本發(fā)明涉及一種牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體、制備方法及其用途，屬于基因工程技術領域。

背景技術：

單鏈抗體是一種基因工程抗體，通過DNA重組技術將抗體輕鏈可變區(qū)VL和重鏈可變區(qū)VH通過一段連接短肽linker首尾連接而成，是保留完整抗原結合部位的最小功能片段。單鏈抗體的表達形式主要有融合表達，胞內表達和分泌表達三種形式。和完整抗體相比，單鏈抗體具有以下優(yōu)點：1)分子量小，大小僅為完整抗體的六分之一，免疫原性較低；2)組織穿透力強，容易進入實體瘤周圍的微循環(huán)；3)血液清除快，腎臟蓄積很少；4)無Fc段，非特異結合低；5)易于通過基因工程大量生產；6)易于基因操作，更易構建重組免疫毒素。

奶牛乳腺炎是影響奶牛業(yè)發(fā)展，給乳品生產造成巨大損失的一種常見多發(fā)病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黃色葡萄球菌是最重要的致病菌，流行率達到了50％，導致的經濟損失最大。主要是因為金黃色葡萄球菌具有傳染性且治療用的抗生素易產生耐藥性，所以很難徹底治愈；目前針對金黃色葡萄球菌全菌和各個毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的預防，但是效果均不理想。單鏈抗體等基因工程抗體，以其獨特的抗病毒和抗細菌作用及可以大規(guī)模工程化制備的優(yōu)勢，顯示了巨大的研發(fā)抗細菌藥物的潛力，受到該領域高度重視。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種牛源抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體、制備方法及其用途。本發(fā)明的真核表達單鏈抗體能夠與金黃色葡萄球菌特異性結合，且具有一定的抑菌活性，能夠用于制備治療金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎藥物的研究。

本發(fā)明技術方案具體介紹如下。

本發(fā)明提供一種牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體，其至少具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的?？贵w輕鏈可變區(qū)VL、如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的牛抗體重鏈可變區(qū)VH以及由中間連接肽Linker按照VL-Linker-VH的順序進行連接構成的牛源單鏈抗體片段VL-Linker-VH。

本發(fā)明中，所述的牛源單鏈抗體片段VL-Linker-VH具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

本發(fā)明還提供一種上述牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體的編碼基因scFv。

本發(fā)明還提供一種上述牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體的制備方法，具體步驟如下：

(1)采用RT-PCR直接從患奶牛乳腺炎的外周血單個核細胞RNA中擴增出抗體編碼基因的輕鏈可變區(qū)VL基因和重鏈可變區(qū)基因VH；

(2)利用SOE-PCR法將連接肽linker與VL基因和VH基因相連構建牛源性單鏈抗體基因；

(3)將步驟(2)的牛源性單鏈抗體基因克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E中，構建重組質粒；

(4)將步驟(3)的重組質粒轉化入大腸桿菌，培養(yǎng)并用輔助噬菌體擴增建立初級單鏈抗體文庫；

(5)用金黃色葡萄球菌全菌作為包被抗原，富集淘選；

(6)采用phage ELISA,用金黃色葡萄球菌全菌作為包被抗原，篩選得到的陽性克隆即為牛源性抗金黃色葡萄球菌真核表達單鏈抗體。

進一步的，本發(fā)明還提供上述牛源性抗金黃色葡萄球菌的真核單鏈抗體在制備治療金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎藥物中的用途。

本發(fā)明的技術原理是采用RT-PCR直接從患奶牛乳腺炎的外周血單個核細胞RNA中擴增出?？贵w編碼基因的重鏈可變區(qū)(VH)基因和輕鏈可變區(qū)(VL)基因。利用SOE-PCR(重組鏈延伸反應)法，將linker與VH基因和VL基因相連構建牛源性單鏈抗體編碼基因(scFv)，該scFv是按照VL-Linker-VH的順序進行連接的，并將其克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E中構建單鏈抗體初級文庫，輔助噬菌體M13KO7拯救初級文庫；用金黃色葡萄球菌全菌作為包被抗原經過四輪的富集淘選后，采用phage ELISA方法篩選陽性克隆，證明該單鏈抗體具有抗金黃色葡萄球菌的體外中和活性，并測序后進行Clustalw多序列比較。

本發(fā)明的獨特之處，首先是在構建重組牛源單鏈抗體表碼基因(ScFv)時，按照VL-Linker-VH的順序，將?？贵w輕鏈可變區(qū)(VL)和?？贵w重鏈可變區(qū)(VH)用中間的Linker進行連接,構成的牛源單鏈抗體片段(VL-Linker-VH)，這樣連接被本發(fā)明證明構建重組牛 源scFv更為有效。而一般的文獻報道都是按照VH-Linker-VL的順序連接的；其次本發(fā)明將篩選到的陽性克隆的單鏈抗體編碼基因(scFv)克隆到真核表達質粒pcDNA3.1，構建成單鏈抗體真核表達質粒pcDNA3.1-scFv，直接注射小鼠乳腺組織,可以在組織內表達單鏈抗體蛋白,抗體在體內持續(xù)時間長，能顯著提高細胞因子IFN-γ和IL-4的含量(P<0.05),降低炎癥因子TNF-α的含量(P<0.05)，維持乳腺結構的相對完整，減少炎性細胞的浸潤，對小鼠提供一定的保護作用。

本發(fā)明的有益效果是：抗金黃色葡萄球菌的真核表達單鏈抗體基因(scFv)直接注射小鼠乳腺,抗體在組織內持續(xù)表達，能與金黃色葡萄球菌特異性結合，能夠用于奶牛乳腺炎的防控的進一步研究。

附圖說明

圖1是實施例1的噬菌粒載體pCANTAB5E的結構圖。

圖2是phage ELISA篩選到的8個scFv陽性克隆圖示；注：NC為陰性對照，ZW1-ZW88為scFv陽性克隆。

圖3是重組質粒pcDNA3.1-scFvs雙酶切鑒定圖示；注：M.Marker 2000；1.scFvZW12雙酶切；2.scFvZW88雙酶切。

圖4是Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在COS-1細胞中的表達圖示；注：β-actin基因作為內參，1.未轉染的COS-1細胞；2.轉染空質粒pcDNA3.1；3.轉染質粒pcDNA3.1-scFv12；4.轉染質粒pcDNA3.1-scFv88。

圖5是Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在小鼠乳腺的表達時相圖示；注：Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在小鼠乳腺的表達時向(n＝3),β-actin基因作為內參。生理鹽水和空質粒pcDNA3.1分別為空白對照(C)和陰性對照(NC)，β-actin基因作為內參。

圖6是真核表達單鏈抗體注射后乳腺組織細菌計數(shù)圖；注：圖中數(shù)據均以平均值±標準誤表示(n＝6)；不同字母標注的代表差異顯著P<0.05，相同字母標注的代表差異不顯著。

圖7是真核表達單鏈抗體(scFv)對細胞因子含量影響圖；注：圖中數(shù)據均以平均值±標準誤表示(n＝6)；不同字母標注的代表差異顯著P<0.05，相同字母標注的代表差異不顯著，其中，(a)為TNF-α，(b)為IL-1β，(c)為IL-6。

具體實施方式

實施例中采用的實驗材料均為正規(guī)公司獲得的標準材料，所用方法均為標準試劑盒產品說明書所述方法，各步驟獲得的中間產品及最后的終產品均經過多次試驗證明可以重復獲得，其生物學性質保持穩(wěn)定一致。說明本發(fā)明各試驗步驟所涉及的中間產品和終產品 均可以按照本發(fā)明所陳述的方法準確獲得。

實施例1牛源噬菌體單鏈抗體庫的構建

1、采集患乳腺炎的奶牛血液，ELISA法檢測血清抗體效價大于1:20000時，繼續(xù)后續(xù)實驗。將抗凝血提取牛外周血白細胞，用Trizol法(TRIZOL Reagent購自TaKaRa公司)提取總RNA。以提取的總RNA為模版，采用Oligo primer，根據反轉錄試劑盒(cDNA第1鏈合成試劑盒購自TaKaRa公司)的產品說明操作步驟，合成第1鏈cDNA。

2、分析已發(fā)表文獻中的牛抗體編碼基因可變區(qū)序列，根據其FR區(qū)設計擴增抗體輕、重鏈的引物(表1)，其中VH F和VH R用于擴增VH區(qū)；VL F和VL R用于擴增VL區(qū)。其中，VLF、VH R分別含有Sfi I和Not I酶切位點；VH F、VL R含互補的Linker序列(酶切位點和Linker序列在表1中用下劃線標示出)。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。表1擴增抗體可變區(qū)的引物及其擴增片段大小

3、VH和VL基因的擴增以cDNA為模版，VH F、VH R為引物擴增VH基因；VL F、VL R為引物擴增VL基因。PCR反應體系為25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物(25μM)各1μL，ddH₂O 8.5μL。擴增程序如下：95℃預變性3min；94℃變性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物并回收目的基因(根據AxyGEN公司提供的膠回收說明書操作)。

4、ScFv基因的獲得通過重組鏈延伸反應(SOE-PCR)將含有Linker序列的VL和VH基因連接為ScFv基因(VL-linker-VH)，并加入Sfi I和Not I酶切位點。

5、初級文庫的構建根據常規(guī)分子克隆方法(參照J.薩姆布魯克等主編的《分子克隆實驗指南》)，ScFv基因和pCANTAB5E載體分別經Sfi I和Not I雙酶切后，將ScFv基因插入pCANTAB5E載體，構建重組表達質粒(參見圖1)，并將其電轉化TG1感受態(tài)細胞，轉化50次，合并所有電轉化培養(yǎng)液，取一小部分系列稀釋后涂布于YT-AG固體培養(yǎng)板，30℃過夜培養(yǎng)計算庫容量(挑取克隆進行菌落PCR和質粒雙酶切驗證，測序驗證庫的多樣性)；通過菌落PCR計算陽性率，得到實際的庫容量。將剩余的細菌培養(yǎng)液通過輔助噬菌體M13KO7拯救后建立初級文庫。

實施例2牛源抗金黃色葡萄球菌單鏈抗體的篩選

1、富集淘選制備金黃色葡萄球菌全菌抗原(ATCC25923)，4℃包被過夜；用含4％脫脂奶粉的PBS封閉96孔板37℃孵育2h；向96孔板中加入上述步驟中制備好的單鏈抗體噬菌體抗體庫，37℃孵育2h，用PBST和PBS各洗10次，洗掉未結合的游離噬菌體；每孔加入100μl 0.2mol/L Gly-Hcl緩沖液(pH＝2.2)洗脫特異性結合的噬菌體，加入50μl 1mol/L Tris-Hcl(PH＝9.1)中和洗脫液；將剩余部分洗脫液感染大腸桿菌TG1后，重復上述步驟。如此重復3-5輪，在第一輪過后，要增加洗滌的嚴謹性：洗脫前用PBST洗脫20次后用PBS洗滌20次。

2、phage ELISA篩選從第四輪中隨機取96個克隆，用M13K07拯救后制備重組噬菌體。金黃色葡萄球菌全菌抗原(ATCC25923)用50mmol/L碳酸氫鈉鹽溶液(pH9.6)于4℃包被過夜，4％脫脂奶粉溶液封閉1h后用PBST(0.1％Tween20，以下同)洗滌3次；加入上述制備好的噬菌體單鏈抗體，37℃反應2h，PBST和PBS各洗滌6次；加入HRP-antiM13抗體100μL(1:4000)，37℃反應1h，PBST和PBS各洗滌6次；TMB顯色，2mol/L硫酸終止反應，酶標儀讀取OD450值，同時設輔助噬菌體M13K07為陰性對照。ELISA結果的判定以P/N(P為陽性孔的OD450值，N為陰性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1為陽性；1.5≤P/N＜2.1為可疑；P/N＜1.5為陰性(圖2)。(參照姚火春主編《獸醫(yī)微生物學實驗指導》)。

實施例3重組scFv序列分析

對獲得的單鏈抗體編碼基因進行測序，證明其按照正確的閱讀框順序插入到噬菌粒載體pCANTAB5E中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其序列順序是VL-Linker-VH(圖3)。

實施例4pcDNA3.1-scFv重組質粒的轉染

1無內毒素質粒的提取

采用天根無內毒素質粒大量提取試劑盒，具體操作步驟如下：

(1)含有目的質粒的克隆接種于相應抗生素抗性的的LB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)；

(2)取200菌液，8000r/min離心3min，棄上清；

(3)加入10mL Buffer P1(使用前應加入RNase A)懸浮菌體；

(4)加入10mL Buffer P2，溫和的翻轉離心管，此時溶液透亮，室溫放置5min；

(5)加入10mL Buffer P4，溫和的上下翻轉6-8次，至溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室溫放置10min后8000r/min離心10min，使白色沉淀沉于管底；

(6)將全部上清液小心倒入過濾器CS1中，慢慢推動推柄過濾，濾液收集在干凈的管中；

(7)向濾液中加入0.3倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻后轉移到吸附柱CP6中，吸附柱CP6預先經過平衡液BL處理；

(8)室溫8000r/min離心2min后棄濾液，將吸附柱放回離心管，加入10mL Buffer PW，8000r/min離心2min，棄去濾液；

(9)重復上述操作；

(10)向吸附柱CP6中加入3mL無水乙醇，8000r/min離心2min，棄去濾液；

(11)將吸附柱CP6重新放回收集管中，8000r/min離心5min，目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除；

(12)將吸附柱置于新的管中，放置2min使乙醇揮發(fā)干凈；在吸附柱中央加入1.5mL生理鹽水(提前65℃預熱來提高洗脫的效率)；靜置10min后8000r/min離心2min，管中的液體即為提取的質粒。

2重組質粒pcDNA3.1-scFv的雙酶切鑒定

pcDNA3.1-scFvs經過Not I和EcoR I雙酶切后，可得到750bp的目的基因片段和5000bp的載體片段(圖3.2)，表明重組質粒構建成功。

3pcDNA3.1-scFv的測序結果

通過特異性的引物擴增目的基因pcDNA3.1-scFvs，切膠回收純化后，與pMD18-T-Vector相連，獲得的重組質粒經過質粒雙酶切驗證正確后測序。測序結果表明，插入序列與實驗設計一致，并且讀碼框完全正確。因此通過PCR方法成功構建了pcDNA3.1-scFvs目的基因。

實施例5Western blot分析pcDNA3.1-scFv重組質粒的轉染效果

采用脂質體的方法將重組質粒pcDNA3.1-scFv12轉染COS-1細胞，Western blot分析結果表明，pcDNA3.1-scFv不僅可以在細胞內表達，也能分泌到培養(yǎng)液上清中進行分泌型表達。

1轉染流程

(1)轉染前一天，將COS-1cell接種到24孔板中，每個孔中加入1.5-2×10⁵個細胞，控制細胞轉染時的密度為60-80％；

(2)實驗分為四組，一組為細胞對照組；一組為空質粒pcDNA3.1組，另外兩組為重組質粒pcDNA3.1-scFvs實驗組，每組均設三個復孔；

(3)分別將1μg待轉染質粒和2μL脂質體稀釋在不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基中混勻，室溫孵育10min后將兩者混合，室溫放置20min,制備DNA-脂質體復合物；

(4)吸去步驟(1)中細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，將上述制備的復合物加到培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

(5)6h后，除去細胞上清，更換為500μL含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基；

(6)轉染48h后，收取總蛋白通過Western blot來驗證重組蛋白的表達。

2His-tag的單克隆抗體來檢測細胞樣本的表達情況

(1)收集轉染的實驗組細胞及對照組細胞的培養(yǎng)液，13000rpm離心3-5min去除細胞碎片，取上清備用；

(2)收集轉染的實驗組細胞及對照組細胞經胰蛋白酶消化，冷的PBS洗細胞3遍，5min/次；

(3)每份細胞樣品加入100μL的Western blot裂解液，冰上裂解40min，超聲破碎；13000rpm離心3-5min，收獲上清液；

(4)電泳：取上步中的上清液樣本和步驟(1)中的細胞培養(yǎng)液的上清樣本加入蛋白上樣緩沖液煮沸后進行SDS-PAGE電泳；

(6)轉膜：取下凝膠，切去濃縮膠，根據分離膠的大小裁剪濾紙和PVDF膜。將濾紙和PVDF膜放入蛋白轉移緩沖液浸泡10min。在轉膜儀上從負極到正極按照濾紙、凝膠、PVDF膜和濾紙的先后順序制成夾層，打開電源，恒流轉膜；

(7)封閉：轉膜結束后將PVDF膜放于3％BSA封閉液中，室溫封閉2h；

(8)一抗孵育：封閉結束后，將PVDF膜移至用3％BSA稀釋的His-Tag Mouse mAb一抗中(1:4000稀釋)，室溫孵育2h后，用TBST洗滌3次，每次8min；

(9)二抗孵育：將PVDF膜移至用3％BSA稀釋的過氧化物酶標記羊抗鼠IgG的二抗中(1:4000稀釋)，室溫孵育1h后，用TBST洗滌3次，每次8min；

(10)顯影：洗滌結束后將膜置于保鮮膜內，化學發(fā)光試劑A和B等比例混合后均勻加在PVDF膜上，暗室內作用5min；將等大的X-膠片放在膜上，曝光適當?shù)臅r間后取出膠片進行顯影定影。圖4是Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在COS-1細胞中的表達圖示。

實施例6抗金黃色葡萄球菌的真核表達scFv在小鼠乳腺內的表達時效

pcDNA3.1-scFv質粒100μg經乳腺導管注射到小鼠的第四對乳腺中，注射動作要緩慢，操作要輕柔，注射完成后充分按摩小鼠的乳腺，注射劑量為100μL。空白對照每只小鼠第四對乳腺注射生理鹽水100μL，陰性對照組每只小鼠第四對乳腺注射空質粒pcDNA3.1100μg。分別在注射后1d、3d、5d、7d、9d和11d收集小鼠的右側乳腺(每個時間點三只小鼠)，加入RIPA裂解液后勻漿，13000rpm離心3-5min，收獲上清液；上清液樣本加入蛋白上樣緩沖液煮沸后進行SDS-PAGE電泳，然后通過Western blot驗證目的蛋白的表達情況。

懷孕7d的昆明小鼠經第四對乳腺導管注入pcDNA3.1-scFv質粒200μg，生理鹽水和pcDNA3.1空質粒分別作為空白對照和陰性對照，注射后1d、3d、5d、7d、9d和11d收集小鼠的右側乳腺進行Western blot驗證，β-actin基因作為內參。結果顯示，scFv蛋白在3d的時候開始表達，7d的時候表達量上升，可維持到11d(圖5)。

實施例7抗金黃色葡萄球菌scFv基因對小鼠乳腺炎的保護功能研究

1動物的分組及處理

(1)泌乳期昆明小鼠30只，隨機分為5組，每組6只。分別為：空白對照組(Control,C)，陰性對照組(Negative Control,NC)，陽性對照組(Positive Control,PC),單鏈抗體低劑量處理組(ScFv-Low，SL)和單鏈抗體高劑量處理組(ScFv-High，SH)?？瞻讓φ战M和陰性對照組在泌乳7d的時候經第四對乳腺導管注射pcDNA3.1空質粒100μg；單鏈抗體低劑量處理組和單鏈抗體高劑量處理組在泌乳7d的時候經第四對乳腺導管注射pcDNA3.1-scFv粒，SL注射100μg，SH注射200μg。注射前4h保證小鼠充分吮吸乳汁，為了保證重組質粒充分被乳腺細胞吸收而不隨乳汁被小鼠吮吸，注射后將小鼠與母鼠隔離6h。7d后，陽性對照組攻入青霉素(攻入干擾劑前2h將各組小鼠與母鼠隔離)，75％的酒精消毒，每只小鼠第四對乳腺注入300μL青霉素注射液(100mg/mL)。

6h過后，空白對照組每只小鼠第四對乳腺注入50μL生理鹽水，陰性對照組，陽性對照組和兩個單鏈抗體處理組每只小鼠第四對乳腺注入50μL(金黃色葡萄球菌濃度為10⁸cfu/mL)細菌懸液。48h后脫頸處死小鼠，收集血液，快速剪開腹部的皮膚，觀察乳腺的變化，取第四對乳腺，待測。

(2)數(shù)據統(tǒng)計

用Excel 2010和SPSS18.0方差分析對試驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析，結果以平均數(shù)±標準誤(Mean±SE)表示。P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著。

2乳腺炎組織的細菌計數(shù)

脫頸處死小鼠后，快速剪開腹部的皮膚，取第四對左側乳腺，按照一定的比例加入生理鹽水進行勻漿，將勻漿液取一小部分倍比稀釋后涂布Baird-Parker(BP)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后計算細菌數(shù)。結果如圖6所示，空白對照組沒有細菌，ScFv-High組與NC組相比，細菌數(shù)明顯降低(P<0.05)，ScFv-Low與NC組相比，細菌數(shù)有降低的趨勢。

3乳腺炎組織細胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的含量

脫頸處死小鼠后，快速剪開腹部的皮膚，小鼠第四對左側乳腺加入生理鹽水勻漿后勻漿液離心取上清，ELISA試劑盒檢測TNF-α，IL-1β和IL-6的含量。與對照組相比,PC和NC組的TNF-α，IL-1β和IL-6三個細胞因子的含量顯著升高(P<0.05)；與NC組相比，ScFv-Low組TNF-α，IL-1β和IL-6三個細胞因子的含量沒有明顯的變化；與NC組相比，ScFv-High組IL-1β的含量顯著降低(P<0.05)，TNF-α和IL-6的含量有降低的趨勢(圖7)。