，在室溫下對反應溶液進行減壓濃縮后，溶解在水中進行冷凍干燥。
參考例4(HOOC-Ser-Ser-Asn(disialooligo)-Cys-Leu-Leu-Ala-NH2 的合成)將HMPA-PEGA樹脂370mg加入到固相合成用柱子，用CH2Cl2, DMF充分洗滌后用于反應。使Fmoc-Ser (OtBu) _0H、1-均三甲基苯基磺?；鵢3_硝基-1，2，4_三氮雜茂環(huán) (MSNT)、N-甲基咪唑溶解于CH2Cl2中后攪拌5分鐘，然后加入到已經(jīng)加有樹脂的固相合成 用柱中，于室溫攪拌3小時。攪拌后將樹脂用亞甲基氯化物、異丙醇、DMF進行清洗、干燥。 然后用20分鐘用20%乙酸酐DMF溶液將固相上未反應的羥基進行乙?；忾]。用DMF將 樹脂洗滌后，通過使用20 %哌啶/DMF溶液，攪拌20分鐘，脫去Fmoc基，得到樹脂-Ser-NH2。 用DMF洗滌后，使其干燥。然后，使用Fmoc-Ser (OtBu) -OH 通過 HOBt · H2O 和 DIPCDI 進行縮合。接下來將參考例2的Fmoc- 二唾液酸糖鏈天冬酰胺溶解于DMS0、DMF1比1的混合 溶劑中，使用HATU和DIPEA，于室溫下攪拌24小時，使其縮合。用DMF洗滌后，在10%乙酸 酐/2-丙醇甲醇中攪拌20分鐘進行封閉。將樹脂用2-丙醇、DMF洗滌后，在20%哌啶/ DMF中攪拌20分鐘，將Fmoc基脫去，用DMF將樹脂洗滌。在該樹脂上對半胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)同樣進 行縮合和 Fmoc 基的脫保護，得到樹脂-Ser-Ser-Asn (disialooligo)-Cys-Leu-Leu-Ala-NH
2°半胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)這些氨基酸使用對羧基進行了 pfp 酯化的Fmoc-AA-Opfp (AA =氨基酸)，通過3，4- 二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪_3_基 (Dhbt)縮合。所有的縮合都是在DMF溶液中進行。將樹脂洗滌后，加95% TFA水溶液，于室溫下攪拌3小時后切斷樹脂。將樹脂過濾 除去后，在室溫下對反應溶液進行減壓濃縮后，溶于水進行冷凍干燥。將冷凍干燥品溶解于 PHl 1氫氧化鈉水溶液中，對芐酯進行水解后，用乙酸中和，經(jīng)HPLC精制得到目的HOOC-Ser-Ser-Asn (disialooligo)-Cys-Leu-Leu-Ala-NH2。(YMC-Pack A-314S-50DS柱300X6. Omm，展 開溶劑0. TFA 水溶液 B :0. TFA 乙腈水=90 10 梯度 A 100% 0. 60ml/min ^ B 100% 0. 60ml/min 60 分鐘)。參考例5 ( 二唾液酸糖鏈合成)將SGP (IOOmg)溶解于 50mM磷酸緩沖液ρΗ7· 0 中，加 PNGase F(BioLabs Inc. 1U)。 于37°C下溫育24小時，通過TLC(IPA IM NH4OAc = 1 1)確認反應結束后，進行冷凍干 燥。冷凍干燥品用凝膠過濾柱層析(S印hadex G251.5cmX30cm，水，流速1.0ml/min)進行 精制，得到產(chǎn)量74mg的二唾液酸糖鏈。1H-WrGOOMHz, D2O) δ 5. 28 (bd, 1H, Glc NAc l_H_la)，5· 23 (s, 1H, Man4-H_l)， 5.03 (s，1H, Man4，_H_1)，4· 86(s，1H, Man3-H_l)，4· 70(m，3H，Glc NAc 2,5,5' _H_1)， 4. 53(d，2H，Gal 6，6，_H_1)，4. 34 (bs, 1H, Man3-H_2)，4. 28 (bd, 1H, Man4-H_2)，4. 20 (bd, 1H, Man 4，_H_2)，2. 76(bdd,2H, Neu Ac7，7，-H_3eq)，2. 17(s，3H，Ac)，2. 16(s,6H,Ac X2)，2. 13(s，6H，AcX3)，1. 80(dd，2H，Neu Ac7，7，_H_3ax)
<formula>formula see original document page 10</formula>參考例6 (氨基化)將參考例5的二唾液酸糖鏈(IOmg)溶解于飽和碳酸氫銨水溶液中，將濃度調(diào)整到 30mM。于室溫下反應，維持在常處于飽和的狀態(tài)。使其反應7天，通過TLC (IPA IM NH4OAc =1 1)確認反應基本結束后，將反應溶液直接進行冷凍干燥。為了除去碳酸氫銨，反復 進行3次冷凍干燥，以粗制狀態(tài)得到產(chǎn)量9mg的氨基化的二唾液酸糖鏈。1H-NMR(400MHz, D2O) δ 5. 22 (s, 1H, Man4-H_l)，5· 03 (s，1H，Man4，_H_1)，4. 86 (s， 1H, Man3-H-1)，4. 69(m，3H，Glc NAc 2，5，5，_H_1)，4. 53 (d，2H，Gal 6，6，_H_1)，4. 34 (bs， 1H，Man 3_H_2)，4. 28 (bd，1H，Man4-H_2)，4. 23 (bd，1H，Glc NAc 1_H_1)，4. 20 (bd，1H， Man4，_H_2)，2. 76(bdd，2H，Neu Ac7，7，-H_3eq)，2. 17(s，3H，Ac) ,2. 16(s，6H，A cX2)， 2. 12(s，6H，AcX3)，1. 80(dd，2H，Neu Ac7，7，_H_3ax)
<formula>formula see original document page 10</formula>實施例1(溴乙?；?將參考例6的氨基化的二唾液酸糖鏈(粗制5mg)溶于100 μ 1水，加碳酸氫鈉2mg。 然后加溶解在DMF(100 μ 1)的溴乙酸6. 2mg和DCC 4. 6mg，于室溫下使其反應。1. 5小時后，通過TLC(IPA IM NH4OAc = 2 1)確認反應結束后，用碳酸氫鈉進行中和，過濾后進 行減壓濃縮。然后用凝膠過濾柱層析(S印hadex G25，1. 5cmX 30cm，水，流速1. Oml/min)進 行精制，得到產(chǎn)量4mg的溴乙?；亩僖核崽擎湥a(chǎn)率為77%。1H-NMR (400MHz, D2O) δ 5. 22 (s，1H, Man 4_H_1)，5· 16 (bd, 1H, Glc NAcl—H—l)， 5. 03(s，1H，Man4，-H-l)，4. 86(s，1H，Man 3_H_1)，4. 70 (m，3H，Glc NAc 2，5，5，_H_1)，
4.53(d，2H，Gal 6，6，_H_1)，4. 34 (bs，1H，Man 3_H_2)，4. 28 (bd，1H，Man 4_H_2)，4. 20 (bd， 1H, Man 4，_H_2)，2. 77(bdd,2H, Neu Ac7，7，-H_3eq)，2. 17(s，3H，Ac)，2. 15(s,6H,Ac X2)，
2.12(s，6H，Ac X 2)，2. 10(s，3H，Ac)，1. 80(dd，2H，Neu Ac7，7，_H_3ax)實施例2<formula>formula see original document page 11</formula>
將實施例1的溴乙?；亩僖核崽擎?mg和參考例3中合成的肽鏈1. 8mg (Arg -Glu-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val)溶解于 170 μ 1 的 IOOmM 磷酸緩沖液 pH7. O 中，于室溫下進行溫育。用HPLC確認原料消失后，直接用HPLC [柱子=Mightysil-GP (5 μ m)、 Φ10Χ25(Μιπι，梯度由0. 三氟乙酸/水100%—0. 1 %三氟乙酸、乙腈/水=90/1075%； 60分鐘線性，流速2. 5ml]進行精制，得到產(chǎn)量為2mg的二唾液酸糖肽，產(chǎn)率64%。1H-NMR (400MHz，D2O) δ 7. 18 (4Η, Ph) ,6. 89 (4Η, Ph) ,5. 22 (s，1H, Man 4-H-1)，
5.14(bd, 1H, Glc NAc 1-H-1) ,5. 04 (s, 1H, Man 4，_H_1)，4· 86 (s，1H，Man 3_H_1)， 4. 69-4. 63(m，5H，Glc NAc 2，5，5，_H_1，Tyr-α H，Cys-α H)，4. 55—4. 52(m，4H，Gal 6， 6，-H-l, Gln-α H, Ser- α H), 4. 44-4. 38(m，4H，Glu-α HX 2，Arg-H α，Thr- α H), 4. 34 (bs, 1Η，Man 3_H_2)，4· 28(m，3H，Man 4-H-2, Thr- β H),4. 23(d,1H, J = 5. 9Hz, Val-α H), 4. 20 (bd, 1H, Man 4，_H_2)，4. 15 (1H，Arg- α H) ,3. 30,3. 25 (each 2H, Arg- δ CH2)，
3.14-2. 99 (6H, Cys-β H, Tyr-β HX 2) ,2. 76(bdd，2H，Neu Ac7，7，-H_3eq)，2· 57 (2H, Gln- y CH2) ,2. 49, 2. 35 (each 2H, Glu- y CH2)，2. 23-2. 10 (m, 3H, Val-β H, Gln- β H)， 2. 16(s，3H，Ac) ,2. 15(s，6H，Ac X 2)，2. 12(s，6H，Ac X 2)，2. 10-1. 98 (m,6H, Glu-β HX 2， Arg- β H)，2. 07(s,3H,Ac)，1. 92-1. 57(m, 8H, Neu Ac7，7，_H_3ax，Arg- β H, Arg-yCH2X 2)， 1. 23 (d, 3H, Thr- y CH3)，1. 04 (d, 6H, Val- y CH3)<formula>formula see original document page 12</formula>實施例3 (使用1-溴乙?；鵢 二唾液酸糖鏈的替換)將參考例4合成的二唾液酸糖肽Img和實施例1的溴乙酰化的二唾液酸糖鏈Img 溶解于200μ 1的IOOmM磷酸緩沖液中，加入可將天冬酰胺結合型糖鏈從天冬酰胺切下的酶 PNGase F (5U)，于室溫下使其反應。生成物通過用HPLC進行精制，得到目的的在半胱氨酸 上結合了二唾液酸糖鏈的二唾液酸糖肽。(YMC-Pack A-314S-50DS 柱 300 X 6. Omm，展開溶劑0· TFA 水溶液 B 0. TFA 乙腈水=90 10 梯度 A 100% 0. 60ml/min — BlOO% 0. 60ml/min 60 分鐘)<formula>formula see original document page 13</formula>液酸糖鏈從天冬酰胺切下的時間。直至被切下的時間是30分鐘。就像該結果所表明的那樣，可知與天然型結合型糖肽(參考例4)相比，對糖水解 酶的抗性提高了。實施例4將Anti-⑶20嵌合抗體(Mutant)(株式會社醫(yī)學生物學研究所制造通過突變技術，將氨基酸序列第297位的天冬酰胺變換為半胱氨酸的抗體)43. 9 μ g和實施例1的溴乙 ?；亩僖核崽擎?00 μ g溶解于300 μ 1的IOOmM磷酸緩沖液中，于室溫下溫育。反應結 束后，通過蛋白A柱層析和凝膠過濾層析進行精制，得到目的的在半胱氨酸上結合了二唾 液酸糖鏈的抗體?？贵w通過電泳(10% SDS-PAGE(用2-巰基乙醇)分子量標記是BIO-RAD公司生產(chǎn) prestained SDS-PAGEstandard broad range (目錄號 Nol61_0318))禾Π MASS 進 行了確認。結果如圖3所示。利用本發(fā)明可以獲得能夠維持充分血中濃度的新的氨基化復合型糖鏈衍生物和 糖肽。
權利要求
糖肽的制造方法，其特征是具有同時進行的步驟(a)和(b)(a)通過從肽切斷糖鏈的還原末端的糖水解酶將糖肽的糖從氨基酸上切下，以及(b)結合式(1)表示的氨基化復合型糖鏈衍生物；式中，R1表示-NH-(CO)-CH2X、-NH-(CO)-(CH2)b-CH2X、-NH-(CO)a-(CH2)b-CO2H、或-NH-(CO)a-(CH2)b-CHO，X表示鹵素原子，a為0或1，b表示1～4的整數(shù)，R2和R3相同或不同，分別是氫原子或式(2)～(5)表示的基團之一，但是R2和R3都是氫原子或式(5)的情況，R2或R3是氫原子，另一個R2或R3為式(5)的情況除外，F(xiàn)2009102637367C00011.tif,F2009102637367C00012.tif,F2009102637367C00021.tif
2.權利要求1所述的糖肽的制造方法，其特征是得到的糖肽是抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供糖肽的制造方法，其特征是具有同時進行的步驟(a)和(b)(a)通過從肽切斷糖鏈的還原末端的糖水解酶將糖肽的糖從氨基酸上切下，以及(b)結合式(1)表示的氨基化復合型糖鏈衍生物；式中，R1表示-NH-(CO)-CH2X、-NH-(CO)-(CH2)b-CH2X、-NH-(CO)a-(CH2)b-CO2H、或-NH-(CO)a-(CH2)b-CHO，X表示鹵素原子，a為0或1，b表示1～4的整數(shù)，R2和R3相同或不同，分別是氫原子或式(2)～(5)表示的基團之一，但是R2和R3都是氫原子或式(5)的情況，R2或R3是氫原子，另一個R2或R3為式(5)的情況除外。
文檔編號C07K16/00GK101798586SQ20091026373
公開日2010年8月11日 申請日期2004年7月27日 優(yōu)先權日2003年7月28日
發(fā)明者梶原康宏, 深江一博 申請人:大塚化學株式會社;梶原康宏