S-腺苷甲硫氨酸合成酶制劑、及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開涉及生物化學(xué)領(lǐng)域;具體而言涉及s-腺苷甲硫氨酸合成酶酶制劑及其生產(chǎn) 方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] S-腺苷甲硫氨酸合成酶（以下簡稱MAT)(EC 2.5.1.6)是生物體內(nèi)一種非常重要的 酶。在有Mg2+和K+存在的情況下，它可以催化L-Met與ATP反應(yīng)，生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM)。 SAM是生物體內(nèi)重要的中間代謝產(chǎn)物，參與體內(nèi)多種生化反應(yīng)。S-腺苷甲硫氨酸合成酶是一 種重要的原料酶。
[0003] 現(xiàn)有的S-腺苷甲硫氨酸合成酶生產(chǎn)方法主要采用酵母系統(tǒng)（參見1-4)，包括畢赤 酵母和釀酒酵母。這種方法的缺點(diǎn)主要是生產(chǎn)過程相對(duì)原核表達(dá)體系來說比較復(fù)雜，產(chǎn)量 較低，同時(shí)成本高。這最終導(dǎo)致MAT的生產(chǎn)成本提高。因此，本領(lǐng)域當(dāng)中仍然需要一種成本更 有效的方法來生產(chǎn)高純度的MAT。
[0004] 目前的臨床檢驗(yàn)中，對(duì)同型半胱氨酸(HCY)的檢測以酶循環(huán)法為主導(dǎo)地位?，F(xiàn)有技 術(shù)的循環(huán)酶法檢測試劑盒有兩種:一種為甲基轉(zhuǎn)移酶和水解酶的循環(huán)酶法;另一種為胱硫 醚循環(huán)酶法。循環(huán)酶法簡便易行，已經(jīng)在臨床廣泛采納。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中，采用酶循環(huán)法測定HCY的檢測試劑，包括但不限于如下文獻(xiàn)中所報(bào)道 的：CN104140996A;CN104630324A ;CN104198726A;張傳寶等人，對(duì)循環(huán)酶法同型半胱氨酸測 定試劑盒的評(píng)價(jià)，中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006;葉余輝，循環(huán)酶法測定血清同型半胱氨酸試劑 盒的評(píng)價(jià)，中國醫(yī)藥指南，2013;王興寧等人，循環(huán)酶法測定同型半胱氨酸試劑盒評(píng)價(jià)，標(biāo)記 免疫分析與臨床，2014。
[0006] 然而，胱硫醚循環(huán)酶法缺陷在于易受人體內(nèi)源的胱硫醚干擾。甲基轉(zhuǎn)移酶和水解 酶的循環(huán)酶法不受人體內(nèi)源胱硫醚的干擾，但是依然存在穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。因此，本領(lǐng)域依 然需要提供一種更加改進(jìn)的循環(huán)酶法檢測試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 根據(jù)本公開的一方面，提供一種酶制劑，其含有按質(zhì)量計(jì)不低于90%的S-腺苷甲 硫氨酸合成酶；例如純度不低于91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 99.5 %的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
[0008] 在本申請(qǐng)的上下文中，純度表征了物質(zhì)含雜質(zhì)的程度，雜質(zhì)越少，純度越高。對(duì)于 蛋白質(zhì)純度的測定允許采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法(包括現(xiàn)在的以及未來的測定 方法），包括但不限于電泳法、色譜法。在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)中MAT酶制劑的純度是通 過電泳法所確定的純度。具體而言，在電泳法中，將樣本上樣于凝膠中進(jìn)行電泳，然后對(duì)凝 膠進(jìn)行染色，將代表著MAT的條帶的染色強(qiáng)度和全部條帶的染色強(qiáng)度進(jìn)行比較，通過所獲得 的比例確定MAT在酶制劑中的純度。
[0009] 在另一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)MAT酶制劑的純度是通過色譜法所確定的純度。例 如，將樣本上樣于色譜柱上，當(dāng)組分流出色譜柱時(shí)通過紫外檢測信號(hào)，將代表著MAT的色譜 峰面積和全部色譜峰面積進(jìn)行比較，通過所獲得的比例確定MAT在酶制劑中的含量。
[0010]在一些實(shí)施方式中，所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0011] MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDΙΕΕITRNTVREIG YVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRK NGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRF VIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEP TSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDLLHPIYKETAAYGHFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK (SEQ ID NO.1)〇
[0012] 本公開的酶制劑，在7天37°C加速穩(wěn)定性測試下，其酶活性不低于初始酶活性（BP 37°C加速穩(wěn)定性測試初始時(shí)的酶活性)的95%。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，本公開的酶制劑允許制備成液體或干粉形式;如為了便于保 存和運(yùn)輸，可以制成凍干粉形式。
[0014] 根據(jù)本公開的一方面，提供一種S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表達(dá)載體，其包含如SEQ ID N0:2所示的核苷酸和pET載體。pET載體含有強(qiáng)T7啟動(dòng)子，不被大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別。 在無誘導(dǎo)劑的情況下，幾乎沒有表達(dá)。在有誘導(dǎo)劑（如IPTG或Lac)的情況下，目的基因可以 得到高水平的表達(dá)。載體上包含有抗生素標(biāo)記(如Kan和Amp標(biāo)記)和熒光標(biāo)記等多種常用的 檢測標(biāo)記，有利于重組質(zhì)粒的篩選。在一些實(shí)施方式中，pET載體是pET41a載體。載體的多克 隆位點(diǎn)上還含有多種限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。環(huán)形的質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以得到線性質(zhì)粒， 與同樣酶切的基因片段具有相同的粘性末端，兩者連接后即可得到重組質(zhì)粒。
[0015] SEQ ID N0.2如下所示：
[0016] ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGC CGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTT TAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGC TATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACAT CAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTA ATGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAA AACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGG TATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAG AGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTC GTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCG TCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCG CGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCG ACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTT CGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTC ACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAG〇
[0017] 在一些實(shí)施方式中，SEQ ID N0:2所示的核苷酸插入到pET41a質(zhì)粒的Ndel和Xhol 位點(diǎn)之間。
[0018] 根據(jù)本公開的一方面，提供一種表達(dá)宿主，其包含根據(jù)本公開的s-腺苷甲硫氨酸 合成酶的表達(dá)載體;其中所述宿主為大腸桿菌，包括但不限于JM109(DE3)、BL21 (DE3)、DH5a 或T0P10。在一些實(shí)施方式中，是大腸桿菌BL21(DE3)。
[0019] 根據(jù)本公開的一方面，提供一種S-腺苷甲硫氨酸合成酶的生產(chǎn)方法，包括步驟：
[0020] 1)提供編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的多核苷酸，其中所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶 的氨基酸序列是SEQ ID N0:1;優(yōu)選地，所述多核苷酸的序列包含SEQ ID N0:2;
[0021] 2)將多核苷酸插入到pET41a質(zhì)粒的Ndel和Xho頂每切位點(diǎn)之間，構(gòu)建表達(dá)載體；
[0022] 3)將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，獲得表達(dá)宿主；
[0023] 4)對(duì)所述表達(dá)宿主進(jìn)行補(bǔ)料分批式發(fā)酵；
[0024] 5)收集發(fā)酵所得的菌體；
[0025] 6)將所述菌體破碎，收集上清；
[0026] 7)通過親和層析，從所述上清中純化所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶；
[0027] 8)獲得S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
[0028] 將外源核酸轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的方式有多種，如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化在基因工程中 是將質(zhì)?；虿《据d體引入宿主細(xì)胞的一種重要的手段，常見的有氯化鈣法化學(xué)轉(zhuǎn)化、優(yōu)選 電擊轉(zhuǎn)化和高壓電擊轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，利用氯化鈣法化學(xué)轉(zhuǎn)化將所 述表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)S-腺苷甲硫氨酸合 成酶的表達(dá)宿主。
[0029] 大腸桿菌的培養(yǎng)基中通常含有其生長所需的碳源、氮源、能源、生長因子、無機(jī)鹽 和水，即微生物生長所需的六大營養(yǎng)要素。常見的培養(yǎng)基有LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基 (每升培養(yǎng)基中含1 〇g胰化蛋白胨，5g酵母提取物、10g NaCl和15g瓊脂糖，pH 7.0)、肉湯培 養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基中含l〇g胰化蛋白胨，3g牛肉膏和5g NaCl，pH 7.4)、TB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng) 基中含12g胰化蛋白胨，24g酵母提取物，4ml甘油，17mmol KH2P〇4和72mmolK2HP〇4)、M9培養(yǎng) 基(每升培養(yǎng)基含〇·5g NH4CI、3·0g Na2HP〇4、1 ·5g KH2P〇4、lmmol MgS04、0· 1 %w/v葡萄糖和 50mmol CaCl2，pH7.4)等。在一些實(shí)施方式中，在表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化