一種dna亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸甲基化轉(zhuǎn)化及純化領(lǐng)域，涉及一種DNA在恒溫條件、變性劑及DNA 保護(hù)試劑下，使用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA，并使用純化試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化DNA純化，并應(yīng)用于各類分子 生物學(xué)研究。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲基化是指從活性甲基化合物（如S-腺苷基甲硫氨酸）上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他 化合物的過(guò)程。最常見(jiàn)的甲基化修飾有DNA甲基化和組蛋白甲基化，本發(fā)明所涉及為DNA甲 基化。
[0003] DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷 甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基上的化學(xué)修飾過(guò)程。DNA甲基化 一般發(fā)生在CpG位點(diǎn)（胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤位點(diǎn)，S卩DNA序列中胞嘧啶后緊連鳥(niǎo)嘌呤的位 點(diǎn)）。經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。人類基因中約80%-90%的CpG位 點(diǎn)已被甲基化，但是在某些特定區(qū)域，如富含胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤的CpG島則未被甲基化。這與 包含所有廣泛表達(dá)基因在內(nèi)的56%的哺乳動(dòng)物基因中的啟動(dòng)子有關(guān)。1 %-2%的人類基因 組是CpG群，并且CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比。DNA甲基化是一種表觀(epigenetic)修飾， 它在不改變DNA序列的情況下，對(duì)個(gè)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、基因表達(dá)模式以及基因組的穩(wěn)定性起 到重要的調(diào)控作用，并且這種修飾在發(fā)育和細(xì)胞增殖的過(guò)程中是可以穩(wěn)定傳遞的。近年來(lái) 的大量研究表明，DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細(xì)胞癌變有著密切的聯(lián)系。
[0004] 目前研究DNA甲基化的方法有很多種，但都需要經(jīng)過(guò)DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，再運(yùn)用 各種檢測(cè)手段進(jìn)行相關(guān)研究。DNA在亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化過(guò)程中會(huì)使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿 嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不會(huì)被轉(zhuǎn)化。因此，可以結(jié)合NGS、MSP、HRM等方法來(lái)檢測(cè)分析DNA序 列哪些位點(diǎn)發(fā)生甲基化。
[0005]亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的原理非常簡(jiǎn)單，目前的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化基本步驟分為:DNA的分離純 化，氫氧化鈉變性、亞硫酸鹽變溫轉(zhuǎn)化及脫磺酸基和脫鹽。但是亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的主要問(wèn)題是 需要首先對(duì)需要轉(zhuǎn)化的核酸進(jìn)行氫氧化鈉變性，而后進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)化及變溫過(guò)程，且需 要?dú)溲趸c溶液進(jìn)行脫磺酸基。在此過(guò)程中，會(huì)導(dǎo)致DNA的嚴(yán)重降解及片段化。除了DNA降解 問(wèn)題，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA純化方法沒(méi)有較好的解決，目前商品化的試劑盒基本都是采用 離心柱方法進(jìn)行產(chǎn)物純化，并且需要carrierRNA，同時(shí)需要多步洗滌過(guò)程，步驟過(guò)多而造 成DNA損耗高、提取效率降低，而且此方法需要離心機(jī)，難于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作且純化效率低、 操作繁瑣、產(chǎn)率低。
[0006]因此，基于目前表觀遺傳學(xué)的快速發(fā)展，以及目前的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方法及純化方 法的一些問(wèn)題，本發(fā)明對(duì)轉(zhuǎn)化及純化方法進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，使DNA轉(zhuǎn)化能夠在70-90度范圍 進(jìn)行轉(zhuǎn)化45-90min，并采用磁珠法對(duì)轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)行純化，能夠得到高轉(zhuǎn)化率、高質(zhì)量及高純 度的DNA，并有利于甲基化研究的全自動(dòng)化及標(biāo)準(zhǔn)化操作，用于后續(xù)分子生物學(xué)研究，尤其 臨床分子診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方 法，該方法能在恒溫條件下（70-90°C)、同時(shí)在變性劑及DNA保護(hù)劑存在下進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn) 化并對(duì)轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)行純化，并結(jié)合簡(jiǎn)便的磁珠法純化方法，能夠快速得到高轉(zhuǎn)化率、高質(zhì)量、 高純度的DNA，本發(fā)明的方法有利于甲基化研究的全自動(dòng)化及標(biāo)準(zhǔn)化操作。
[0008] 本發(fā)明涉及的DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方法，包括如下步驟：
[0009] (1)在離心管中加入20-60ul的待處理DNA;
[0010] (2)加入85-100ul轉(zhuǎn)化溶液，再加入15-35ul保護(hù)溶液，混勻；
[0011] (3)將離心管置于70-90°C恒溫金屬浴中45-90min;
[0012] (4)冷卻至室溫，向其中加入300-600ul結(jié)合液及5-20ul磁珠溶液，混勻，室溫放置 l〇-20min；
[0013] (5)將離心管置于磁力架上2-5min，待磁珠分離后，棄去上清液；
[0014] (6)加入0.5-lml洗滌液，充分混勻磁珠，然后置于磁力架上2-5min，待磁珠分離 后，棄去上清液；
[0015] (7)在磁力架上靜置l-5min，棄去上清液；
[0016] (8)再加入40-100ul洗脫液，充分混勻后，20-65°C靜置5-10min;
[0017] (9)再將離心管置于磁力架上l-2min，待磁珠分離后，轉(zhuǎn)移上清液至一新的無(wú) DNase與RNase酶離心管中，-20度保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 上述技術(shù)方案中，所述的轉(zhuǎn)化溶液為:含1-3MA組分和10-800mMB組分的水溶液， pH5.0-5.5，其中A組分為重亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫銨中至少一種，B 組分為尿素、甲酰胺、、二甘醇二甲醚、異硫氰酸胍中的至少一種；
[0019] 所述的保護(hù)溶液為:含50-700mMC組分和10-200mMD組分的水溶液，pH5.0-6.0， 其中C組分為氫醌、三烯丙基異氰脲酸酯、水溶性維生素C、四乙烯五胺五鹽酸鹽中的至少一 種，D組分為重亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫銨中的一種；
[0020] 所述的結(jié)合液為:含0.5-6ME組分、10-500mMF組分和體積濃度為10-50%G組分 的水溶液，pH5-7,其中E組分為異硫氰酸胍、鹽酸胍、高氯酸鈉、碘化鈉中至少一種，F(xiàn)組分 為Tris-HCl和HEPES中的至少一種，G組分為異丙醇、無(wú)水乙醇中至少一種；
[0021] 所述的洗滌液為:含0.5-3MΗ組分和體積濃度為10-70%1組分的水溶液，pH5-7， 其中Η組分為異硫氰酸胍、鹽酸胍、高氯酸鈉中至少一種，I組分為異丙醇和無(wú)水乙醇中至少 一種；
[0022] 所述的洗脫液為無(wú)DNase與RNase酶無(wú)菌水或tris緩沖液或ΤΕ緩沖液;所述的tris緩沖液為10mM的tris-HCl，pH7·5-8·5，所述的TE緩沖液中含10mM的tris-HCl和lmM的EDTA， pH7·5-8·5〇
[0023] 所述的磁珠溶液為含濃度為50mg/ml納米磁性顆粒的水溶液，具體為超順?biāo)难趸?三鐵或超順三氧化二鐵顆粒，且外表由表面修飾有羥基或羧基的二氧化硅包被。
[0024] 本發(fā)明涉及的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方法，其可應(yīng)用于脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)化及后續(xù) 純化，所純化的轉(zhuǎn)化DNA可用于各類分子生物學(xué)檢測(cè)，尤其為臨床分子診斷。
[0025]本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0026] 1、本發(fā)明涉及的甲基化轉(zhuǎn)化試劑，不同于現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化方法，不需要對(duì)核酸進(jìn)行前 期的氫氧化鈉變性處理，而且能在恒溫條件下高效進(jìn)行變性、轉(zhuǎn)化且不降解及片段化DNA， 整個(gè)轉(zhuǎn)化時(shí)間只需要45-90min;同時(shí)可以使用恒溫金屬浴進(jìn)行相關(guān)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，而不同于 市面上商品化試劑需要價(jià)格昂貴的PCR儀進(jìn)行變溫轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)間短、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作 更簡(jiǎn)便。
[0027] 2、本發(fā)明涉及的磁珠法純化試劑，適用于甲基化核酸轉(zhuǎn)化后的核酸純化，利用高 鹽低pH值進(jìn)行核酸的分離純化，再通過(guò)低鹽高pH值進(jìn)行洗脫，具有高純度、高回收效率的特 點(diǎn)，并且在整個(gè)純化過(guò)程中不使用目前市場(chǎng)上均采用的氫氧化鈉進(jìn)行去磺化步驟，操作更 簡(jiǎn)便，更能節(jié)省整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間。而且整個(gè)純化過(guò)程也不需要carrierRNA，且能在常溫 下進(jìn)行純化操作，無(wú)需任何高溫孵育，同時(shí)結(jié)合一種洗滌液，只進(jìn)行一次洗滌過(guò)程得到高純 度的核酸，最后的洗脫也可以在常溫下進(jìn)行洗脫;具有操作簡(jiǎn)便、提高提取效率和提取純度 的優(yōu)點(diǎn)。
[0028] 3、本發(fā)明涉及的DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化的方法，將核酸上游的恒溫轉(zhuǎn)化及其下 游的磁珠分離純化有效結(jié)合起來(lái)，有利于甲基化研究的全自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化操作；
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為采用本發(fā)明方法與Qiagen商品化試劑盒方法來(lái)轉(zhuǎn)化及純化甲基化人基因組DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)圖；
[0030] 圖2為采用本發(fā)明方法與Qiagen商品化試劑盒方法來(lái)轉(zhuǎn)化及純化未甲基化基因組 DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，實(shí)施例中所涉及的百分含量均指體積濃 度。
[0032] 實(shí)施例1不同轉(zhuǎn)化溫度的對(duì)比
[0033]甲基化人基因組的獲取:采用QIAGEN商品化血液人基因組提取試劑盒提取人基因 組DNA，然后使用NEB公司的SssI甲基化轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行甲基化處理，具體操作按廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行，甲基化處理結(jié)束后使用天根的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)甲基化處理的DNA進(jìn)行純化，純化 后的DNA置于-20度冰箱備用。
[0034]本發(fā)明的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及純化具體實(shí)施步驟：
[0035] 1、在0.2ml離心管中加入20ul的待處理DNA(甲基化DNA或未甲基化DNA)，設(shè)置3份。 [0036] 2、每份分別加入85ul轉(zhuǎn)化溶液，再加入35ul保護(hù)溶液，混勻。
[0037] 3、將3份離心管分別置于70°C、80°C、90°C恒溫金屬浴中60min。
[0038] 4、冷卻至室溫；
[0039] 5、將轉(zhuǎn)化后的DNA分別轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，再分別加入300ul結(jié)合液、10ul磁珠 溶液，混勻，室溫放置lOmin;
[0040] 6、將離心管置于磁力架上2min，待磁珠分離后，棄去上清液；
[00411 7、加入lml洗滌液，充分混勻磁珠，然后置于磁力架上2min，待磁珠分離后，棄去上 清液；
[0042] 8、在磁力架上靜置lmin，棄去上清液；
[0043] 9、加入60ul洗脫液，充分混勾后，置于室溫5min;
[0044] 10、再將離心管置于磁力架上lmin，待磁珠分離后，轉(zhuǎn)移上清液至一新的無(wú)DNase 與RNase酶離心管中，-20度保存?zhèn)溆茫?br>[0045] 所述轉(zhuǎn)化溶液為含1.5M重亞硫酸鈉，1.5M亞硫酸氫鈉，10mM甲酰胺的水溶液， pH5.0〇
[0046] 所述的保護(hù)溶液為含50mM氫醌，100mM三烯丙基異氰脲酸酯和20mM亞硫酸氫鈉的 水溶液，PH5.0。
[0047] 所述結(jié)合液為含3.5M異硫氰酸胍，0.5M碘化鈉，100mMTris-HCl，30%異丙醇的水 溶液，PH5.0。
[0048] 所述洗滌液為含2.5Μ鹽酸胍，50 %無(wú)水乙醇的水溶液，ρΗ7.0。
[0049] 所述洗脫液為含10mMTris-HCl的水溶液，ρΗ8.5。
[0050] 三種不同溫度轉(zhuǎn)化方法得到的DNA(依次記為Α、Β、C)采用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行甲基化 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0051] 表 1
[0053]可以看出，在不同轉(zhuǎn)化溫度方法上，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法，使用MSP引物檢測(cè)甲基 化情況，各組的ct值基本相當(dāng)，所以可以驗(yàn)證本轉(zhuǎn)化試劑在70-90度溫度下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn) 化效率一致，，相對(duì)于傳統(tǒng)的變溫方法而言，本發(fā)明采用恒溫的方法更簡(jiǎn)單，易操作，能使用 便宜、簡(jiǎn)便恒溫儀器進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。
[0054] 實(shí)施例2不同純化試劑純化DNA效果對(duì)比
[0055]甲基化人基因組的獲取：同實(shí)施例