專利名稱：抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療人體腫瘤的抗體，特別是用于抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的單鏈抗體及其制備方法。
腫瘤生長(zhǎng)依賴血管生成，抑制腫瘤血管生成可以有效地遏制腫瘤生長(zhǎng)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor VEGF)在誘導(dǎo)腫瘤血管生成過(guò)程中起著最關(guān)鍵的作用，因此，阻斷VEGF活性可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。在“Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesissuppresses tumor growth in vivo.”(Nature,1993；362(6423)841-844))中Kim等首次公開(kāi)了抗VEGF單克隆抗體可抑制荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)。但鼠源單抗易誘發(fā)人抗鼠抗體(HAMA)免疫反應(yīng)，難以用于臨床。在“Humanization of an anti-vascular endothelial factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumorsand other disorders.”(Cancer Res.1997；574593-4599)中Leonard等從分泌上述單抗的雜交瘤細(xì)胞株中克隆出抗體可變區(qū)基因。構(gòu)建了人-鼠嵌合抗體Fab，又通過(guò)計(jì)算機(jī)模建及定點(diǎn)突變方法，將Fab人源化．獲得低免疫源性，同時(shí)又保持原親本抗體生物學(xué)活性的人源化Fab，但Fab是一個(gè)異二聚體不適合于包涵大量表達(dá)，不易于構(gòu)建抗體融合蛋白。目前研究最多的是單鏈抗體(ScFv)，其優(yōu)越性在于可通過(guò)包涵體大量表達(dá)，易于基因工程操作，尤其易于構(gòu)建抗體融合蛋白。近來(lái)，美國(guó)重組DNA顧問(wèn)委員會(huì)(RAC)已批準(zhǔn)了2項(xiàng)用單鏈抗體來(lái)治療疾病的臨床試驗(yàn)。但至今尚未見(jiàn)有抗人VEGF單鏈抗體的報(bào)道。
本發(fā)明的目的正是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種分子量小、對(duì)腫瘤組織穿透力強(qiáng)，而自身免疫源性低的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單鏈抗體(ScFv)及其制備方法，該抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體通過(guò)其阻遏人體腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的高表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤血管生成的抗腫瘤生長(zhǎng)的目的。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體的基因及氨基酸序列為
60GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTGGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu120TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGGSer Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln ArgCDR1180CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TATPro Glu Gln Gly Leu Glu Tro Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr52aCDR2240GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TACAsn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr300CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCTGln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser82a 82b 82c360ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACCIle Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val ThrCDR3 100a100b100c100d100e100fGTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCGVal Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerLinker60GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACCAsp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr120ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AACIle Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn27a 27b 27e 27d CDR1180CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTTGln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu PheCDR2240GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CATGly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His300CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TACPro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro TyrCDR3
ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAAThr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys上述抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體含249個(gè)氨基酸，分子量為26648.1道爾頓，等電點(diǎn)為5.90，是由三部分組成，即抗體可變區(qū)輕、重鏈和連結(jié)肽。該三部分共同完成識(shí)別和結(jié)合抗原(VEGF)，發(fā)揮阻斷VEGF生物活性的作用。其三維結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)

圖1。
制備上述抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體的方法是將現(xiàn)有技術(shù)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方案、親水方案及抗原指數(shù)方案相結(jié)合，設(shè)計(jì)了以人VEGF189N端26個(gè)氨基酸殘基為模板的一段多肽，并在ABI431固相自動(dòng)合成儀(Applied-Biosystems PE公司，美國(guó))上合成，純度為97.4％。按常規(guī)方法建立了抗人VEGF合成肽單克隆抗體(MAb)雜交瘤細(xì)胞株(定名為E11)。將E11雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，重懸后接種于小鼠腹腔，12天后吸取腹水。而后采用快速批次吸附法純化鼠腹水中的抗人VEGF MAb，并采用超濾膜透析方式進(jìn)行濃縮。經(jīng)測(cè)定，抗人VEGF MAb含量為2.4mg/ml，屬IgG2b(γ,κ2b)。此MAb具備良好的抗原特異性和較高的抗原親和力，并能有效地抑制人頰癌BCaCD885和鼠肉瘤S180的血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)前述的生長(zhǎng)良好，能持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗人VEGF MAb的雜交瘤細(xì)胞株E11(體外培養(yǎng)半年)提取總RNA，分別針對(duì)VL和VH基因設(shè)計(jì)兩條和五條引物，而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆了MAb的可變區(qū)基因片段。用編碼親水性多肽接頭的DNA片段((GGGGS)3)將E11單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因連接，轉(zhuǎn)導(dǎo)入PET-15YV(Novagen公司)載體，而后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)而針對(duì)以包涵體(IBS)形式表達(dá)的抗人VEGF ScFv表達(dá)系統(tǒng)[PET-15YV/BL21(DE3)]、包涵體的分離、變性與復(fù)性等制備環(huán)節(jié)進(jìn)行生產(chǎn)工藝改進(jìn)。獲得了占菌體總蛋白表達(dá)量52.9％的包涵體高效表達(dá)和48mg/ml的高產(chǎn)率?？谷薞EGF ScFv采用Westemblot，間接ELISA法和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法證實(shí)能分別與VEGF合成肽、VEGF165特異性結(jié)合，反應(yīng)滴度分別達(dá)8×10-3和5×10-5；且其對(duì)VEGF的親和力與原親本單克隆抗體相近。同時(shí)，還測(cè)定出抗人VEGF ScFv的重要屬性之一－等電點(diǎn)為5.90。還對(duì)抗人VEGF單鏈抗體對(duì)移植頰癌組織穿透力及在荷人頰癌裸鼠血清中滯留的變化分別與抗人VEGF單克隆抗體(MAb)進(jìn)行相應(yīng)比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗人VEGF ScFv頰癌組織穿透力(速度)大大高于抗人VEGF MAb(48∶1)；其1小時(shí)內(nèi)的血清清除率約為抗人VEGF MAb的10倍。這些結(jié)果說(shuō)明抗人VEGF ScFv作為一種成功的小分子基因工程抗體，具有對(duì)腫瘤組織穿透力強(qiáng)而在血清中滯留時(shí)間短的特性，是一種理想的腫瘤免疫治療和放射免疫治療的抗體物質(zhì)及放射自顯影成像的理想載體，具有廣泛的用途。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1．分子量小，對(duì)實(shí)體瘤穿透力強(qiáng)；2．易于構(gòu)建抗體融合蛋白；3．適于包涵體大量表達(dá)；4．制備程序簡(jiǎn)單，易于操作，效率高；5．與抗原形成的抗原抗體復(fù)合物更易被消除，適合發(fā)揮抗體阻斷VEGF的作用；6．用于細(xì)胞內(nèi)免疫，可作為基因治療的一種方案；7．標(biāo)記核素，可用于免疫影像學(xué)診斷及治療；8．免疫源性小，減少HAMA反應(yīng)的可能性，并可進(jìn)一步人源化。
以下是說(shuō)明書(shū)附圖的圖面說(shuō)明圖1是本發(fā)明抗人VEGF單鏈抗體(ScFv)三維模建結(jié)構(gòu)圖。圖中黃色為抗原識(shí)別部位，綠色為骨架區(qū)，粉色為連接肽，Lignt Chain輕鏈；Heavy Chain重鏈；Linker連接肽。
圖2是本發(fā)明抗人VEGF單克隆抗體(MAb)對(duì)小鼠BCaCD885移植瘤的抑瘤作用。圖中1．生理鹽水組；2．MAb腹腔注射給藥組(100μg/d)；3．MAb瘤周皮下注射給藥組(200μg/d)。
圖3是本發(fā)明抗人VEGF單克隆抗體(MAb)對(duì)小鼠S180移植肉瘤的抑瘤作用。圖中1．生理鹽水組；2．MAb腹腔注射給藥組(100μg/d)；3．MAb腹腔注射給藥組(200μg/d)；4．MAb瘤周皮下注射給藥組(200μg/d)；5．5-Fu腹腔注射給藥組。
圖4是本發(fā)明VH VL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳。圖中AVH；BMarker，由下至上依次為657,(458,434),328,289,267bp CVL。
圖5是本發(fā)明重組質(zhì)粒PET15-YV酶切鑒定。圖中ANcoⅠ+NotⅠ+BamHⅠ切下VL及VH+Linker；BMarker。
圖6是本發(fā)明分泌表達(dá)質(zhì)粒PET15-YV的構(gòu)建。
圖7是本發(fā)明抗人VEGF單鏈抗體基因測(cè)序載體的構(gòu)建。
圖8是本發(fā)明PET15-YV的表達(dá)及純化15％SDS-PAGE結(jié)果。圖中A低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；BPET15-YV全菌；CPET15-YV上清；DPET15-YV包涵體。
圖9是本發(fā)明低分化頰癌組織VEGF免疫組化染色(ScFv)癌巢呈深棕色。
本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例1．人VEGF189合成肽的設(shè)計(jì)和制備將現(xiàn)有技術(shù)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方案、親水方案及抗原指數(shù)方案相結(jié)合，設(shè)計(jì)了以人VEGF189N端26個(gè)氨基酸殘基為模板的一段多肽，根據(jù)前三項(xiàng)綜合判斷，總結(jié)為表一，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)連續(xù)性表位，標(biāo)為P1(10-22),P2(27-36),P3(39-49),P4(66-75),P5(78-95),P6(103-112)。人VEGF189第75位氨基酸為谷氨酰胺，系糖基化位點(diǎn)，多糖可能掩蓋該位點(diǎn)，故P4可不考慮。為增加成功率，首選N-端的P1，因末端比中間更柔韌、更親水。結(jié)合VEGF二級(jí)結(jié)構(gòu)，21-25有一個(gè)β-轉(zhuǎn)角，因轉(zhuǎn)角常在已知蛋白質(zhì)和多肽中作識(shí)別位點(diǎn)，故結(jié)合肽應(yīng)設(shè)計(jì)為P10-25，肽段長(zhǎng)度與其抗原性呈正比，最終合成肽確定為N-端1-26殘基(26位系半胱氨酸，為與載體蛋白的共價(jià)結(jié)合點(diǎn))。以下為人VEGF189的氨基酸序列APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
表1
抗人VEGF合成肽在ABI431固相自動(dòng)合成儀(Applied-Biosystems PE公司，美國(guó))上合成，純度為97.4％。
實(shí)施例2.抗人VEGF合成肽單克隆抗體(MAb)雜交瘤細(xì)胞株的建立及抗人VEGF合成肽MAb的制備采用實(shí)施例1所制備的合成肽作為抗原，按常規(guī)方法建立了抗人VEGF合成肽單克隆抗體(MAb)雜交瘤細(xì)胞株(定名為E11)。將E11雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，重懸后接種于小鼠腹腔，12天后吸取腹水。而后采用快速批次吸附法純化鼠腹水中的抗人VEGF MAb，并采用超濾膜透析方式進(jìn)行濃縮。經(jīng)測(cè)定，抗人VEGF MAb含量為2.4mg/ml，屬IgG2b(γ,κ2b)。此MAb具備良好的抗原特異性和較高的抗原親和力，并能有效地抑制人頰癌BCaCD885和鼠肉瘤S180的血管生成和腫瘤生長(zhǎng)(見(jiàn)圖2、圖3)。
實(shí)施例3.抗人VEGF單鏈抗體(ScFv)的構(gòu)建、表達(dá)及活性鑒定在實(shí)施例1和實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，對(duì)前述的生長(zhǎng)良好，能持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗人VEGFMAb的雜交瘤細(xì)胞株E11(體外培養(yǎng)半年)提取總RNA，分別針對(duì)VL和VH基因設(shè)計(jì)兩條和五條引物，而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆了MAb的可變區(qū)基因片段?？谷薞EGF單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)核苷酸及其氨基酸推導(dǎo)序列如下60GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTGGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu120TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGGSer Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln ArgCDR1
180CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TATPro Glu Gln Gly Leu Glu Trp lle Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr52a CDR2240GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TACAsn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr300CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCTGln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser82a 82b 82c360ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACCIle Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val ThrCDR3 100a100b100c100d100e100fGTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCGVal Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerLinker60GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACCAsp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr120ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AACIle Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn27a 27b 27c 27d CDR1180CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTTGln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu PheCDR2240GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CATGly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His300CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TACPro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro TyrCDR3ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAAThr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
表2 用編碼親水性多肽接頭的DNA片段((GGGGS)3)將E11單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因連接，轉(zhuǎn)導(dǎo)入PET-15YV(Novagen公司)載體，而后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。
(1)抗人VEGF單鏈抗體(ScFv)的基因構(gòu)建根據(jù)輕、重鏈可變區(qū)的酶切圖譜及構(gòu)建載體PET-15S(含有E-tag)的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR引物(表2)中P5-P8。VH以P5、P6為引物，P6含連接肽序列。VL以P7-P8為引物，分別用已克隆的VH及VL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳純化回收。純化的VH及VL分別酶切、再純化后連接，最后用P5、P8行PCR擴(kuò)增，即得到ScFv全基因序列。
(2)抗人VEGF單鏈抗體(ScFv)的基因表達(dá)將ScFv及載體PET-15S分別用同一對(duì)酶(NcoⅠ,NotⅠ)進(jìn)行酶切，連接后轉(zhuǎn)化DH5α，菌液PCR挑選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒行酶切分析。將經(jīng)篩選的質(zhì)粒命名為PET15-YV，將PET15-YV轉(zhuǎn)化BL21(DE3)。挑選陽(yáng)性克隆。表達(dá)菌株的誘導(dǎo)培養(yǎng)、SDS-PAGE、超聲破菌、分別取上清及沉淀，確定表達(dá)產(chǎn)物的形式。稀釋法復(fù)性單鏈抗體。①包涵體的獲得5000×g，離心15分收集100ml菌體(1mM IPTG誘導(dǎo)，37℃培養(yǎng)3.0小時(shí))。以5ml GTE(0.3mmol/L蔗糖；25mmol/L Tris.HCL,pH8.0；25mmol/L EDTA)重懸，再次離心收菌，以3mlGTE重懸。加入溶菌酶(10mg/ml)400μl，顛倒混勻30分；加入100μl脫氧膽酸鈉(40mg/ml),30μl MgCl2(1mol/L),10μl DNaseⅠ(1mg/ml)，混勻至菌體由稠變稀。12000rpm離心10分，棄上清，沉淀用STET(0.1mol/L NaCl-10mmol/L This·HCl pH8.0),1mmol/L EDTA,0.5％Triton-X 100)洗滌3次，再用3.5mol/L尿素的TE溶液洗滌2次。5000×g離心5分棄沉淀；12000rpm離心10分棄上清。沉淀為包涵體，用于變性、復(fù)性。②變性、復(fù)性用1ml變性液(0.1mol/L Tris·HCl,pH8.0；6mol/L)鹽酸胍；2mmol/L EDTA；0.5％β-羥基乙醇)溶解包涵體，室溫放置2.0小時(shí)，30000×g離心15分，取上清，測(cè)定樣品的蛋白含量，用變性液將其濃度調(diào)整為10mg/ml。取上清1ml，快速加入到100ml的復(fù)性液(0.1mol/L Tris·HCl,pH8.0；0.5mol/L L-精氨酸，50μlmol/L CuSO4；2mmol/L EDTA)，10℃至少保溫24小時(shí)。③透析、濃縮將樣品裝入透析袋中，以2000ml透析液(0.1mol/L尿素；20mmol/L Tris·HCl,pH8.0；25mmol/L NaCl)于4℃透析12小時(shí)，并以磁棒攪伴之。再用PBST(PBS+1％Triton-X100)透析24小時(shí)。20％PEG20000(PBS配制)濃縮。
(3)抗人VEGF單鏈抗體(ScFy)的序列測(cè)定將獲正確表達(dá)帶的菌種，抽提質(zhì)粒PET15-YV，將其中的ScFv序列用一對(duì)酶切EcoRⅠ,XholⅠ)下，PUC19用EcoRⅠ及SalⅠ酶切，因XholⅠ與SalⅠ酶切的粘性末端互補(bǔ)，因此，即可將ScFy克隆入PUC19中，進(jìn)行全自動(dòng)雙向測(cè)序。
(4)抗人VEGF單鏈抗體(ScFv)的活性鑒定及免疫組化取頰癌組織標(biāo)本，分化程度較好(高、中分化)16例，分化程度差(低分化)4例，共20例。染色后約5μm的石蠟切片，脫蠟后先經(jīng)0.3％H2O2甲醇溶液浸泡30’，然后滴加正常羊血清，37℃下10’，一抗先后為ScFv復(fù)性原液及鼠Anti-E tag antibody，二抗為兔抗鼠-HRP，室溫反應(yīng)1小時(shí)后洗滌，以含有DAB及H2O2的底物液顯色，顯微鏡下棕色著染為陽(yáng)性，深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性。
經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果①E11可變區(qū)基因(VH,VL)的克隆及序列測(cè)定經(jīng)RT-PCR，VL及VH均得已擴(kuò)增，擴(kuò)增VH的3’端引物為GH4，瓊脂糖凝膠電泳顯示兩者的區(qū)帶位置分別在430及370左右，與預(yù)計(jì)大小相符。序列測(cè)定結(jié)果，VL基因全長(zhǎng)333bp，編碼111個(gè)氨基酸，歸屬小鼠輕鏈可變區(qū)基因第Ⅲ亞組。VH基因全長(zhǎng)369bp，編碼123個(gè)氨基酸，歸屬小鼠重鏈可變區(qū)基因Ⅱ(A)亞組。(見(jiàn)圖4)②抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體基因的構(gòu)建根據(jù)輕、重鏈的可變區(qū)基因序列設(shè)計(jì)引物P5-P8，分別對(duì)VL及VH進(jìn)行擴(kuò)增，其中重鏈可變區(qū)的邊接肽(GGGGS)3基因相連。因VH的3’端及VL的5’端均引入了BamHⅠ位點(diǎn)，經(jīng)T4連接酶連接，用P5,P8行PCR擴(kuò)增，即得到完整的ScFv全基因序列。電泳結(jié)果為760的條帶。將ScFv基因克隆表達(dá)載體PET-15(S)中，轉(zhuǎn)化之后挑陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒酶切鑒定(圖5)。鑒定結(jié)果表明，VH-linker-VL已連接并定向克隆在PET-15S中，命名為PET15-YV。PET15-YV的構(gòu)建如(見(jiàn)圖6)。
③抗人VEGF單鏈抗體基因的序列測(cè)定單鏈抗體基因序列測(cè)定載體的構(gòu)建見(jiàn)圖7。DNA自動(dòng)測(cè)序證明，獲得表達(dá)的PET15-YV中ScFv基因序列閱讀框架正確。
④抗人VEGF單鏈抗體基因的表達(dá)BL21(DE3)感受態(tài)經(jīng)含單鏈抗體基因的PET15-YV轉(zhuǎn)化，在0.2mmol/L IPTG終濃度的誘導(dǎo)下，主要以包涵體的形式獲得大量表達(dá)。包涵體占總蛋白的40％。SDS-PAGE顯示在接近分子量30KD處有一強(qiáng)表達(dá)帶(見(jiàn)圖8)。包涵體經(jīng)變性復(fù)性后，進(jìn)行透析、濃縮。
⑤抗人VEGF單鏈抗體的活性鑒定用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)包涵體復(fù)性產(chǎn)物對(duì)20例頰癌及正常組織的石蠟切片的特異反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果表明，ScFv對(duì)頰癌組織的特異性反應(yīng)與原親本抗體相同。除4例高分化標(biāo)本未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)外，余16例均為陽(yáng)性反應(yīng)，其中4例低分化標(biāo)本呈強(qiáng)陽(yáng)性。(見(jiàn)圖9)實(shí)施例4根據(jù)實(shí)施例1-3所得到的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體的基因及氨基酸序列為60GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTGGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu120TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGGSer Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg
CDR1180CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TATPro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr52a CDR2240GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TACAsn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr300CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCTGln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser82a 82b 82c360ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACCIle Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val ThrCDR3 100a100b100c100d100e100fGTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCGVal Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerLinker60GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT ACC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACCAsp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr120ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AACIle Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn27a 27b 27c 27d CDR1180CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTTGln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu PheCDR2240GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CATGly Val Pro Ala Arg Pro 5er Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His300CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TACPro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro TyrCDR3ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAAThr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys實(shí)施例5抗人VEGF單鏈抗體的三維結(jié)構(gòu)模建根據(jù)實(shí)施例4所得到的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體，其總長(zhǎng)度為249個(gè)氨基酸殘基。N-端為VH結(jié)構(gòu)域(123個(gè)殘基)，中間為連接區(qū)(15個(gè)殘基)，C-端為VL結(jié)構(gòu)域(111個(gè)殘基)。一級(jí)結(jié)構(gòu)序列為(劃線序列為連接區(qū))EVQLLESGAELVKPGASVKFSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGR
IDPRNGNTKYLGLNQGKATITATDSSNTAYQQLSSLTSEDTAVYYCARPSIYYGSSHSYFDVWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQFPASLSVFLGQRATISCRASQSVSTYGSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLEFGVPARFSGSGSGTDSTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELPYTFGGGTKLEIK抗體輕、重鏈三維結(jié)構(gòu)的模建主要利用Biosym的同源蛋白質(zhì)模建系統(tǒng)(homology)在SGI計(jì)算機(jī)圖形工作站上進(jìn)行。其主要步驟如下在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)(Brookhaven protein data bank,PDB)庫(kù)中搜索同源蛋白；用同源蛋白結(jié)構(gòu)疊加以確定結(jié)構(gòu)保守區(qū)(SCR區(qū))和結(jié)構(gòu)表面的回折部分(LOOP區(qū))；模建蛋白與同源蛋白序列聯(lián)配以確定模建蛋白的SCR區(qū)和LOOP區(qū)；安裝側(cè)鏈；對(duì)模建結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子力學(xué)及動(dòng)力學(xué)優(yōu)化；對(duì)模建結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理性驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)實(shí)施例4所得到的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體由三部分，即組成抗體可變區(qū)輕、重鏈和連結(jié)肽。該三部分共同完成識(shí)別和結(jié)合抗原(VEGF)，發(fā)揮阻斷VEGF生物活性的作用。其三維結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。
實(shí)施例6．抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體可做為模板，根據(jù)其核苷酸序列及氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)和三維空間構(gòu)型進(jìn)行改建(包括人源化方案)，成為腫瘤免疫治療及放射免疫治療的抗體物質(zhì)。
權(quán)利要求
1．一種抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體，其特征在于1．1抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單鏈抗體(ScFv)的基因及氨基酸序列為GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTGGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu120TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGGSer Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln ArgCDR1180CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TATPro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr52a CDR2240GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TACAsn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr300CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCTGln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser82a 82b 82c360ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACCIle Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val ThrCDR3 100a100b100c100d100e100fGTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCGVal Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerLinker60GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACCAsp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr120ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AACIle Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Mer His Trp Asn27a 27b 27c 27d CDR1180CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTTGln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu PheCDR2240GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CATGly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His300CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TACPro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro TyrCDR3ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAAThr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys1．2 抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體含249個(gè)氨基酸，分子量為26648.1道爾頓，等電點(diǎn)為5.90，1．3 上述抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體由三部分組成，即抗體可變區(qū)輕、重鏈和連結(jié)肽，該三部分共同完成識(shí)別和結(jié)合抗原(VEGF)，發(fā)揮阻斷VEGF生物活性的作用，其三維結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1，
2．一種獲得權(quán)利要求1所述的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體的制備方法其特征在于2．1 人VEGF189合成肽的設(shè)計(jì)和制備將現(xiàn)有技術(shù)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方案、親水方案及抗原指數(shù)方案相結(jié)合，設(shè)計(jì)了以人VEGF189N端26個(gè)氨基酸殘基為模板的一段多肽，根據(jù)前三項(xiàng)綜合判斷，并采用固相化學(xué)合成法在ABI431固相自動(dòng)合成儀(Applied-Biosystems PE公司，美國(guó))上合成，純度為97.4％，人VEGF189氨基酸序列為APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR2．2 抗人VEGF合成肽單克隆抗體(MAb)雜交瘤細(xì)胞株的建立及抗人VEGF合成肽MAb的制備采用2.1所制備的合成肽作為抗原，按常規(guī)方法建立了抗人VEGF合成肽單克隆抗體(MAb)雜交瘤細(xì)胞株(定名為E11)。將E11雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，重懸后接種于小鼠腹腔，12天后吸取腹水，而后采用快速批次吸附法純化鼠腹水中的抗人VEGFMAb，并采用超濾膜透析方式進(jìn)行濃縮，經(jīng)測(cè)定，抗人VEGF MAb含量為2.4mg/ml，屬IgG2b(γ,κ2b)，此MAb具備良好的抗原特異性和較高的抗原親和力，并能有效地抑制人頰癌BCaCD885和鼠肉瘤S180的血管生成和腫瘤生長(zhǎng)，2．3 抗人VEGF單鏈抗體(ScFv)的構(gòu)建、表達(dá)及活性鑒定在2．1和2．2的基礎(chǔ)上，對(duì)前述的生長(zhǎng)良好，能持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗人VEGF MAb的雜交瘤細(xì)胞株E11(體外培養(yǎng)半年)提取總RNA，分別針對(duì)VL和VH基因設(shè)計(jì)兩條和五條引物，而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆了MAb的可變區(qū)基因片段，用編碼親水性多肽接頭的DNA片段((GGGGS)3)將E11單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因連接，轉(zhuǎn)導(dǎo)入PET-15YV(Novagen公司)載體，而后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而針對(duì)以包涵體(IBS)形式表達(dá)的抗人VEGF ScFv表達(dá)系統(tǒng)[PET-15YV /BL21(DE3)]、包涵體的分離、變性與復(fù)性等制備環(huán)節(jié)進(jìn)行生產(chǎn)工藝改進(jìn)，獲得了占菌體總蛋白表達(dá)量52.9％的包涵體高效表達(dá)和48mg/ml的高產(chǎn)率，抗人VEGF單克隆抗體重鏈可變區(qū)核苷酸及其氨基酸推導(dǎo)序列如下60GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTGGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu120TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGGSer Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln ArgCDR1180CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TATPro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr52a CDR2240GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TACAsn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr300CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCTGln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser82a 82b 82c360ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACCIle Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val ThrCDR3 100a100b100c100d100e100fGTC TCC TCAVal Ser Ser抗人VEGF單克隆抗體輕鏈可變區(qū)核苷酸及其氨基酸推導(dǎo)序列如下60GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACCAsp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr120ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AACIle Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn27a 27b 27c 27d CDR1180CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTTGln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu PheCDR2240GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CATGly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His300CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TACPro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro TyrCDR3ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAAThr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體可作為放射免疫治療及放射自顯影成像的載體。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體可做為模板，根據(jù)其核苷酸序列及氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)和三維空間構(gòu)型進(jìn)行改建(包括人源化方案)，成為腫瘤免疫治療及放射免疫治療的抗體物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療人體腫瘤的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單鏈抗體(ScFv)及其設(shè)計(jì)與制備。制備了VEGF合成肽從而建立抗人VEGF單克隆抗體(MAb)雜交瘤細(xì)胞株。此MAb具有穩(wěn)定的生物學(xué)活性和明顯的抑瘤作用。對(duì)MAb可變區(qū)輕、重鏈基因進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增,用DNA片段進(jìn)行連接,構(gòu)建抗人VEGF ScFv基因。最終獲得ScFv的高效表達(dá),經(jīng)測(cè)定證實(shí)抗人VEGF ScFv分子量小、對(duì)腫瘤組織穿透力強(qiáng),免疫原性低,能阻遏腫瘤血管生成的抗腫瘤作用。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1299833SQ9911749
公開(kāi)日2001年6月20日 申請(qǐng)日期1999年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月30日
發(fā)明者王大章, 楊西川, 鄭光勇, 房思煉, 李揚(yáng) 申請(qǐng)人:華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所