專利名稱：可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種應(yīng)用基因工程與化學(xué)突變相結(jié)合的 技術(shù)制備谷胱甘肽人源含硒單鏈抗體酶的方法。
背景技術(shù)：
含硒的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基團(tuán) 是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物體內(nèi)，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化 氫酶(CAT) —起構(gòu)成了機(jī)體抗氧化防御體系。GPX在該體系中發(fā)揮著重要的 作用，它以GSH為還原劑，分解體內(nèi)的過氧化氫和各類氫過氧化物，因而能清 除體內(nèi)活性氧(ROS)，防止脂質(zhì)過氧化，治療由活性氧引起的各種疾病，如紫 外線輻射、心腦血管疾病、白內(nèi)障、腫瘤等。與其它抗氧化酶不同，GPX除了 能清除ROS夕卜，還能降解脂質(zhì)過氧化物，防止細(xì)胞過氧化損傷，這種獨(dú)特的保 護(hù)細(xì)胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然GPX 的來源相當(dāng)有限、穩(wěn)定性差，致使它的模擬物的研究備受關(guān)注。
小分子模擬物主要有PZ51 (ebselen)， AL3823A， BXT系列產(chǎn)品，它們的 弱點(diǎn)是活力低，僅為天然GPX的千分之一左右。80年代中期出現(xiàn)的抗體酶制備 技術(shù)為GPX的人工模擬開辟了新途徑，根據(jù)酶學(xué)原理、利用免疫學(xué)和化學(xué)知識， 設(shè)計(jì)了一種新的產(chǎn)生抗體酶的技術(shù)路線，并成功地制備了數(shù)種具有很高GPX活 力的含硒抗體酶(中國專利94102481.4和96112628.0)。這些高活力的含硒抗體 酶氨基酸組成是鼠源的，可作為抗原刺激人體產(chǎn)生人抗鼠抗體，因此限制了該類 藥物的使用。為了解決這一問題，制備人源含硒單鏈抗體酶是一個最好的辦法， 噬菌體人抗體庫的成功構(gòu)建為這一設(shè)想提供了可能。
中國專利99104234.4公開的人源單鏈含硒抗體酶的制備方法是半抗原 -GSH衍生物的設(shè)計(jì)與合成；以GSH的衍生物為靶抗原直接從噬菌體展示人抗體 庫中篩選GSH特異的單鏈抗體；在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)無活性的單鏈 抗體蛋白；變性、復(fù)性、純化單鏈抗體蛋白；用化學(xué)突變(修飾)法將GPX的催化基團(tuán)SeCys引入單鏈抗體可變區(qū)，因而在單鏈抗體可變區(qū)既有底物結(jié)合部 位又有催化基團(tuán)，結(jié)果產(chǎn)生具有GPX活力的人源含硒抗體酶。該法制備的人源 含硒單鏈抗體酶的方法有以下缺點(diǎn)(l)制備過程中表達(dá)的包涵體蛋白，是一種 無正?？臻g構(gòu)象，處于沉淀狀態(tài)下的無活性蛋白分子，需要經(jīng)過變性-復(fù)性才能 有活性。包涵體蛋白復(fù)性是一個困難而復(fù)雜的過程，僅復(fù)性這一步就會損失大量 的單鏈抗體蛋白，導(dǎo)致該法制備抗體酶產(chǎn)率下降；(2)制備抗體酶的周期長、操 作繁瑣，因包涵體復(fù)性是使無活性的蛋白分子在適宜的條件下逐漸恢復(fù)活性的緩 慢過程；(3)制備的抗體酶活性低，僅為28.8-256U/txmo1，低于天然酶一個數(shù)量 級水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的抗體庫免疫親和篩選技 術(shù)、基因工程技術(shù)、化學(xué)突變技術(shù)相結(jié)合的方法制備谷胱甘肽人源含硒單鏈抗體 酶的方法，達(dá)到提高抗體酶活性、可直接應(yīng)用于人體、簡化步驟、縮短制備周期、 提高抗體酶產(chǎn)率的目的。
本發(fā)明的總體思路是，先篩選具有GPX底物結(jié)合部位的人源單鏈抗體，通 過測序確定其氨基酸序列，然后將編碼該氨基酸序列的人源單鏈抗體基因組裝到 原核或真核分泌型表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌或酵母細(xì)胞，表達(dá)可溶性單鏈抗體 蛋白，再用化學(xué)突變法將GPX的催化基團(tuán)引入到單鏈抗體的底物結(jié)合部位；或 用基因突變技術(shù)和營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌直接表達(dá)在底物結(jié)合部位含有GPX催化 基團(tuán)的可溶性單鏈抗體蛋白。因而在該單鏈抗體上既有GPX的底物結(jié)合部位， 又有催化基團(tuán)，結(jié)果賦予該單鏈抗體高的GPX的催化活性，就產(chǎn)生了高活力的 人源含硒單鏈抗體酶。
具體制備方法是，利用噬菌體抗體展示技術(shù)，以谷胱甘肽衍生物為靶抗原， 通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進(jìn)行篩選。分離并擴(kuò)增 GSH特異性單鏈抗體基因。將上述基因組裝到分泌型原核或真核表達(dá)載體上， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌或酵母細(xì)胞，在原核或真核中大量表達(dá)并純化單鏈抗體蛋白。用苯 甲基磺酰氟活化單鏈抗體中的絲氨酸(Ser)殘基上的羥基，再用硒氫化鈉處理， 則將Ser突變成SeCys，結(jié)果在抗體的底物結(jié)合部位引入GPX的催化基團(tuán)SeCys， 賦予抗體以GPX的催化活性；或用基因突變技術(shù)和營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌直接表達(dá)在底物結(jié)合部位含有GPX催化基團(tuán)的可溶性單鏈抗體蛋白，賦予抗體以GPX 的催化活性。
本發(fā)明以谷胱甘肽衍生物為靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示 人單鏈抗體庫進(jìn)行篩選。得到的用于制備人源含硒單鏈抗體酶的人源單鏈抗體， 由15個氨基酸組成的短肽連接，氨基酸序列包括免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變 區(qū)；具體的單鏈抗體B3和單鏈抗體D8的氨基酸序列分別是，
B3的氨基酸序列
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GS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGHPSVFGGGTKLTVLG245;
D8的氨基酸序列
MARVQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTLTYRYLHWVRQAPGQALE WM50GWITPFNGNANYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAVYYC AR100RGAYQNGPANWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSV AL150GQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFS GS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVFGGGTKLTVLG244。
制備可溶性人源含硒單鏈抗體酶的第一種方法分離擴(kuò)增單鏈抗體基因，組 裝到原核分泌型表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)可溶性單鏈抗體蛋白，再用化 學(xué)突變法將GPX的催化基團(tuán)引入到單鏈抗體的底物結(jié)合部位。具體過程如下。
一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，可溶性 單鏈抗體的表達(dá)與純化、催化基團(tuán)的引入的過程，
所述的人單鏈抗體的篩選，是按照已有技術(shù)(見專利96112628.0和 99104234.4)的方法合成系列半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯。以合成的 半抗原為靶抗原，通過標(biāo)準(zhǔn)的免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進(jìn) 行篩選，得到能與GSH及其衍生物結(jié)合的人源單鏈抗體B3或D8。
所述的可溶性單鏈抗體的表達(dá)與純化，是在保持氨基酸序列不變的前提下， 根據(jù)篩選的單鏈抗體B3或D8的基因序列設(shè)計(jì)引物，以含有單鏈抗體基因的噬菌體單鏈DNA為模板，用引物和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增單鏈抗體基因。用 核酸內(nèi)切酶切純化的單鏈抗體基因和原核表達(dá)載體pPELB，通過酶切位點(diǎn)將單 鏈抗體基因組裝到pPELB載體上。將含有單鏈抗體基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，用異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘 導(dǎo)表達(dá)，單鏈抗體蛋白以可溶性形式分泌到菌體的周質(zhì)腔里。收集菌體，低溫下 超聲破碎，離心去除菌體沉淀。用GSH親和層析純化單鏈抗體蛋白。透析凍干 后即得單鏈抗體蛋白純品。經(jīng)電泳檢驗(yàn)為一條帶，分子量為31000道爾頓。
所述的催化基團(tuán)的引入，是用己公開的化學(xué)突變法(見專利99104234.4)將 GPX的催化基團(tuán)SeCys引入到單鏈抗體的底物結(jié)合部位。即用苯甲基磺酰氟活 化單鏈抗體中的絲氨酸(Ser)殘基上的羥基，再用硒氫化鈉處理，則將Ser突 變成SeCys。由于GSH是GPX的底物,SeCys是GPX的催化基團(tuán)，因而在該單 鏈抗體上既有GPX的底物結(jié)合部位，又有催化基團(tuán)，結(jié)果產(chǎn)生高活力的人源含 硒單鏈抗體酶。
催化基團(tuán)引入的具體方法可以是0.4-1.5X 10—5mmoI/L單鏈抗體純品溶于無 氧水中，加入2.0-6.0X 10'5mmol/L苯甲基磺酰氟，15-30 。C振蕩l-3h。 通高純 氮?dú)饧s20min以排除體系內(nèi)氧氣。加入0.5-3.0Xl(T4mol/L硒氫化鈉(NaHSe) 溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下30-40 'C反應(yīng)25-40h。取出，開蓋使其充分氧化。10000g 離心15min，上清液用SephadexG25除鹽后凍干即得具有GPX活力的人源含硒 單鏈抗體酶，其GPX活力為1005-1321U/U mol，達(dá)到天然GPX的數(shù)量級水平。
在可溶性單鏈抗體的表達(dá)與純化過程中，所述的引物，是5'端引物加入起 始密碼子和NcoI酶切位點(diǎn)，3'端引物在終止密碼子下游加入NotI酶切位點(diǎn)；或 抗 體 庫 公 共 引 物 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' 和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3'。所述的核酸內(nèi)切酶可以是Ncol和Notl。
所說的篩選陽性轉(zhuǎn)化子，可以是將轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物涂布在2xTY固體培養(yǎng)基上 (含100tig/mL氨芐青霉素和34pg/mL氯霉素)，37'C培養(yǎng)過夜，挑選在平板上 生長良好的單克隆菌落，通過DNA測序再次確定含有單鏈抗體基因的陽性轉(zhuǎn)化 子。
所說的誘導(dǎo)表達(dá)，可以是將陽性轉(zhuǎn)化子接種于2ml2xTY液體培養(yǎng)基里(含 100 )ng/mL氨芐青霉素和34 ng/mL氯霉素)，37。C振蕩培養(yǎng)至006()()為0.4-1.0。加入終濃度為0.5-1 mmol/L的IPTG， 30。C下誘導(dǎo)表達(dá)4-8 h。
所說的離心去除菌體沉淀，可以是將菌體破碎液在低溫下，S000-12000g離 心15-30min，去除菌體沉淀、獲得上清液。
制備可溶性人源含硒單鏈抗體酶的第二種方法分離擴(kuò)增單鏈抗體基因，組 裝到真核分泌型表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，表達(dá)可溶性單鏈抗體蛋白，再用化 學(xué)突變法將GPX的催化基團(tuán)引入到單鏈抗體的底物結(jié)合部位。具體過程如下。
一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，可溶性 單鏈抗體的表達(dá)與純化，催化基團(tuán)的引入的過程，
人單鏈抗體的篩選過程與第一種方法相同。
所述的可溶性單鏈抗體的表達(dá)與純化，是在保持氨基酸序列不變的前提下， 根據(jù)篩選的單鏈抗體B3或D8的基因序列設(shè)計(jì)引物，5'端引物加入起始密碼子 和EcoRI酶切位點(diǎn)，3'端引物在終止密碼子下游加入NotI酶切位點(diǎn)；以含有陽 性單鏈抗體基因的噬菌體單鏈DNA為模板，用該引物和PCR擴(kuò)增單鏈抗體基因， 用EcoRI和Notl酶切單鏈抗體基因和分泌型酵母表達(dá)載體PIC9K，通過 EcoRI/Notl酶切位點(diǎn)，將單鏈抗體基因組裝到PIC9K上；用BglII單酶切，使含 有單鏈抗體基因的表達(dá)載體線性化，將含有單鏈抗體基因的載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母感
受態(tài)細(xì)胞，在甲醇誘導(dǎo)下，在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)人源單鏈抗體蛋白；單鏈抗體 蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到培養(yǎng)基里，收集培養(yǎng)上清，濃縮后，用谷胱甘肽 親和層析純化單鏈抗體蛋白，透析凍干后即得單鏈抗體蛋白純品，再進(jìn)行催化基 團(tuán)的引入。
可溶性單鏈抗體表達(dá)與純化過程的細(xì)致步驟可以是在保持氨基酸序列不變 的前提下，根據(jù)單鏈抗體的基因序列設(shè)計(jì)引物。以含有單鏈抗體基因的噬菌體單 鏈DNA為模板，用引物和PCR技術(shù)擴(kuò)增單鏈抗體基因。用瓊脂糖凝膠電泳分離 單鏈抗體基因，用DNA膠回收試劑盒純化單鏈抗體基因。用EcoRI和Notl酶切 純化的單鏈抗體基因和分泌型酵母表達(dá)載體PIC9K，通過EcoRI/Notl酶切位點(diǎn)， 將單鏈抗體基因組裝到PIC9K上。用BglII單酶切使含有單鏈抗體基因的表達(dá)載 體PIC9K線性化，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂培養(yǎng) 平板，于3(TC培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2-3天。從培養(yǎng)平板上挑取單克隆，通過DNA測 序確定含有單鏈抗體基因的陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于BMGY培養(yǎng)基中，30。C震蕩培養(yǎng)，至OD600達(dá)2-6，室溫離心(3000rpm) 5min，棄上清，用等體 積的BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，3(TC震蕩培養(yǎng)，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)過 程中，每24h補(bǔ)充一次甲醇至終濃度0.5M，同時補(bǔ)充滅菌超純水，使培養(yǎng)液總 體積保持不變。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，每24h取lml培養(yǎng)液，離心菌體，上清用于 SDS-PAGE蛋白分析，篩選陽性克隆的高表達(dá)菌株。取高表達(dá)菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后 用適量甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，單鏈抗體蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到培養(yǎng)基里， 收集培養(yǎng)上清，經(jīng)10k分子量超濾膜濃縮20倍，用GSH親和層析純化單鏈抗體 蛋白(用pH7.5， 50mmol/LTris-Cl平衡，用含10mmol/LGSH的該緩沖液洗脫 目的蛋白)。透析凍干后即得單鏈抗體蛋白純品。經(jīng)電泳檢驗(yàn)為一條帶，分子量 為31000道爾頓。
催化基團(tuán)的引入的過程與第一種方法相同。
制備可溶性人源含硒單鏈抗體酶的第三種方法是通過基因突變法而不是化 學(xué)突變法引入催化基團(tuán)。具體過程如下。
一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，基因突 變法引入催化基團(tuán)，抗體酶的表達(dá)與純化的過程。
人單鏈抗體的篩選過程與第一種方法相同。
所述的基因突變法引入催化基團(tuán)，是在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù) 單鏈抗體的基因序列設(shè)計(jì)引物，以含有單鏈抗體基因的噬菌體單鏈DNA為模板， 用引物和PCR擴(kuò)增單鏈抗體基因，用核酸內(nèi)切酶切純化的單鏈抗體基因和原核 表達(dá)載體pPELB，通過酶切位點(diǎn)將單鏈抗體基因組裝到pPELB載體上。在保持 其它氨基酸序列不變的前提下，設(shè)計(jì)將Ser突變?yōu)榘腚装彼?Cys)的定點(diǎn)突變 引物，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品，按試劑盒 說明書操作)，將構(gòu)建在原核表達(dá)載體上的單鏈抗體基因中的0-32個絲氨酸的編 碼序列突變成Cys的密碼子(TGC) (O個是指無Ser突變的情況下也具有GPX 的活性)。通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，結(jié)果通 過基因突變在單鏈抗體的底物結(jié)合部位引入了催化基團(tuán)。
所述的抗體酶的表達(dá)與純化，是將含有突變的單鏈抗體基因的載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng) 缺陷型菌株-BL21(DE3)CysE的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽 性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys和必需的生長因子和營養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，營養(yǎng)缺陷性菌株-BL21(DE3)CysE能用Cys的密碼子 合成SeCys，最后直接表達(dá)出在GSH的底物結(jié)合部位含有SeCys的人源含硒單 鏈抗體酶，單鏈抗體酶以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周質(zhì)腔里。收集菌體， 低溫下超聲破碎，離心去除菌體沉淀。用GSH親和層析純化單鏈抗體酶。透析 凍干后即得單鏈抗體酶純品。經(jīng)電泳檢驗(yàn)為一條帶，分子量為31000道爾頓。由 于GSH是GPX的底物，SeCys是GPX的催化基團(tuán)，因而產(chǎn)生高活力的人源含硒 單鏈抗體酶。
在基因突變法引入催化基團(tuán)過程中，所述的引物，可以是5'端引物加入起 始密碼子和NcoI酶切位點(diǎn)，3'端引物在終止密碼子下游加入NotI酶切位點(diǎn)；或 者是抗體庫公共引物 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' 和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3'。所說的核酸內(nèi)切酶可以是Ncol和Notl。
在基因突變法引入催化基團(tuán)過程中，所述的定點(diǎn)突變引物，可以是根據(jù)要突 變?yōu)镃ys的Ser的位置和它比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長互補(bǔ)的兩條定 點(diǎn)突變引物，弓l物長35-50bp，以Cys的密碼子(TGC)為中心。
所說的離心去除菌體沉淀可以是將菌體破碎液在低溫下，8000 -12000g離心 15-30min，去除菌體沉淀，獲得上清液。
本發(fā)明還有第四種方法將單鏈抗體互補(bǔ)抗原決定區(qū)(CDR)的任何氨基酸 用基因突變或合成法進(jìn)行鏈重組或替換為其它氨基酸，其它不變，也可用上述三 種方法制備單鏈抗體酶，使酶的活力提高。
本發(fā)明具有以下特點(diǎn)
(1) 本發(fā)明使用簡單的抗體庫篩選、基因工程和化學(xué)突變技術(shù)，制備方法簡
單；
(2) 本發(fā)明方法制備的人源含硒單鏈抗體酶活力高，已達(dá)到天然GPX活力的 數(shù)量級水平，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)對過氧化氫損傷的心肌細(xì)胞有防護(hù)作用；
(3) 本發(fā)明方法制備的人源含硒單鏈抗體酶，可以用于人體，不會引起免疫 反應(yīng)，在生物制藥方面有廣闊的應(yīng)用前景；
(4) 本發(fā)明使用的分泌型表達(dá)載體，能將單鏈抗體蛋白以可溶性形式表達(dá)并 分泌到大腸桿菌的周質(zhì)腔或酵母的體外，引導(dǎo)蛋白分泌表達(dá)的前導(dǎo)信號肽由菌體 自動切除，所表達(dá)的蛋白為可溶性，具有天然蛋白的空間構(gòu)象和活性，不需復(fù)性，可避免包涵體復(fù)性過程造成的產(chǎn)率下降和失活，因而生產(chǎn)周期短。
這些優(yōu)點(diǎn)均有利于大規(guī)模生產(chǎn)，為今后的實(shí)際應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，解決
天然GPX來源不足的問題。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
用已有的技術(shù)(見專利99104234.4的實(shí)施例1)合成谷胱甘肽二丁酯，取 50yg的谷胱甘肽二丁酯，用二甲亞砜(DMSO)溶解后，包被在免疫平板上， 剩余位點(diǎn)用BSA封閉。以包被的谷胱甘肽二丁酯為靶抗原，用標(biāo)準(zhǔn)的免疫親和 篩選法對噬菌體展示人單鏈抗體庫進(jìn)行5輪篩選，最后再用ELISA法進(jìn)一步篩 選陽性克隆，得到與GSH親和力較高的特異性單鏈抗體B3，測序確定全部基因 和氨基酸序列。
提取噬菌體DNA，以含單鏈抗體B3基因的噬菌體DNA作為模板，采用抗 體庫公共引物(5 '-CAGGAAACAGCTATGAC-3 '和5 ' -GAATTTTCTGTATGAGG-3')做PCR擴(kuò)增單鏈抗體B3基因。將PCR產(chǎn)物在 1.2 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，應(yīng)用DNA膠回收試劑盒純化擴(kuò)增的單鏈抗體B3 基因。
將純化后的B3基因用限制性內(nèi)切酶Nco I和Not I雙酶切后，連接到同樣酶 切的載體pPELB載體上，將連接產(chǎn)物(pPELB-B3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (或 BL21)。將轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物涂布在2 x TY固體培養(yǎng)基上(含IOO ng/mL氨節(jié)青霉素 和34 pg/mL氯霉素)，37 'C培養(yǎng)過夜，挑選在平板上生長良好的單克隆菌落， 在2ml 2 x TY液體培養(yǎng)基上小量培養(yǎng)后，通過DNA測序確定含有單鏈抗體基因 的陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于2ml 2 x TY液體培養(yǎng)基里(含100 ng/mL 氨芐青霉素和34 pg/mL氯霉素)，37'C振蕩培養(yǎng)至006()()為0.6。加入終濃度為1 mmol/L的IPTG， 3(TC下誘導(dǎo)表達(dá)4h。單鏈抗體蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌 到菌體的周質(zhì)腔里，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)篩選大量表達(dá)單 鏈抗體蛋白的高表達(dá)菌株。將高表達(dá)菌株接種到1 L 2 x TY培養(yǎng)基中(含100 pg/mL氨芐青霉素，34pg/mL氯霉素)，37。C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6.加入終濃 度為1 mmol/L的IPTG (異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)，30 'C下誘導(dǎo)表達(dá)4 h。 6000rpm離心10min，收集菌體并重懸在溶液中(300 mmol/L NaCl， 20 mmol/LTris， pH 7.4， 1 mmol/L苯甲基磺酰氟)，冰浴下超聲破碎。將液體在4 °C， 8000
g離心15min，獲得上清液。按說明書處理GSH親合柱，應(yīng)用緩沖液(50 mmol/L
Tris， pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用
10 mmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人源單鏈抗體。經(jīng)
電泳檢驗(yàn)為一條帶，分子量為31KD。
1.2X 10—5mmol/L單鏈抗體純品溶于無氧水中，加入5.0X 10—5mmol/L苯甲基
磺酰氟，室溫振蕩3 h。通高純氮?dú)饧s20min以排除體系內(nèi)氧氣。加入2.0X
104inol/L硒氫化鈉(NaHSe)溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下37 。C反應(yīng)40 h。
取出，開
蓋使其充分氧化，10000 g離心15min。上清液用SephadexG25除鹽后凍干即得
人源含硒單鏈抗體酶，其GPX活力為1321u/!i mol，達(dá)到天然GPX的數(shù)量級水平。
實(shí)施例2:
按照專利99104234.4的方法合成半抗原-谷胱甘肽二丁酯，取50 u g的谷胱 甘肽二丁酯，用二甲亞砜(DMSO)溶解后，包被在免疫平板上，剩余位點(diǎn)用 BSA封閉。以包被的谷胱甘肽二丁酯為靶抗原，用標(biāo)準(zhǔn)的免疫親和篩選法對噬 菌體展示人單鏈抗體庫進(jìn)行5輪篩選，最后再用ELISA法進(jìn)一步篩選陽性克隆， 得到與GSH親和力較高的特異性單鏈抗體B3，測序確定全部基因和氨基酸序列。
在保持氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)單鏈抗體B3的基因序列設(shè)計(jì)引物(5 '-CGGAATTCATGGCCCGGGT-3'和5' -GTGCGGCCGCACCTAGGA-3' )，5 '端引物加入了起始密碼子(ATG)和EcoRI酶切位點(diǎn)，3'端引物在終止密碼 子下游加入了NotI酶切位點(diǎn)。提取噬菌體DNA，以含單鏈抗體B3基因的噬菌 體DNA作為模板，采用上述引物做PCR擴(kuò)增單鏈抗體基因。將PCR產(chǎn)物在 1.2 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，應(yīng)用DNA膠回收試劑盒純化擴(kuò)增的單鏈抗體基 因。
將純化后的單鏈抗體基因用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Not I雙酶切后，連接到 同樣酶切的分泌型酵母表達(dá)載體PIC9K上。用BglII單酶切使含有單鏈抗體基因 的表達(dá)載體(PIC9K-B3)線性化，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的酵 母細(xì)胞涂MD和MM培養(yǎng)平板，于3(TC培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 3天。能在MD和 MM上都生長的是甲醇利用快速型只能在MD上生長的是甲醇利用緩慢型。從MD和MM培養(yǎng)板上各挑取10個克隆，在2mlBMGY培養(yǎng)基中小量培養(yǎng) 后,進(jìn)行DNA測序確定含有單鏈抗體基因的陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子分別接種 于10ml BMGY培養(yǎng)基中，3(TC震蕩培養(yǎng)(225 rpm) 24h，至OD600達(dá)2-6，室 溫離心(3000 rpm) 5min，棄上清，用等體積(10ml)的BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì) 胞沉淀，30'C震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)過程中，每24h補(bǔ)充一次甲醇至終濃 度0.5%，同時補(bǔ)充滅菌超純水，使培養(yǎng)液總體積保持不變。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天， 每24h取lml培養(yǎng)液，離心菌體，上清用于SDS-PAGE蛋白分析，篩選高表達(dá) 菌株。取高表達(dá)菌株，在含1L培養(yǎng)液的5L搖瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，收集培養(yǎng)液 上清，經(jīng)10k分子量超濾膜濃縮20倍后。用GSH親和層析柱純化單鏈抗體(用 pH7.5，50 mmol/LTris-Cl平衡，用含10 mmol/L GSH的該緩沖液洗脫目的蛋白)。 收集有單鏈抗體的洗脫液，透析除鹽，凍干即得人源單鏈抗體。經(jīng)電泳檢驗(yàn)為一 條帶，分子量為31KD。
0.4X l(T5mmol/L單鏈抗體純品溶于無氧水中，加入2.0X 10'5mmol/L苯甲基 磺酰氟，30'C振蕩1.5h。通高純氮?dú)饧s20min以排除體系內(nèi)氧氣。加入0.5X 10^mol/L硒氫化鈉(NaHSe)溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下40'C反應(yīng)25 h.取出，開蓋 使其充分氧化。10000 g離心15min.上清液用SephadexG25除鹽后凍干即得人 源含硒單鏈抗體酶Sec -B3，其GPX活力為1235U/U mol，達(dá)到天然GPX的數(shù) 量級水平。
實(shí)施例3:
用已有的技術(shù)(見專利99104234.4的實(shí)施例1)合成谷胱甘肽二丁酯，取 50ug的谷胱甘肽二丁酯，用二甲亞砜(DMSO)溶解后，包被在免疫平板上， 剩余位點(diǎn)用BSA封閉。以包被的谷胱甘肽二丁酯為靶抗原，用標(biāo)準(zhǔn)的免疫親和 篩選法對噬菌體展示人單鏈抗體庫進(jìn)行5輪篩選，最后再用ELISA法進(jìn)一步篩 選陽性克隆，得到與GSH親和力較高的特異性單鏈抗體B3，測序確定全部基因 和氨基酸序列。
提取噬菌體DNA，以含單鏈抗體B3基因的噬菌體DNA作為模板，采用抗 體庫公共引物(5 '-CAGGAAACAGCTATGAC-3 '和5 ' -GAATTTTCTGTATGAGG-3')做PCR擴(kuò)增單鏈抗體B3基因。將PCR產(chǎn)物在 1.2 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。應(yīng)用DNA膠回收試劑盒純化擴(kuò)增的單鏈抗體B3基因。將純化后的B3基因用限制性內(nèi)切酶NcoI和Notl雙酶切后，連接到同樣 酶切的載體pPELB載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)63號絲 氨酸比鄰的氨基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，引物長 35-50bp，以Cys的密碼子(TGC)為中心。用這兩條完全互補(bǔ)的引物和快速定 點(diǎn)突變試劑盒(Invitrogen公司，按試劑盒說明書操作)，將構(gòu)建在原核表達(dá)載 體pPelB上的單鏈抗體基因第63號絲氨酸的編碼序列(TCA)突變成Cys的密 碼子(TGC)，通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生。
用裝有突變的單鏈抗體基因的載體(pPelB-B3)轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌 BL21 (DE3) CysE，涂含有Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn) 化子接種于1.2LM9表達(dá)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100yg/ml氨芐青霉素、 50 n g/ml卡那霉素、50 u g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 n g/ml) 中至OD600為0. 1 ，培養(yǎng)至0D600約為0. 3-1,加入終濃度0. 1-lmM的IPTG， 10min 后加入終濃度10ng/ml的氯霉素。加入氯霉素五分鐘后培養(yǎng)液離心，低溫 6000rpra離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩次，每次用1. 2L，然后用生產(chǎn)培 養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400u g/ml)重懸， 并向培養(yǎng)基中補(bǔ)充終濃度400 ng的利福平和600 uM DL — SeCys。繼續(xù)培養(yǎng) 2-12h，使單鏈抗體酶以可溶性形式表達(dá)在菌體的周質(zhì)腔里。收集菌體(6000rpm， 10min)并用等體積的bufferT (50mM Tris buffer, pH7. 5，含lmM EDTA)洗滌 兩次。用BufferT重懸菌體沉淀，加入終濃度lmM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超 聲破碎菌體，4°C， 12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱， 應(yīng)用緩沖液(50 mmol/L Tris， pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用 平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用10 mmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍 干，即得人源單鏈抗體酶。經(jīng)電泳檢驗(yàn)為一條帶，分子量為31KD。其GPX活力 為1289U/u mol，達(dá)到天然GPX的數(shù)量級水平。
實(shí)施例4:
以谷胱甘肽二異戊酯為靶抗原進(jìn)行篩選，篩選方法與實(shí)施例1完全相同，得 到單鏈抗體D8?？贵w的表達(dá)、純化和催化基團(tuán)的引入也與實(shí)施例1完全相同。 得人源含硒單鏈抗體酶Sec-D8，其GPX活力為1005U/n mol，達(dá)到天然GPX的數(shù) 量級水平。實(shí)施例5
以谷胱甘肽二異戊酯為靶抗原進(jìn)行篩選，篩選方法與實(shí)施例1完全相同，得 到單鏈抗體D8?？贵w的表達(dá)、純化和催化基團(tuán)的引入與實(shí)施例2完全相同，只 是基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)要根據(jù)D8的基因序列決定。得人源含硒單鏈抗體酶 Sec-D8，其GPX活力為1098U/umol，達(dá)到天然GPX的數(shù)量級水平。
實(shí)施例6
以谷胱甘肽二異戊酯為靶抗原進(jìn)行篩選，篩選方法與實(shí)施例1完全相同，得 到單鏈抗體D8。抗體的表達(dá)、純化和催化基團(tuán)的引入與實(shí)施例3完全相同，只 是基因突變引物的設(shè)計(jì)要根據(jù)D8要突變的具體Ser的位置和它比鄰的基因序列 決定。得到人源含硒單鏈抗體酶Sec-D8，其GPX活力為1065U/ymo1，達(dá)到天然 GPX的數(shù)量級水平。
權(quán)利要求
1. 一種用于制備人源含硒單鏈抗體酶的人源單鏈抗體，其特征是，由15個氨基酸組成的短肽連接，氨基酸序列包括免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區(qū)；人源單鏈抗體B3和人源單鏈抗體D8的氨基酸序列分別是，B3的氨基酸序列MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWM50GWINAGNGNTKYS63QKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR100RGAYQNGPANWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSVAL150GQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGHPSVFGGGTKLTVLG245；D8的氨基酸序列MARVQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTLTYRYLHWVRQAPGQALEWM50GWITPFNGNANYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR100RGAYQNGPANWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSVAL150GQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVFGGGTKLTVLG244。
2、 一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，可 溶性單鏈抗體的表達(dá)與純化，催化基團(tuán)的引入的過程，其特征是，所述的人單鏈抗體的篩選，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯為 靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進(jìn)行篩選，得到能 與谷胱甘肽及其衍生物結(jié)合的人源單鏈抗體B3或D8;所述的可溶性單鏈抗體的表達(dá)與純化，是在保持氨基酸序列不變的前提下， 根據(jù)篩選獲得的單鏈抗體B3或D8的基因序列設(shè)計(jì)引物；以含有單鏈抗體基因 的噬菌體單鏈DNA為模板，用引物和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增單鏈抗體基因；用核酸 內(nèi)切酶切單鏈抗體基因和分泌型原核表達(dá)載體pPELB，通過酶切位點(diǎn)將單鏈抗 體基因組裝到pPELB載體上；將含有單鏈抗體基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子；用異丙基-P-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)后，單 鏈抗體蛋白以可溶性形式分泌到菌體的周質(zhì)腔里；收集菌體，低溫下超聲破碎， 離心去除菌體沉淀；用谷胱甘肽親和層析純化單鏈抗體蛋白，透析凍干后即得單 鏈抗體蛋白純品；再進(jìn)行催化基團(tuán)的引入。
3、 按照權(quán)利要求2所述的可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，其特征 是，所述的引物，是5'端引物加入起始密碼子和Ncol酶切位點(diǎn)，3'端引物在 終止密碼子下游加入Notl酶切位點(diǎn)；或者是5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3';所述的核酸內(nèi)切酶是Ncol和Notl。
4、 一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，可 溶性單鏈抗體的表達(dá)與純化，催化基團(tuán)的引入的過程，其特征是，所述的人單鏈抗體的篩選，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯為 靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進(jìn)行篩選,得到能 與谷胱甘肽及其衍生物結(jié)合的人源單鏈抗體B3或D8;所述的可溶性單鏈抗體的表達(dá)與純化，是在保持氨基酸序列不變的前提下， 根據(jù)篩選獲得的單鏈抗體B3或D8的基因序列設(shè)計(jì)引物，5'端引物加入起始密 碼子和EcoRI酶切位點(diǎn)，3'端引物在終止密碼子下游加入NotI酶切位點(diǎn)；以含 有陽性單鏈抗體基因的噬菌體單鏈DNA為模板，用引物和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增單 鏈抗體基因，用EcoRI和Notl酶切單鏈抗體基因和分泌型酵母表達(dá)載體PIC9K， 通過EcoRI/Notl酶切位點(diǎn)，將單鏈抗體基因組裝到PIC9K上；用BglII單酶切， 使含有單鏈抗體基因的表達(dá)載體線性化，將含有單鏈抗體基因的載體轉(zhuǎn)化畢赤酵 母感受態(tài)細(xì)胞，在甲醇誘導(dǎo)下，在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)人源單鏈抗體蛋白，單鏈 抗體蛋白以可溶性形式表達(dá)并分泌到培養(yǎng)基里，收集培養(yǎng)上清，濃縮后，用谷胱 甘肽親和層析純化單鏈抗體蛋白，透析凍干后即得單鏈抗體蛋白純品；再進(jìn)行催 化基團(tuán)的引入。
5、 一種可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，有人單鏈抗體的篩選，基 因突變法引入催化基團(tuán)，抗體酶的表達(dá)與純化的過程，所述的人單鏈抗體基因的篩選，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二 酯為靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進(jìn)行篩選，得 到能與谷胱甘肽及其衍生物結(jié)合的人源單鏈抗體B3或D8;所述的通過基因突變引入催化基團(tuán)，是在保持氨基酸序列不變的前提下，根 據(jù)篩選獲得的單鏈抗體B3或D8的基因序列設(shè)計(jì)引物；以含有單鏈抗體基因的 噬菌體單鏈DNA為模板，用引物和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增單鏈抗體基因，用核酸內(nèi) 切酶切單鏈抗體基因和分泌型原核表達(dá)載體pPELB,通過酶切位點(diǎn)將單鏈抗體基因組裝到pPELB載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，設(shè)計(jì)將Ser 突變?yōu)镃ys的定點(diǎn)突變引物，用定點(diǎn)突變引物和快速定點(diǎn)突變試劑盒將構(gòu)建在原 核表達(dá)載體上的單鏈抗體基因中的0-32個絲氨酸的編碼序列突變成Cys的密碼 子，通過DNA測序確定突變成功，結(jié)果通過基因突變在單鏈抗體的底物結(jié)合部 位引入了催化基團(tuán)；所述的抗體酶的表達(dá)與純化，是將含有突變的單鏈抗體基因的載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng) 缺陷性菌株-BL21(DE3)CysE的感受態(tài)細(xì)胞，涂含Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽 性轉(zhuǎn)化子，將陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培養(yǎng)后，在含有SeCys和必需的生長因子和營養(yǎng)素的 培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基-P-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)，營養(yǎng)缺陷性菌株-BL21(DE3)CysE 能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達(dá)出在谷胱甘肽的底物結(jié)合部位含有 SeCys的人源含硒單鏈抗體酶，單鏈抗體酶以可溶性形式表達(dá)并分泌到菌體的周 質(zhì)腔里；收集菌體，低溫下超聲破碎，離心去除菌體沉淀，用谷胱甘肽親和層析 純化單鏈抗體酶，透析凍干后即得單鏈抗體酶純品。
6、 按照權(quán)利要求5所述的可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，其特征 是，所述的引物，是5'端引物加入起始密碼子和Ncol酶切位點(diǎn)，3'端引物在 終止密碼子下游加入Notl酶切位點(diǎn)；或者是5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3';所述的核酸內(nèi)切酶是Ncol和Notl。
7、 按照權(quán)利要求5或6所述的可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法，其 特征是，所述的定點(diǎn)突變引物，是根據(jù)要突變?yōu)镃ys的Ser的位置和它比鄰的氨 基酸的基因序列設(shè)計(jì)完全等長互補(bǔ)的兩條定點(diǎn)突變引物，引物長35-50bp，以Cys 的密碼子為中心。
全文摘要
本發(fā)明的可溶性人源含硒單鏈抗體酶的制備方法屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。以谷胱甘肽衍生物為靶抗原，通過免疫親和篩選法對重組噬菌體展示人單鏈抗體庫進(jìn)行篩選，得到單鏈抗體B3和D8。將單鏈抗體基因組裝到分泌型原核或真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌或酵母細(xì)胞，在原核或真核中表達(dá)并純化單鏈抗體蛋白；用化學(xué)突變法在抗體的底物結(jié)合部位引入GPX的催化基團(tuán)SeCys?；蛴没蛲蛔兗夹g(shù)和營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌直接表達(dá)在底物結(jié)合部位含有GPX催化基團(tuán)的可溶性單鏈抗體蛋白，賦予抗體以GPX的催化活性。本發(fā)明的制備方法簡單；制備的人源含硒單鏈抗體酶活力高；所表達(dá)的蛋白為可溶性；有利于大規(guī)模生產(chǎn)，在生物制藥方面有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/81GK101280015SQ20081005055
公開日2008年10月8日 申請日期2008年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日
發(fā)明者劉慧娟, 徐俊杰, 唯 李, 李杰帥, 羅貴民, 羅際巡, 閻崗林, 銳 霍, 魏景艷 申請人:吉林大學(xué)