結(jié)合SPARC的scFv的制作方法
【專利說明】結(jié)合SPARC的scFv
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00980153235. 1、申請(qǐng)日為2009年12月7日、發(fā)明名稱為"結(jié) 合SPARC的scFv"的中國發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 要求優(yōu)先權(quán)
[0003] 本申請(qǐng)要求2008年12月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/120, 228的優(yōu)先權(quán)，其全 部?jī)?nèi)容通過引用方式并入本文。
【背景技術(shù)】
[0004] 酸性的富含半胱氨酸的分泌蛋白（Secreted Protein, Acidic, Rich in Cysteines, SPARC)也被稱作骨粘連蛋白（osteonectin)，是人體內(nèi)表達(dá)的303個(gè)氨基酸的 糖蛋白。SPARC的表達(dá)在發(fā)育上受到調(diào)控，SPARC主要在正常發(fā)育或響應(yīng)于損傷而發(fā)生重塑 的組織中表達(dá)。參見，例如Lane et al.，F(xiàn)ASEB J. ,8,163-173(1994)。例如，在鼠、牛和人 胚胎的發(fā)育中的骨和牙齒（主要是成骨細(xì)胞、成牙質(zhì)細(xì)胞、軟骨膜的成纖維細(xì)胞）以及分化 中的軟骨細(xì)胞中高水平表達(dá)SPARC蛋白。SPARC也在組織重塑、創(chuàng)傷修復(fù)、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分 化、細(xì)胞迀移和血管形成過程中的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用，其中包括這些過 程與疾病狀態(tài)相關(guān)的情況。例如，在腎間質(zhì)纖維化中表達(dá)SPARC，并且其在宿主對(duì)肺損傷例 如博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的應(yīng)答中具有重要作用。
[0005] 在多種癌癥中，SPARC在腫瘤及其周圍基質(zhì)中的表達(dá)相對(duì)于正常組織中是不 同的，其表達(dá)模式取決于癌癥的類型。因此，沒有統(tǒng)一的模型來解釋其功能及其對(duì)癌癥 產(chǎn)生和發(fā)展的作用的各個(gè)方面。在一種模式中，有報(bào)道指出在乳腺癌（Bellahcene and Castronovo, 1995 ; Jones et al.，2004 ;Lien et al.，2007 ;Porter et al.，1995)、黑素瘤 (Ledda et al.，1997a)和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（Rempel et al.，1998)中SPARC的表達(dá)增加。在 這些癌癥中，增加的SPARC的表達(dá)在腫瘤促進(jìn)或進(jìn)展中具有重要作用。
[0006] 因此，在炎癥和一些癌癥中SPARC的過表達(dá)使SPARC成為診斷和治療的潛在靶標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動(dòng)物中的疾病位點(diǎn)的組合物，其包 含治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯(lián)于SPARC結(jié)合肽（〃SBP〃） 的治療或診斷劑以及藥學(xué)上可接受的載體（〃本發(fā)明的組合物〃），其中所述SBP包含SEQ ID NO: 1-117中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
[0008] 特別優(yōu)選的實(shí)施方式包括，例如，用于將治療劑遞送至哺乳動(dòng)物中的疾病位點(diǎn)的 本發(fā)明組合物，其包含一種或多種SBP，其中所述治療劑是包含功能性抗體Fc結(jié)構(gòu)域的抗 體片段，例如，其中所述功能性抗體Fc結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID N0:118。
[0009] 特別優(yōu)選的實(shí)施方式包括，例如，用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動(dòng)物中的疾病 位點(diǎn)的本發(fā)明的組合物，例如，其中SBP包含：SEQ ID N0:1-112和117中的任意一項(xiàng)或多 項(xiàng)的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，SBP可以由SEQ ID N0:1-112和117中的任意一項(xiàng)或 多項(xiàng)的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸組成。其它實(shí)施方式包括這樣的組合物，例如，其中存在兩種 或更多種單獨(dú)的SBP，其中每種單獨(dú)的SBP包含SEQ ID NO: 1-112和117中的任意一項(xiàng)、優(yōu) 選SEQ ID NO: 1-5中的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。實(shí)施方式包括這樣的組 合物，例如，其中存在兩種或更多種單獨(dú)的SBP，其中每種單獨(dú)的SBP由SEQ ID N0:l-112和 117中的一項(xiàng)或多項(xiàng)組成。
[0010] 本發(fā)明還提供了用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動(dòng)物中的疾病位點(diǎn)的組合物，其 包含治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯(lián)于SBP的治療或診斷 劑，藥學(xué)上可接受的載體和藥學(xué)上可接受的載體，還包含白蛋白結(jié)合肽（〃ABP〃），其中所述 八8卩包括5￡〇10勵(lì)：119或5￡〇10勵(lì)：120或者5￡〇10勵(lì)：119與5￡〇10勵(lì)：120二者。 此類組合物包括：其中所述SBP和ABP在同一多肽中，以及，所述SBP和ABP在不同的多肽 中的情況。
[0011] 本發(fā)明還提供了用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動(dòng)物中的疾病位點(diǎn)的方法，包含 治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯(lián)于SPARC結(jié)合肽的治療或診 斷劑以及藥學(xué)上可接受的載體（〃本發(fā)明的方法〃），其中所述SBP包括SEQ ID N0:1-117。優(yōu) 選的實(shí)施方式包括本發(fā)明的方法，其中所述組合物，例如，其中SBP包含：SEQ ID N0:l-112 和117中的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)、更優(yōu)選SEQ ID NO: 1-5和117中的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的至少10 個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0012] 其它優(yōu)選的實(shí)施方式包括本發(fā)明的方法，例如，其中存在兩種或更多種單獨(dú)的 SBP，其中每種單獨(dú)的SBP由SEQ ID N0:1-117中的一項(xiàng)或多項(xiàng)組成。本發(fā)明還提供了本 發(fā)明的方法，其中存在兩種或更多種單獨(dú)的多肽，每種多肽由至少一個(gè)SBP組成，并且其中 SBP包含SEQ ID N0:1-112中任一項(xiàng)的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0013] 特別優(yōu)選的本發(fā)明的方法包括這樣的組合物，例如，其中治療劑是包含功能性抗 體Fc結(jié)構(gòu)域的抗體片段，例如，其中所述抗體片段包括SEQ ID N0:118。根據(jù)本發(fā)明的此類 方法包括，例如，其中治療劑是介導(dǎo)下列一項(xiàng)或多項(xiàng)的抗體片段：補(bǔ)體激活、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和調(diào)理作用。
[0014] 本發(fā)明提供的本發(fā)明的方法還包括血清白蛋白結(jié)合肽（〃ABP〃），其包括SEQ ID NO: 119 或 SEQ ID NO: 120 或者 SEQ ID NO: 119 與 SEQ ID NO: 120 二者。根據(jù)本發(fā)明的方法 還包括，例如，其中所述SBP和ABP在同一多肽中，以及，所述SBP和ABP在不同的多肽中的 情況。然而，所述SBP也可以由SEQ ID N0:1-112的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的至少10個(gè)連續(xù)氨基 酸組成。
[0015] 所提供的本發(fā)明的組合物和方法可用于其中疾病位點(diǎn)是腫瘤并且哺乳動(dòng)物是人 類患者的情況。
【附圖說明】
[0016] 圖1顯示了將結(jié)合肽與治療或診斷劑融合的一般概念。在該圖所示的實(shí)例中，治 療劑是抗體Fc結(jié)構(gòu)域。
[0017] 圖2顯示了用于反復(fù)篩選噬菌體顯示文庫的一般策略。
[0018] 圖3顯示了通過序列被分離的次數(shù)就與SPARC的結(jié)合篩選肽噬菌體顯示文庫后鑒 別的序列。
[0019] 圖4顯示了通過與SPARC結(jié)合的親和性（由0D指示）就與SPARC的結(jié)合篩選肽 噬菌體顯示文庫后鑒別的序列。
[0020] 圖5顯示了將肽ro 15或TO21克隆進(jìn)入PFUSE-hIgGl-Fc2載體以產(chǎn)生ro 15或 TO21FC融合蛋白。
[0021] 圖6顯示了通過將編碼肽15和肽21的序列克隆進(jìn)入PFUSE-hIgGl-Fc2載體以編 碼肽-Fc融合蛋白，而由此產(chǎn)生的DNA序列。
[0022] 圖7顯示了所表達(dá)的和在聚丙烯酰胺凝膠電泳中純化的H) 15-Fc和H) 21-Fc融 合蛋白。
[0023] 圖8顯示了用于定義H315和H321的脫革巴結(jié)合的Protoarray。
[0024] 圖9是ELISA結(jié)合測(cè)定的圖，其中將SPARC與H)15和TO21的結(jié)合親和力與SPARC 和抗-SPARC抗體的結(jié)合親和力進(jìn)行了比較。
[0025] 圖10顯示了在人腫瘤的切片上進(jìn)行的免疫組織學(xué)研宄的顯微照片，其中使用 抗-SPARC抗體（R&D抗-SPARC)證明了腫瘤SPARC表達(dá)。陰性對(duì)照抗-赫賽汀抗體（僅Fc 片段）和Stablin結(jié)合肽-Fc融合蛋白（stab-Fc)不使腫瘤染色。
[0026] 圖11顯示了表達(dá)SPARC的腫瘤的組織學(xué)染色，其證明：PD 15和21與腫瘤中 表達(dá)SPARC的細(xì)胞結(jié)合。
[0027] 圖12顯示了彈性蛋白上的潛在的SPARC結(jié)合位點(diǎn)。
[0028] 圖13顯示了 H)15和H)21在人前列腺癌/裸鼠模型系統(tǒng)中的抗腫瘤活性。
[0029] 圖14顯示了 H)15和H)21在人乳腺癌/裸鼠模型系統(tǒng)中的抗腫瘤活性。
[0030] 圖15顯示了兩種svFc多肽scFv 3-1和scFv 3-2與SPARC的結(jié)合活性。
[0031] 圖16顯示了兩種svFc多肽scFv 2-1和scFv 2-2與SPARC的結(jié)合活性。
[0032] 圖17顯示了 scFv 2-1，2-2, 3-1和3-2的核苷酸序列。以下劃線標(biāo)示出了⑶R。
[0033] 圖18顯示了從細(xì)菌中純化scFv2_l。
[0034] 圖19顯示了從細(xì)菌中純化scFv3_l。
[0035] 圖20顯示了使用Biacore，scFv2_l與固定在芯片上的SPARC的結(jié)合。列出了使用 Biacore，scFv 2-1，3-1 和 3-2 與 SPARC 的 Kd (HTI SPARC-獲自 HTI 的純化的血小板 SPARC; Abx SPARC-由Abraxis生產(chǎn)的來自工程化的HEK293細(xì)胞的SPARC)。
【具體實(shí)施方式】
[0036] SBP和ABP是"肽配體結(jié)構(gòu)域"。術(shù)語"肽配體結(jié)構(gòu)域"意思是指：可以以其本身存 在和/或存在于更大的多肽序列內(nèi)并且特異性地與另一種生物分子結(jié)合的氨基酸序列。例 如，脂肪酸、膽紅素、色氨酸，鈣、類固醇激素和其它生理上重要的化合物的主要血液運(yùn)輸 系統(tǒng)涉及這些生物分子與血清白蛋白的結(jié)合。這些生物分子的結(jié)合發(fā)生于白蛋白氨基酸序 列中的不連續(xù)位點(diǎn)，即，發(fā)生于血清白蛋白中的肽配體結(jié)構(gòu)域。
[0037] 本發(fā)明提供了用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動(dòng)物中的疾病位點(diǎn)的組合物，其包 含治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯(lián)于SPARC結(jié)合肽（〃SBP〃） 的治療或診斷劑以及藥學(xué)上可接受的載體（〃本發(fā)明的組合物"和"本發(fā)明的方法〃）。本 發(fā)明包括這樣的組合物和方法，其中SBP包括具有SEQ ID N0:l-117中的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)、 最優(yōu)選SEQ ID N0:1-5中的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的序列、或SEQ ID N0:1-117中任一項(xiàng)的一種 或多種同源物的肽。
[0038] 術(shù)語"同源物"意思是具有與原始序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列并且顯示出與原 始序列所顯示出的性質(zhì)實(shí)質(zhì)上相似的相關(guān)性質(zhì)的多肽。一種此類性質(zhì)的實(shí)例是調(diào)節(jié)活性試 劑的組織分布的能力，其中SEQ ID N0:l-117的同源物將能夠提供與SEQ ID N0:l-117提供 的調(diào)節(jié)水平實(shí)質(zhì)上相似的調(diào)節(jié)水平。在本文中，例如以及優(yōu)選地，相對(duì)于SEQ ID NO: 1-117 提供的活性試劑的血液水平，顯示出這種實(shí)質(zhì)上相似的調(diào)節(jié)的SEQ ID NO: 1-117同源物將 提供至少大約80%，優(yōu)選至少大約85%，更優(yōu)選至少大約90%，最優(yōu)選至少大約95 %的活 性試劑的血液水平?；蛘?，術(shù)語"同源物"還意指，例如，SEQ ID N0:l-112任一項(xiàng)、最優(yōu)選 SEQ ID N0:1-5任一項(xiàng)或多項(xiàng)的至少6個(gè)連續(xù)氨基酸，優(yōu)選至少7個(gè)連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選至 少8個(gè)連續(xù)氨基酸，甚至更優(yōu)選至少9個(gè)連續(xù)氨基酸，最優(yōu)選至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的肽序 列。
[0039] 本發(fā)明提供的組合物和方法還包括包含SEQ ID N0:119或120或者SEQ ID N0:119 與120二者及其同源物的ABP。根據(jù)本發(fā)明的方法還包括，例如，其中所述SBP和ABP在同 一多肽中，以及，所述SBP和ABP在不同的多肽中的情況。
[0040] 就相對(duì)于原始序列的變化而言，原始序列的同源物優(yōu)選將與原始序列至少大約 80%同一，優(yōu)選與原始序列至少大約90%同一，甚至更優(yōu)選與原始序列至少大約95%同 一，最優(yōu)選與原始序列至少大約99%同一。
[0041] 如本文使用的"序列同一性百分率"意思是通過在比較窗口中比較兩個(gè)優(yōu)化比對(duì) 的序列而測(cè)定的值。另外，為了兩個(gè)序列優(yōu)化比對(duì)的目的，比較窗口中的多肽序列部分相對(duì) 于參考序列（其不包含添加或缺失）可以包含添加或缺失（即空隙）。百分率是這樣計(jì)算 的：測(cè)定兩個(gè)序列中的相同氨基酸殘基的位置數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的 數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分率。優(yōu)選地， 使用Needleman和Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443453中的同源性比對(duì)算法來進(jìn)行優(yōu)化 比對(duì)。
[0042] 另外優(yōu)選的是，當(dāng)同源物不含相同的氨基酸時(shí)，突變僅產(chǎn)生保守性氨基酸變化。因 此，那些不相同的殘基位置的變化使得氨基酸殘基被替換為其它的具有相似化學(xué)性質(zhì)（例 如電荷或疏水性）的氨基酸殘基，因此，分子的功能性質(zhì)不發(fā)生改變。當(dāng)序列的區(qū)別在于保 守性替換時(shí)，可以上調(diào)序列同一性百分率以校正替換的保守性性質(zhì)。區(qū)別在于此類保守性 替換的序列被稱作具有"序列相似性"或"相似性"。進(jìn)行這種調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的。
[0043] 為了進(jìn)一步例示本發(fā)明上下文中的"保守性"氨基酸取代或改變的含義，以下列出 了組A-F。下列組中的一個(gè)成員被替換為同一個(gè)組中的另一個(gè)成員被認(rèn)為是"保守性"取 代。
[0044] 組A包括：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇 氨酸和具有下列側(cè)鏈的修飾的氨基酸：乙基、異丁基、-CH2CH20H、-CH2CH2CH20H、-CH2CH0H CH3 和 CH2SCH3。
[0045] 組B包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸和具有乙基側(cè)鏈的修 飾的氨基酸。
[0046] 組C包括苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、環(huán)己基甲基和具有取代的芐基 或苯基側(cè)鏈的修飾的氨基殘基。
[0047] 組D包括谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或天冬氨酸的取代的或非取代的脂肪族、芳香 族或芐族酯（例如，甲酯、乙酯、正丙酯、異丙酯、環(huán)己酯、芐酯或取代的芐酯）、谷氨酰胺、天 冬酰胺、C0-NH-烷基化的谷氨酰胺或天冬酰胺（例如，甲基、乙基、正丙基和異丙基），以及 具有側(cè)鏈_(CH2)3C00H的修飾的氨基酸，其酯（取代的或非取代的脂肪族、芳香族或芐族 酯），其酰胺，及其取代的或未取代的N-烷基化酰胺。
[0048] 組E包括組氨酸、賴氨酸、精氨酸、N-硝基精氨酸、p-環(huán)精氨酸、g-羥基精氨酸、 脒基瓜氨酸（N_amidinocitruline)，2-氨基狐基丁酸（2-arnino guanidinobutanoic acid)、賴氨酸的同源物、精氨酸的同源物和鳥氨酸。
[0049] 組F包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和具有被-OH或-SH取代的C1-C5直鏈或支鏈 烷基側(cè)鏈的修飾的氨基酸。
[0050] 本發(fā)明還提供了包含綴合物分子的組合物，所述綴合物分子包含綴合于活性試劑 的肽配體結(jié)構(gòu)域，其中所述肽配體結(jié)構(gòu)域在氨基或羧基末端或者兩個(gè)末端添加至多另外大 約50個(gè)氨基酸，優(yōu)選至多另外大約25個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至多另外大約15個(gè)氨基酸，最優(yōu)選 至多另外大約10個(gè)氨基酸。得到的多肽（本發(fā)明的多肽）包括總長(zhǎng)度小于50個(gè)，小于40， 小于30,小于25或小于20個(gè)氨基酸的多肽。
[0051] 本發(fā)明還提供了包含綴合物分子的組合物，其中所述綴合物分子包含綴合于活性 試劑的SBP，其中存在包含SEQ ID N0:1-117中任一項(xiàng)、最優(yōu)選SEQ ID N0:1、2和117中任 意一項(xiàng)或多項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)SBP。
[0052] 本發(fā)明還提供了分離的多核苷酸，其編碼具有肽配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的 多肽，包括在氨基和/或羧基末端具有所述的另外的氨基酸的那些多肽。
[0053] II.根據(jù)本發(fā)明的制備肽的方法
[0054] 可以使用已知的技術(shù)來合成、檢測(cè)、定量和純化本發(fā)明提供的含有肽配體結(jié)構(gòu)域 的多肽。例如，可以這樣產(chǎn)生表達(dá)含有外源肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽的細(xì)胞：通過本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員熟知的方法將cDNA置于強(qiáng)啟動(dòng)子/翻譯起始點(diǎn)的控制下并將載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化進(jìn)入 合適的原核或真核細(xì)胞以驅(qū)動(dòng)含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽的表達(dá)?；蛘撸梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員熟知的方法化學(xué)地制備含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽。
[0055] 可以通過標(biāo)準(zhǔn)的固相合成技術(shù)來制備含有肽配體結(jié)構(gòu)域的多肽。如一般已知 的那樣，可以使用商售的設(shè)備和試劑，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，通過封閉干擾性基團(tuán)、保護(hù) 待反應(yīng)的氨基酸、偶聯(lián)、脫保護(hù)和將未反應(yīng)的殘基加帽來制備所需長(zhǎng)度的肽。合適的設(shè) 備可以從下列生產(chǎn)商獲得，例如，Applied BioSystems, Foster City, CA或Biosearch Corporation，San Raphael，CA〇
[0056]例如，使用叔丁氧羰基_ a _氨基酸以及合適的側(cè)鏈保護(hù)，使用標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)化固相 合成程序來合成肽。使用標(biāo)準(zhǔn)的氟化氫方法從固相載體上取下完成的肽，同時(shí)使側(cè)鏈脫保 護(hù)。使用〇