專利名稱：差異保護(hù)的正交羊毛硫氨酸技術(shù)的制作方法
差異保護(hù)的正交羊毛硫氨酸技術(shù)優(yōu)先權(quán)本申請(qǐng)要求保護(hù)于2009年3月28日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)12/413，551的優(yōu)先權(quán)，其整體內(nèi)容在此引作參考。背景發(fā)明抗生素的發(fā)展，徹底改變了二十世紀(jì)后五十年的醫(yī)學(xué)實(shí)踐。這一期間傳染病引起的死亡率明顯降低。Armstrong等(1999)PAMA. 281，61-66。然而，自1982年開始，源自傳染病的死亡伴隨著耐受抗生素病原體的增加穩(wěn)定上升。醫(yī)學(xué)上重要的多種細(xì)菌對(duì)常用于治療臨床感染的抗生素的抵抗能力越來越強(qiáng)。在過去的二十年間文獻(xiàn)中出現(xiàn)數(shù)以千計(jì)的記錄這一現(xiàn)象的報(bào)告和書籍。Armstrong 等(1999)PAMA. 281，61-66 ；Dessen 等(2001) Curr. Drug Targets Infect. Disord. 1,11-16 ；Rapp(2000)Surg Infect(Larchmt). 1,39-47 ； Benin&Dowell(2001)Antibiotic resistance and implications for the appropriate use of antimicrobial agents, Humana Press, Totowa, NJ0盡管需要教導(dǎo)更適當(dāng)?shù)厥褂每股兀匾氖怯斜匾_發(fā)新抗生素。認(rèn)為萬古霉素是抵抗多種嚴(yán)重細(xì)菌感染的最后防御線。病原細(xì)菌的耐萬古霉素菌株的發(fā)現(xiàn)讓人擔(dān)憂，這預(yù)示著多藥耐藥性病原體的出現(xiàn)，所述病原體用現(xiàn)有的藥物不能治療?？膳碌氖?，除非馬上開發(fā)出新的抗生素，否則我們將事實(shí)上回到了抗生素之前的時(shí)代。有一種結(jié)構(gòu)新穎的小抗生素類別叫做羊毛硫抗生素(I類細(xì)菌素)，基于化學(xué)與生物合成的不同其可以被分為5個(gè)亞類A(I)型、A(II)型、B型、雙組分者和結(jié)構(gòu)未知者。 已經(jīng)知道該類別抗生素?cái)?shù)十年，但卻一直沒有對(duì)其治療感染性疾病的潛在效用進(jìn)行廣泛試驗(yàn)，盡管業(yè)已知道許多羊毛硫抗生素既有效又有廣譜活性，特別對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌類。出現(xiàn)以上問題的主要原因通常難以獲得能夠?qū)ζ溥M(jìn)行測(cè)試并商業(yè)化的足夠成本效益量的這些分子。乳鏈菌肽A(

圖1)提供了羊毛硫抗生素以及與羊毛硫抗生素相關(guān)的化學(xué)復(fù)雜性的數(shù)量和類型的良好實(shí)例。羊毛硫抗生素富含含硫氨基酸羊毛硫氨酸(Lan，ala-S-ala)，經(jīng)常為3-甲基-羊毛硫氨酸(MeLan，abu-S-ala)。Lan由丙氨酸殘基組成，所述丙氨酸殘基通過硫醚橋連接產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對(duì)于其生物活性至關(guān)重要。典型在羊毛硫抗生素上有3-5個(gè)這樣的環(huán)，且經(jīng)常這些環(huán)中很多互相之間重疊。認(rèn)為L(zhǎng)an和MeLan總是具有內(nèi)消旋立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。除了 Lan和MeLan殘基之外，還可能有翻譯后修飾的氨基酸(圖2)存在于羊毛硫抗生素中，例如2，3-5脫氫丙氨酸(Dha)、2，3 二脫氫氨基丁酸(Dhb)、不飽和羊毛硫氨酸衍生物如S-氨基乙烯基-D-半胱氨酸(AviCys)和S-氨基-D-甲基半胱氨酸以及 D-丙氨酸、2-氧代丙酰、2-氧代丁酰和羥基丙酰殘基。對(duì)于在乳鏈菌肽A的情況而言，由 Lan和MeLan形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以重疊(例如環(huán)D和環(huán)E)，這進(jìn)一步增加了分子的復(fù)雜性。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌負(fù)責(zé)生物合成已知的羊毛硫抗生素。它們用對(duì)核糖體合成的前肽原(preprop印tide)起作用的系列序貫酶促步驟制備成熟的分子。負(fù)責(zé)編碼修飾酶的基因通常簇集在8-10Kb DNA片段上，該片段可位于染色體上、質(zhì)粒上或作為轉(zhuǎn)座子的一部分。 在A(I)型羊毛硫抗生素中，在由IanA基因編碼的核糖體上合成的前肽中的所有絲氨酸和蘇氨酸殘基，都通過由IanB基因編碼的酶脫水，這些脫水氨基酸參與與位于更接近分子的羧基端的相鄰半胱氨酸殘基形成硫醚鍵。這一反應(yīng)由IanC基因表達(dá)的蛋白催化。在某些羊毛硫抗生素情形中，例如在表皮素和變異菌肽1140中，C-末端半胱氨酸由IanD基因表達(dá)的酶脫羧基，轉(zhuǎn)變成S-氨基乙烯基-D-半胱氨酸。隨后由IanT基因的產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞， 然后由IanP編碼的細(xì)胞外蛋白酶裂解經(jīng)修飾的前肽原的前導(dǎo)序列，產(chǎn)生成熟的抗生素。Ra 等(1996)Microbiology-Uk. 142,1281-1288 ；Kupke&Gotz(1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69,139—150 ；Kuipers 等(1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69,161-169。研究羊毛硫抗生素在治療應(yīng)用中的潛在效用的嘗試，一直受到難于獲得足夠量或足夠純度的羊毛硫抗生素的阻礙。到今天為止已表征的約40種羊毛硫抗生素(Chatterjee 等(2005)Chemical Reviews. 105,633683)中，只有由乳鏈球菌(Str印tococcus lactis) 產(chǎn)生的A(I)型羊毛硫抗生素乳鏈菌肽A實(shí)現(xiàn)了商品量制備，在過去50年中其作為食品防腐劑被廣泛應(yīng)用。乳鏈菌肽A的長(zhǎng)時(shí)間廣泛應(yīng)用沒有出現(xiàn)明顯抗性(DelvesBroughton等 (1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69，193-202)，這強(qiáng)烈促進(jìn)開發(fā)另外的羊毛硫抗生素用于不同應(yīng)用。用經(jīng)過多年優(yōu)化的發(fā)酵工藝進(jìn)行乳鏈菌肽A的大規(guī)模生產(chǎn)。最近申請(qǐng)了乳鏈菌肽 A的純化方案的美國(guó)專利(USPA 2004/0072333)。該方案使用了昂貴的蛋白酶混合物，隨后使用柱色譜。然而，尚沒有公開的商業(yè)上切實(shí)可行的乳鏈菌肽A的純化程序。這說明目前關(guān)注于發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)用于治療應(yīng)用的純?nèi)殒溇腁和其它羊毛硫抗生素的恰當(dāng)方法。各種可能選擇可用于羊毛硫抗生素的大規(guī)模生產(chǎn)。從原料成本觀點(diǎn)出發(fā)，發(fā)酵工藝是無可辯駁的最好方法。目前用于很多羊毛硫抗生素的發(fā)酵方法產(chǎn)量為每升微克量級(jí)， 其不足以用于藥物開發(fā)。作為選擇，一直在探索在A(I)型羊毛硫抗生素中用羊毛硫抗生素修飾機(jī)制進(jìn)行體夕卜生產(chǎn)。 Kupke&Gotz(1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69,39-150 ；Kuipers 等(1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69， 161-169。負(fù)責(zé)羊毛硫抗生素前肽原翻譯后修飾的酶在無細(xì)胞裂解物中或作為純化實(shí)體無 舌個(gè)生，LanD if {歹Ij夕卜。Kupke&Gotz (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69,139-150 ；10 ；Kupke&Gotz(1997) Journal of Biological Chemistry. 272,4759-4762 ；Kupke φ (1992)Journal of Bacteriology. 174,5354—5361 ；Kupke 等(1993)Fems Microbiology Letters. 112,43—48 ； Kupke 等(1995)Journal of Biological Chemistry. 270，11282-11289 ;Kupke 等(1994) Journal of Biological Chemistry. 269，5653-5659。對(duì) A(II)型羊毛硫抗生素而言，最近在Science中報(bào)道，體外合成乳鏈球菌素481是可能的。屬于該組和B型羊毛硫抗生素的分子僅用單一多頭酶LanM來完成Dha、Dhb、Lan和MeLan殘基的形成。Xie等(2004) Science. 303,679-681.乳鏈球菌素481生物合成的報(bào)告沒有提供關(guān)于產(chǎn)量或純度的任何詳細(xì)信息，但他們的工作是在納克級(jí)別上完成的。該報(bào)告中闡述的進(jìn)展代表很小但卻是明顯的進(jìn)步，其受到廣泛稱贊的接受進(jìn)一步表明將羊毛硫抗生素開發(fā)為治療藥物的迫切需
5求。由于系統(tǒng)的復(fù)雜性及很可能需要對(duì)參與的各種基因進(jìn)行差異調(diào)節(jié)表達(dá)，用克隆到適宜的一種或多種表達(dá)載體和非敏感宿主的Ian基因簇進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)羊毛硫抗生素的第三個(gè)選擇是不大可能的。業(yè)已將gallidermin的Lan基因簇克隆到枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)中，以試圖改善該特定羊毛硫抗生素的生產(chǎn)。然而，這一策略沒有導(dǎo)致產(chǎn)量的大大提升，且因?yàn)橐阎蛘{(diào)控位點(diǎn)隨物種不同而變化，其不適用于所有羊毛硫抗生素。相關(guān)方法利用克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)中的變異菌肽1140人工基因。該人工基因用半胱氨酸密碼子置換參與硫醚橋形成的絲氨酸和蘇氨酸殘基的天然密碼子。將該被修飾的基因克隆到PET32中，并在大腸桿菌的Origami菌株中表達(dá)，以使二硫鍵增至最大限度。開發(fā)新的化學(xué)方法以從二硫化物基團(tuán)中擠出單個(gè)硫原子，由此將其轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛎?。一般而言，證實(shí)該方法是可行的，但由于二硫鍵的多種排列及難以從非活性異構(gòu)體中分離出活性形式，獲得的產(chǎn)率低。乳鏈菌肽A和其它羊毛硫抗生素的生物活性的關(guān)鍵是通常重疊的環(huán)結(jié)構(gòu)，這形成了合成上難以克服的問題。一直都在廣泛研究用于合成各種含有羊毛硫氨酸的生物活性肽以及羊毛硫抗生素的體外合成方法。合成羊毛硫抗生素的挑戰(zhàn)是艱難的，到目前為止，沒有發(fā)展出全面的合成策略。文獻(xiàn)報(bào)道了幾種羊毛硫氨酸的合成方法。這些包括應(yīng)用堿性或親核條件在預(yù)裝配肽的胱氨酸單元進(jìn)行基于原位的脫硫。Galande等(2003) Biopolymers(Peptide Science)71,543-551 ;Galande&Spatola(2001)Letters in Peptide Science. 8, 247-251.由于缺乏非對(duì)映體選擇性和低產(chǎn)量，脫硫的方法尚未顯示任何商業(yè)可行性。亦使用仿生方法，其中在預(yù)先生成的肽中產(chǎn)生Dha殘基，接著進(jìn)行邁克爾加成以形成羊毛硫氨酸環(huán)。肽的預(yù)組織可能導(dǎo)致非對(duì)映選擇性的邁克爾加成。Burage等(2000) Chemistry A European Journal. 6，1455-1466。亦采用在廂樹脂上使肽環(huán)化，其中合成含有正交保護(hù)的羊毛硫氨酸的線性肽，接著環(huán)化并裂解環(huán)肽產(chǎn)物。Melacini等(1997)，J. Med. Chem. 40, 2252-2258 ；Osapay φ (1997)Journal of Medicinal Chemistry. 40，2441-2251。 這些方法都充滿希望，但缺少產(chǎn)生帶有重疊硫醚環(huán)的羊毛硫抗生素的能力。當(dāng)考慮到大部分已知羊毛硫抗生素含有重疊環(huán)時(shí)，這一點(diǎn)變得尤其重要。從概念上說，發(fā)展體外合成方法具有明顯優(yōu)勢(shì)，所述方法包括相對(duì)于生物學(xué)和仿生學(xué)方法對(duì)固相肽合成(SPPS)方法進(jìn)行改良。首先，分子組成不限于正常生理氨基酸集； 有可能設(shè)計(jì)氨基酸類似物并用良好建立的固相合成方法將其納入。也可以進(jìn)行平行合成， 由此顯著增加候選底物的數(shù)量。因?yàn)樗龇椒ㄍ耆隗w外進(jìn)行，因此排除了因體內(nèi)合成生物活性分子而產(chǎn)生的許多問題。例如，發(fā)酵過程中產(chǎn)物的降解將不再是問題，也不用關(guān)注生物活性分子對(duì)生產(chǎn)者微生物的細(xì)胞毒性作用。為實(shí)現(xiàn)體外合成的目的，用不同方法為SPPS設(shè)計(jì)了具有潛在合適保護(hù)基的正交羊毛硫氨酸，例如將半胱氨酸邁克爾加成到預(yù)先形成的Dha。Probert等(1996) Tetrahedron Letters. 37，1101-1104。這一方法導(dǎo)致1 1的非對(duì)映體混合物，因此，幾乎未顯示出商業(yè)價(jià)值。亦報(bào)道具有受保護(hù)的半胱氨酸的絲氨酸內(nèi)酯的開環(huán)，但這產(chǎn)生羊毛硫氨酸和硫酯的混合物。業(yè)已研究了氮丙啶的開環(huán)，但顯示由于氮丙啶在α和β位開口而產(chǎn)生區(qū)域異構(gòu)(regioisomeric) t昆合物。Dugave&Menez (1997) Tetrahedron-Asymmetry. 8, 1453-1465 ；Swali 等(2002)Tetrahedron. 58，9101-9109。最近的報(bào)告建議用受保護(hù)的溴丙氨酸使適當(dāng)保護(hù)的半胱氨酸烷基化，可導(dǎo)致合成羊毛硫氨酸，但是，該方法不允許構(gòu)建具重疊環(huán)的分子。Zhu(2003)European Journal of Organic Chemistry. 20, 4062-4072。因?yàn)槭匈?gòu)用于SPPS的Fmoc/Boc保護(hù)的類似物不足以解決合成羊毛硫抗生素及其它構(gòu)象上受限的生物活性肽的挑戰(zhàn)，所以本領(lǐng)域存在對(duì)合成含有分子內(nèi)橋的肽的需要，所述分子內(nèi)橋產(chǎn)生內(nèi)部環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括多環(huán)和重疊環(huán)狀結(jié)構(gòu)。特別需要用于大規(guī)模合成羊毛硫抗生素的體外方法。發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明提供合成包含至少一個(gè)分子內(nèi)橋的分子內(nèi)橋連多肽的方法，所述方法包括a)讓下式的差異保護(hù)的正交分子內(nèi)橋的游離羧基末端與固相支持體或任選與固相支持體結(jié)合的氨基酸或多肽的游離氨基末端偶聯(lián)，其中Ln代表共價(jià)結(jié)合的氨基酸側(cè)鏈，其中D、E和G為保護(hù)基，它們各自在不同反應(yīng)條件下被選擇性地除去，其中用于除去保護(hù)基D的反應(yīng)條件與用于除去多肽鏈的其余氨基酸的氨基保護(hù)基的條件不同；b)除去保護(hù)基E，以形成游離氨基末端；c)將氨基受到保護(hù)的氨基酸添加到所述游離氨基末端，然后使所述氨基酸脫保護(hù)，以產(chǎn)生新的游離氨基末端；d)任選重復(fù)C) 一次或多次；e)除去保護(hù)基G以形成游離羧基末端；f)讓e)的游離羧基末端與所述游離氨基末端偶聯(lián)；g)除去保護(hù)基D以形成游離氨基末端；和h)任選將氨基受到保護(hù)的氨基酸添加到所述游離氨基末端，然后使所述氨基酸脫保護(hù)，以產(chǎn)生新的游離氨基末端；和i)任選重復(fù)h) —次或多次。本發(fā)明進(jìn)一步提供合成包含兩個(gè)重疊分子內(nèi)橋的分子內(nèi)橋連多肽的方法，所述方法包括a)讓下式的第一個(gè)差異保護(hù)的正交分子內(nèi)橋的游離羧基末端與固相支持體或任選與固相支持體結(jié)合的氨基酸或多肽的游離氨基末端共價(jià)結(jié)合，
權(quán)利要求
1. 一種合成包含兩個(gè)重疊分子內(nèi)橋的分子內(nèi)橋連多肽的方法，所述方法包括 a)除去下式的第一個(gè)差異保護(hù)的正交分子內(nèi)橋中的保護(hù)基E，以形成游離氨基末端
2.權(quán)利要求1的方法，其中R為-C(O)-O-J,其中J為保護(hù)基，將所述保護(hù)基在不同于 D、E和G的反應(yīng)條件下選擇性地除去。
3.權(quán)利要求1的方法，其中R為-H。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述氨基末端保護(hù)基選自BoC、TroC、Alloc、ivDde.Cbz和 Fmoc ο
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述羧基末端保護(hù)基選自芴基甲酯、甲酯、苯甲酯、烯丙基酯和Tce酯。
6.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括以任何次序并以任何重復(fù)次數(shù)的一個(gè)或多個(gè)以下步驟a)讓所述分子內(nèi)橋連多肽的羧基末端與包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽鏈偶聯(lián)；b)讓所述分子內(nèi)橋連多肽的羧基末端與包含分子內(nèi)橋的肽鏈偶聯(lián)；c)讓所述分子內(nèi)橋連多肽的氨基末端與包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽鏈偶聯(lián)；和d)讓所述分子內(nèi)橋連多肽的氨基末端與包含分子內(nèi)橋的肽鏈偶聯(lián)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述包含兩個(gè)重疊分子內(nèi)橋的分子內(nèi)橋連多肽為羊毛硫抗生素或其類似物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述包含兩個(gè)重疊分子內(nèi)橋的分子內(nèi)橋連多肽為MU1140或其類似物。
全文摘要
本發(fā)明提供合成包含至少一個(gè)分子內(nèi)橋的分子內(nèi)橋連多肽的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供合成包含兩個(gè)分子內(nèi)橋的分子內(nèi)橋連多肽的方法，其中所述兩個(gè)分子內(nèi)橋形成兩個(gè)重疊環(huán)、兩個(gè)串聯(lián)環(huán)或兩個(gè)嵌入環(huán)。本發(fā)明亦提供用于合成包括乳鏈菌肽A在內(nèi)的羊毛硫抗生素的方法。另外，本發(fā)明提供通過本文所公開的方法合成的分子內(nèi)橋連多肽和差異保護(hù)的正交羊毛硫氨酸。
文檔編號(hào)C07K1/06GK102405227SQ201080015931
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月28日
發(fā)明者A·瓦庫(kù)倫科, J·D·希爾曼, K·基里琴科 申請(qǐng)人:奧潔克公司