一種快速測定脫氧核糖核酸甲基化率的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明是一種快速測定脫氧核糖核酸(DNA)甲基化率的方法，涉及重亞硫酸鹽轉 化和酶聯(lián)免疫反應，屬于遺傳學和分子生物學領域。
【背景技術】
[0002] DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸上的甲基在甲基化轉移酶的作用下轉移到DNA胞 嘧啶或腺嘌呤上，從而對DNA進行修飾，進而發(fā)生一系列的表觀修飾。DNA甲基化是表觀遺傳 學的重要組成部分，普遍存在于生物界中，是目前研究的熱點之一。植物細胞中，DNA甲基化 主要發(fā)生在CpG，CpNpG和CPNPN三種核苷酸序列中胞嘧啶上。
[0003]目前測定目的基因DNA序列甲基化率主要是利用重亞硫酸鹽轉化，再通過克隆測 序的方法來進行。該方法成本高，周期長，存在改進的空間。
[0004] 為了更加快速、經(jīng)濟、準確的測定目的基因DNA序列甲基化比例，我們發(fā)明了一種 新方法，并用這種方法測定了BrSPll-S?基因啟動子區(qū)域兩個位點胞嘧啶甲基化水平。在這 一技術中，我們只用24h就完成相關測定，并且本方法成本相較重亞硫酸鹽轉化-克隆測序 法更低。這種快速測定目的基因DNA序列位點甲基化比例的新技術，對于研究、分析DNA甲基 化形成和調(diào)控具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種快速、經(jīng)濟、準確測定目的基因DNA甲基化比率的新方法 論。
[0006] 本發(fā)明是通過重亞硫酸鹽轉化、序列擴增、酶聯(lián)免疫反應檢測三步法來測定目的 基因DNA甲基化率，其過程是包括重亞硫酸鹽轉化、序列擴增、探針雜交(采用檢測探針和競 爭探針同時雜交提高檢測精度)和探針檢測四部分。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術方案是：
[0008] -種快速測定脫氧核糖核酸甲基化率的方法，包括下列步驟：
[0009] 1)引物和探針合成
[0010] 根據(jù)目的基因序列，設計引物和探針，正向引物用生物素標記;所述探針包括甲基 化序列的檢測探針及競爭探針，非甲基化序列的檢測探針及競爭探針;檢測探針用地高辛 標記；
[0011] 2)雜交液配置：
[0012] 含有甲基化序列探針雜交緩沖液:5倍SCC緩沖液，0.3 %Tween-20，lOpmol甲基化 序列檢測探針，lOOpmol甲基化序列的競爭探針；
[0013] 非甲基化序列探針雜交緩沖液:5倍SCC緩沖液，0.3 %Tween-20，lOpmol非甲基化 序列檢測探針，lOOpmol非甲基化序列的競爭探針；
[0014] 3)DNA甲基化比例測定：
[0015]a)解雙鏈的DNA經(jīng)重亞硫酸鹽轉化處理，
[0016] b)采用步驟1)中設計的引物，以步驟a)轉化后DNA作為模板進行PCR擴增；
[0017] c)雜交:將得到的PCR產(chǎn)物分成兩份，分別與鏈酶親和素包裹的磁力球結合，加入 50μ1變性溶液(0.5mol/LNaOH，10mmol/LEDTA)JBST緩沖液清洗，然后分別加入200μ1含 有甲基化序列探針雜交緩沖液和非甲基化序列探針雜交緩沖液，50°C雜交2h。
[0018] d)信號測定:利用酶標儀在405nm檢測反應顏色濃度，根據(jù)甲基化和非甲基化的顏 色濃度比值，計算出DNA甲基化百分比。
[0019] 做為一個具體的實例，操作如下：
[0020] 1 )DNA剪切:500yg基因組DNA與限制性內(nèi)切酶反應8-16h;
[0021] 2)DNA回收:利用2.5倍100 %酒精沉淀30min，離心；用70 %酒精沉淀兩次。瞭干。
[0022] 3)DNA解雙鏈：用3NNaOH在37°C反應30min。
[0023] 4)重亞硫酸鹽轉化:加入尿素/亞硫酸氫鈉和對二苯酚，利用PCR儀轉化，轉化程序 為 95°〇303,55°(315111丨11，循環(huán)30次，然后55°(31511。
[0024] 5 )DNA回收:利用DNA回收試劑盒，回收DNA
[0025] 6)重亞硫酸鹽去除：3NNaOH在37°C反應15min
[0026] 7 )DNA清洗:加入Ιμπι?糖原，然后加入酒精清洗兩遍，溶于0.1倍TE緩沖液。
[0027] 8)引物合成:根據(jù)目的序列設計引物，正向引物用生物素標記。
[0028] 9)PCR擴增：反應體系為DNA5ul;正向引物（10pmol/ul)2·5ul;反向引物（lOpmol/ ul)2.5ul；Promegamastermix25ul；NucleaseFreeH2O15ul〇
[0029] 10)雜交:每5μ1PCR產(chǎn)物添加100μ1PBST緩沖液和50yg鏈酶親和素包裹的磁力球 (Roche，Germany)，94°CfP?育30min。加入50μ1 變性溶液（0 · 5mol/LNaOH, 10mmol/LEDTA)。 PBST緩沖液清洗，200μ1雜交緩沖液（5XSCC緩沖液，0 · 3 %Tween-20，lOpmol檢測探針， lOOpmol的競爭探針，檢測探針地高辛標記），50°C雜交2h。添加競爭探針（圖2)，可以解決序 列間非特異性結合問題，提高探針檢測的特異性。
[0030] 11)酶聯(lián)免疫檢測:含1%抗地高辛堿性磷酸酶的PBST緩沖液室溫孵育SOmiruPBST 清洗2次后，再與PNPP在37°C反應2h。3NNaOH終止反應。
[0031] 12)信號檢測：利用酶標儀在405nm檢測反應顏色濃度，根據(jù)濃度比值，計算出DNA 甲基化百分比。
[0032]有益效果
[0033] 1)本方法能夠快速、經(jīng)濟測定目標區(qū)域DNA位點甲基化率，可以用于研究DNA甲基 化調(diào)控機理；
[0034] 2)采用檢測探針和競爭探針同時雜交提高檢測精度，本方法具有準確度高特點， 可以用于與DNA甲基化相關遺傳病檢測，具有良好的前景。
【附圖說明】
[0035] 圖1DNA甲基化率測定流程圖。
[0036] 圖2DNA甲基化率測定原理圖。
[0037]圖3測定BrSPll-S6Q啟動子區(qū)域兩個位點胞嘧啶甲基化率結果。
【具體實施方式】
[0038] 測定基因DNA甲基化率，對于研究、分析DNA甲基化形成和調(diào)控具有重要意義，同時 也可以用于臨床遺傳疾病診斷分析。我們應用本發(fā)明的方法，經(jīng)濟、快速測定了目標位點甲 基化比例，為推廣該方法奠定基礎。
[0039] 以下實施例，僅為通過舉例來更好理解本發(fā)明，不是對本發(fā)明保護范圍的限制。
[0040] 本實例以白菜為實驗材料，過程如下，可參考圖1:
[0041 ] 1.在花前3天，收集化藥，分離絨氈層細胞，提取DNA備用；
[0042] 2.提取保存DNA，酶切，解除DNA雙鏈，準備重亞硫酸鹽轉化；
[0043] 3.將酶切后DNA加入尿素/亞硫酸氫鈉和對二苯酚，進行重亞硫酸鹽轉化；
[0044] 4.轉化后DNA作為模板，PCR擴增；引物序列為(5'-3'）
[0045] 正向：生物素標記-AGGAAAAGAAGAATTGGATGAGGAAGTTA(SEQIDNO. 1);反向： CTCCCACATCTARTRCTTTAAATTAACAAA(SEQIDNO.2)
[0046] 5.將得到的PCR產(chǎn)物分成兩份，分別與鏈酶親和素包裹的磁力球結合，加入50μ1變 性溶液(0.5mol/LNaOH，10mm〇l/LEDTA)JBST緩沖液清洗，然后分別加入200μ1含有甲基 化序列探針雜交緩沖液(5XSCC緩沖液，0.3%Tween-20，lOpmol檢測探針，lOOpmol的競爭 探針，檢測探針地高辛標記)和非甲基化序列探針雜交緩沖液，50°C雜交2h。位點1(圖3)甲 基化序列測定探針(5'-3'）：
[0047] 檢測探針：地高幸標記-CCTATTTTACACGTAAACAATTC(SEQIDN0.3)，
[0048] 競爭探針：CCTATTTTACACATAAACAATTC(SEQIDN0.4);
[0049] 位點1非甲基化序列測定探針(5'_3'）：
[0050] 檢測探針：地高幸標記-CCTATTTTACACATAAACAATTC(SEQIDN0.5)，
[0051 ]競爭探針：CCTATTTTACACGTAAACAATTC(SEQIDN0.6);
[0052] 位點2(圖3)甲基化序列測定探針(5' -3'）：
[0053] 檢測探針：地高幸標記-CACTTAATTGCCTATTTTACAC(SEQIDN0.7)，
[0054] 競爭探針：CACTTAATTACCTATTTTACAC(SEQIDN0.8);
[0055] 位點2非甲基化序列測定探針(5'_3'）：
[0056] 檢測探針：地高幸標記-CACTTAATTACCTATTTTACAC(SEQIDN0.9)，
[0057] 競爭探針：CACTTAATTGCCTATTTTACAC(SEQIDΝ0· 10)。
[0058] 6.含1 %抗地高辛堿性磷酸酶的TOST緩沖液室溫孵育30minJBST清洗2次后，再與 PNPP在37°C反應2K3NNaOH終止反應。
[0059] 7.利用酶標儀在405nm檢測反應顏色濃度，根據(jù)兩者顏色濃度比值，計算出DNA甲 基化百分比（圖3)。在S基因型為S6QS6Q，S22S6()，S8S6()三種植株中，利用克隆測序測定兩位點 (兩個C)甲基化率在三種植株中分別為6.7 %，70 %，73.3 % (位點1，第一個C); 14.2 %， 65.3%，66.7% (位點2,第二個C)。兩種方法測定結果接近。說明我們方法準確可靠。
【主權項】
1. 一種快速測定脫氧核糖核酸甲基化率的方法，其特征在于包括下列步驟： 1) 引物和探針合成： 根據(jù)目的基因序列，設計引物和探針，正向引物用生物素標記;所述探針包括甲基化序 列的檢測探針及競爭探針，非甲基化序列的檢測探針及競爭探針;檢測探針用地高辛標記； 2) 雜交液配置： 含有甲基化序列探針雜交緩沖液:5倍SCC緩沖液，0.3 %Tween-20，lOpmol甲基化序列 檢測探針，lOOpmol甲基化序列的競爭探針； 非甲基化序列探針雜交緩沖液:5倍SCC緩沖液，0.3 %Tween-20，lOpmol非甲基化序列 檢測探針，lOOpmol非甲基化序列的競爭探針； 3)DNA甲基化比例測定： a) 解雙鏈的DNA經(jīng)重亞硫酸鹽轉化處理， b) 采用步驟1)中設計的引物，以步驟a)轉化后DNA作為模板進行PCR擴增； c) 雜交:將得到的PCR產(chǎn)物分成兩份，分別與鏈酶親和素包裹的磁力球結合，加入變性 溶液;PBST緩沖液清洗，然后分別加入含有甲基化序列探針雜交緩沖液和非甲基化序列探 針雜交緩沖液，50°C雜交2h; d) 信號測定:利用酶標儀在405nm檢測反應顏色濃度，根據(jù)甲基化和非甲基化的顏色濃 度比值，計算出DNA甲基化百分比。
【專利摘要】本發(fā)明是涉及一種快速測定脫氧核糖核酸甲基化率的方法，屬于分子生物學及遺傳學領域。本發(fā)明主要是采用了新的DNA序列檢測方法。步驟主要包括引物和探針設計，重亞硫酸鹽轉化、序列擴增、探針雜交和探針檢測(采用檢測探針和競爭探針同時雜交提高檢測精度)和DNA甲基化率確定，在效率上遠遠高于目前的方法，時間短，價格也便宜，具有廣闊應用前景。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105463074
【申請?zhí)枴緾N201510796193
【發(fā)明人】王春雷, 劉正陽, 趙憲坤, 張盼盼, 高季平
【申請人】揚州大學
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年11月18日