含反式剪接核糖酶及治癌基因的重組腺病毒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含作用于癌細胞特異基因的對反式剪接核糖酶(trans-splicing?ribozyme)-HSVtk復合體進行編碼的多核苷酸(polynucleotide)及治癌基因的重組腺病毒，作為有效成分含所述重組腺病毒的防癌或治癌醫(yī)藥合成物，以及治癌方法，所述治癌方法包括把所述重組腺病毒或醫(yī)藥合成物投入所需個體的步驟。本發(fā)明的重組腺病毒通過作用于癌特異性基因的反式剪接核糖酶，對癌細胞表現(xiàn)選擇性，還表現(xiàn)更高的抗癌活性，可以廣泛應用于有效的防癌及抗癌治療。
【專利說明】含反式剪接核糖酶及治癌基因的重組腺病毒及其用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及含反式剪接核糖酶及治癌基因的重組腺病毒及其用途，尤其涉及一種含作用于癌細胞特異基因的對反式剪接核糖酶(trans-splicing ribozyme)-HSVtk復合體進行編碼的多核苷酸(polynucleotide)及治癌基因的重組腺病毒，作為有效成分含所述重組腺病毒的防癌或治癌醫(yī)藥合成物，以及治癌方法，所述治癌方法包括把所述重組腺病毒或醫(yī)藥合成物投入所需個體的步驟。
【背景技術】
[0002]癌癥是韓國死亡原因排名第一的重大疾病，為了征服癌癥，目前為止人類做了很多研究，但還沒有完全征服，是難以治療的病癥。癌癥治療方法有傳統(tǒng)的手術、化學療法及放射療法等，但各種療法局限性大。因此，目前研究之外的一些治療方法，其中基因療法可以說研究得特別多。
[0003]基因治療(gene therapy)是指針對很難通過普通方法治療的先天性或后天性基因異常，以基因工學方法進行治療的方法。具體地，基因治療為了防治先天或后天基因缺陷、病毒性疾病、癌癥或心血管疾病等慢性疾病，向體內(nèi)投入DNA及RNA等遺傳物質(zhì)，讓治療蛋白表達或抑制特定蛋白表達，對疾病的原因從基因?qū)用娼忉專梢愿渭膊?，不僅可以克服疑難雜癥，還可望成為替代現(xiàn)有醫(yī)療方式的有效手段。
[0004]癌癥的基因治療可再分為誘發(fā)人體內(nèi)免疫反應的免疫學基因療法及利用基因直接破壞癌細胞或誘導其滅亡的基因療法。后者來說，把基因搬運到細胞內(nèi)部并使之表達(expression)的載體(vector)作用非常重要,腺病毒的載體由于基因傳達效率高、向未分化細胞傳達基因的能力強 、可制造高值效價病毒儲藏物的性能，被認為是最有希望的基因治療載體之一。
[0005]通常使用的基因治療腺病毒載體放入刪除復制必需的一連串基因、啟動子(promoter)活性水平高的巨細胞病毒(cytomegalovirus:CMV)或勞氏肉瘤病毒(Roussarcoma virus:RSV)啟動子，在生物體內(nèi)以很高的效率表達治療目的蛋白。
[0006]然而用于基因治療的標志基因很多在經(jīng)常做細胞分裂的普通細胞上也會表達，產(chǎn)生副作用。為了降低這種副作用，目前試圖嘗試癌細胞特異性治療(cancer tissuetargeted therapy) (Fukuzawa et al., Cancer Res64:363-369, 2004)。為此代替 CMV 或RSV,考慮使用組織特異性(tissue-specific)啟動子,而該方法雖然可以提高特異性但會降低療效，很難達到實用要求。
[0007]為了解決所述缺點，目前正在研究使用組織特異性啟動子以外的因子，開發(fā)組織特異性治癌腺病毒，其中代表性的有使用反式剪接核糖酶等的方法。
[0008]所述利用反式剪接核糖酶的組織特異性治癌腺病毒開發(fā)相關研究，探明了嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)的I組內(nèi)含子(intron)核糖酶不僅在試驗管內(nèi)執(zhí)行反式剪接反應，還在人體細胞內(nèi)執(zhí)行該反應，連接分別獨立存在的兩個轉轉錄體，從而受到廣泛矚目。[0009]具體地，以這種I組內(nèi)含子為基礎的反式剪接核糖酶以只在與疾病相關的基因轉錄體或疾病細胞表達的特定RNA為目標，補正這些，使它們成為正常RNA，或者誘發(fā)重編、使它們置換為新的治療用基因轉錄體，預計會成為兼具疾病特異性及安全的基因治療技術。另外，反式剪接核糖酶去除疾病特意RNA的同時，可以誘導出我們需要的治療用基因產(chǎn)物的表達，可以加大治療效果。
[0010]特別是，隨著最近研究成果發(fā)現(xiàn)可捕捉在癌組織起特異性作用的hTERT (humanTelomerase reverse transcriptase)為標志的反式剪接核糖酶,大家利用此開發(fā)癌治療劑的研究越發(fā)活躍，但目前為止還沒有顯著的結果。
[0011]基因療法中使用的治療用基因有單純皰疹病毒(HSV:herpes simplex virus)胸苷激酶(Thymidine kinase)(以下略稱為HSVtk),大腸菌胞嘧唳脫氨酶(cytosinedeaminase) (CD)及大腸菌的嘌呤核苷憐酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase)(以下略稱為PNP)基因等。利用這些的基因治療稱為基因定向酶前驅(qū)體治療(gene-directedenzyme prodrug therapy,⑶EPT),全部帶著使用前驅(qū)體的共同點。⑶EPT使用的前驅(qū)體為更昔洛韋(ganciclovir)、5_氟二氧嘧唳(5-fluorouracil) (5-FU)及6-甲基嘌呤-2-脫氧核苷(6-methylpurine-2-deoxyriboside) (6-MeP-dR),分別以 HSV-TK、CD 及 PNP 形式使用。沒有細胞毒性的前驅(qū)體，在引入的基因作用下被轉變成對細胞有毒性的藥物，主要在磷酸化作用下產(chǎn)生活性。利用自殺基因的基因療法的優(yōu)點是，引入這些基因的細胞所激活的藥物連鄰近細胞也會凋亡，有旁觀者效應。這是基因引入效率低時可以采取的最好戰(zhàn)略技術。
[0012]這種基因治療戰(zhàn)略中，利用HSVtk的方法相當普遍。具體地HSVtk/GCV體系是自殺基因療法中最廣泛使用的方法之一，由W090/07936、US5，837，510、US5, 861,290、W098/04290、W097/37542及US5，631，236中公開。表達HSVtk基因的細胞可以磷酸化更昔洛韋(GCV)，結果妨礙DNA復制作用，可誘導細胞的凋亡。該方法目前用于人類各種癌癥的30多種基因治療臨床試驗中。但是，這只會讓增殖的細胞凋亡，而旁觀者相應并不顯著，大量使用時，會引發(fā)細胞毒性問題。因此使用兩種以上前驅(qū)體，征服癌癥的相關研究正在進行。
[0013]另外F1D-1 (programmed death-Ι)為55kDa的第I型跨膜蛋白，形成Ig基因的一部分，是屬于免疫球蛋白(immunoglobulin)分子群的T細胞輔助阻礙分子。及F1D-1是屬于在活化B細胞、T細胞及骨髓細胞中表達的受體⑶28群(比如，包括⑶28、CTLA-4、ICOS及BTLA)的的抑制因子之一。I3D-1的配合基(ligand)有TO-Ll及TO-L2，這些與TO-1結合時向下調(diào)節(jié)τ細胞的活化。ro-1在正常狀態(tài)下T細胞上不表達，在所述細胞活化時表達會增加。另外，PD-Ll發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)人類癌中，PD-1與I3D-Ll之間的相互作用，向T細胞傳達刺激或抑制信號。及ro-1與ro-Li的相互作用下，腫瘤的侵襲性淋巴球降低，τ細胞受體介導增殖會降低，癌細胞會產(chǎn)生免疫豁免現(xiàn)象。從而，目前正在進行通過切斷ro-1或ro-Li的信號傳達，有效誘導抗癌免疫反應，治療癌癥的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]發(fā)明的課題
[0015]本發(fā)明的各發(fā)明人為了開發(fā)同時提高組織特異性和治療效能的治癌基因治療方案，努力研究的結果，發(fā)現(xiàn)含癌組織特異性對反式剪接核糖酶HSVtk (Herpes SimplexVirus Thymidine Kinase)復合體進行編碼的多核苷酸及治癌基因sPD_l基因的重組腺病毒對癌組織有優(yōu)秀治療效果，還可以顯著降低基因治療帶來的副作用，完成了本發(fā)明。
[0016]實施方案
[0017]本發(fā)明的目的在于提供一種含作用于癌特異性基因的對反式剪接核糖酶-HSVtk復合體進行編碼的多核苷酸及治癌基因的重組腺病毒。
[0018]本發(fā)明的另一目的為提供一種作為有效成分含所述重組腺病毒的的防治癌癥的治療用藥學合成物。
[0019]本發(fā)明的又一目的為提供一種包括把所述重組腺病毒或藥學合成物投入到需治療個體的步驟的除人類之外的治療動物癌的方法。
[0020]發(fā)明效果
[0021]由于重組腺病毒含作用于癌特異性基因的反式剪接核糖酶，對癌細胞表現(xiàn)選擇性，而且含治癌基因，表現(xiàn)較高的抗癌活性，可以有效防治癌癥。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為以老鼠TERT為標志的反式剪接核糖酶(mTERT-TR)-HSVtk概略示意圖。老鼠TERT(mTERT)轉錄物的標志部位以剪接部位周圍的序列表示。反式剪接核糖酶利用抗轉錄(antisense) mTERT RNA 序列，特異認知 mTERT RNA,在 IGS( internal-guided-sequence)的3’末端，切斷mTERT RNA。反式剪接核糖酶的HSVtk編碼RNA部分的5’末端，連接在mTERT RNA切斷的末端。mTERT標志mRNA及核糖酶之間的有可能的堿基結合通過豎線表示。
[0023]圖2為老鼠TERT-TR的腺病毒HSVtk基因表達調(diào)節(jié)效果示意圖。(a)表示缺乏El/E3的腺病毒Ad5mTR在老鼠的TERT-TR調(diào)節(jié)下讓HSVtk表達的結果示意圖。Ad5M0CK是缺乏E1/E3的腺病毒的對比群。(b)是把CT26細胞(3X IO3)接種于96-孔板后，以100 μ M GCV條件下，暴露在多種MOI的Ad5M0CK或Ad5mTR的結果示意圖。使用細胞增殖分析工具檢測的感染3天細胞毒性結果示意圖。資料為分三次進行的分析實驗平均土標準偏差結果值。(c)向 BALB/c 老鼠注射 5 X IO8PFU 的 Ad5M0CK 或 Ad5mTR 后，每天腹腔注射 GCV (75mg/kg)兩次，在其兩側面皮下接種CT26細胞(IX IO6)的結果示意圖。資料以平均土SEM (n=5)表
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[0024]圖3為通過HSVtk誘導，效果得到提高的DC-介導性(mediated)抗原提呈(Antigen presenting)效果示意圖。(a)向C57/BL6老鼠的E.G7腫瘤注射Ad5M0CK或Ad5mTR。四天后收取腫瘤，通過H&E染色，進行組織學分析。(b)注射腺病毒2日后，通過使用抗-⑶IIc微珠的MACS色層分析(chromatography),從E.G7腫瘤周圍的吸收性淋巴結收取DCs (5X IO4)后，通過OT-1形質(zhì)轉換老鼠共同培養(yǎng)OVA特異性⑶8T細胞。在72小時候，收取培養(yǎng)上層液，檢測了 IFN- Y量。DC-Ad5M0CK表示從注射Ad5M0CK的老鼠收取的DCs，⑶-Ad5mTR表示從注射Ad5mTR的老鼠獲取的DCs。資料以平均值土標準偏差值表示。
[0025]圖4為讓mTERT-TR-調(diào)節(jié)性HSVtk及sH)l-1g表達的雙重-模塊腺病毒制造方法示意圖。(a)Ad5mTR.sPDl在El領域的CMV啟動子調(diào)節(jié)下對mTERT-TR-HSVtk進行編碼，在E3領域的EFla啟動子調(diào)節(jié)下對sPDl_Ig進行編碼。(b)向HEK293細胞(4X IO5)感染48小時2M0I腺病毒，使用RIPA緩沖液進行破碎后，進行免疫印跡(Immunoblot)分析。通過Ad5mTR.sPDl (每道蛋白80 μ g)進行的sPDl_Ig表達，使用抗-PDl抗體確認。(c)磷酸化GCV中HSVtk酶活性通過檢測以放射性同位素標記的PCV (I μ Ci/ml)的累積量，通過CT26細胞評價。資料對3次分析實驗結果以平均土標準偏差值表示。(d)從感染IOMOI腺細胞的細胞收取培養(yǎng)上層液，向其混合從OT-1老鼠提純的OVA-特異性⑶8T細胞(I X IO6)及1^38/0￥4細胞(1父104)共同培養(yǎng)物。在72小時候收取培養(yǎng)上層液，檢測了 IFN-Y水平。資料以平均土標準偏差值表示。[0026]圖5是在老鼠CT26大腸癌細胞表面，表達I3D-Ll的示意圖。a.總RNA由各細胞制造，PD-Ll轉錄體通過RT-PCR檢測。把肝癌細胞(Ifepa-1)作為對比群使用，進行分析。b.通過流式細胞術分析了各細胞表面的ro-Li蛋白。
[0027]圖6為Ad5mTR.sPDl的生物體外及生物體內(nèi)抗-腫瘤活性示意圖。(a)與100 μ MGCV—起，以多種MOI的Ad5M0CK，Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl感染CT26細胞。3日后，以圖1d方法檢測了細胞毒性。資料對3次分析實驗結果以平均土標準偏差值表示。(b)在BALB/c老鼠的兩邊，皮下接種CT26細胞(I X IO6)。對所述腫瘤，以5 X IO8PFUDE Ad5M0CK、Ad5EFl α.sPDl、Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl處理。每天腹腔注射2次GCV (75mg/kg)。腫瘤皮膚在指定的時間檢測并表示。資料以平均土SEM (n=10)表示。
[0028]圖7表示sPDl-1g依存腫瘤成長抑制由CD8T細胞介導。(a)向BALB/c老鼠的皮下CT26腫瘤注射Ad5M0CK、Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl (左側板)。sPDl-1g的抗-腫瘤活性中，為了決定⑶8T細胞相關性，想C57/BL6老鼠的皮下CT26腫瘤注射Ad5M0CK、Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl(右側板)。處理病毒2日前及處理后的每5日，向老鼠靜脈注射2.43 α抗-⑶8抗體(50(^8)，枯竭0081'細胞(右側板)。箭頭表示抗體注射時間。腫瘤皮膚在指定的時間測試并表示。(b)2.43a抗-CD8抗體存在或不存在時，對腫瘤抑制情況，在第12日以對Ad5M0CK的相對值進行計算。資料以平均土 SEM表示。
[0029]圖8為缺乏T及B細胞的Ragl-/-老鼠中sPDl_Ig腫瘤增殖抑制效果示意圖。Ca)向 C57/BL6 皮下注射的 E.G7 腫瘤，注射 Ad5M0CK、Ad5mTR 或 Ad5mTR.sPDl (左側板)。sPDl-1g的抗-腫瘤活性中，為了檢測淋巴球相關性，向Ragl-/-老鼠皮下注射的E.G7腫瘤，注射Ad5M0CK、Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl (右側板)。腫瘤的成長按指定的時間計算并表示。(b) Ragl-/-老鼠或野生型老鼠的腫瘤成長調(diào)節(jié)，在第12日相對于Ad5M0CK進行相對計算。(c)對 Ragl-/-老鼠的 E.G7 腫瘤(I X IO6 細胞)，以 5 X IO8PFU 的 Ad5M0CK、Ad5mTR、Ad5mTR.sPDl，每隔7日注射并注射2次。向OT-1老鼠最初進行腺病毒注射時同時靜脈注射⑶8T細胞(1X104)。腫瘤的成長按指定時間計算并表示。資料以平均土SEM (n=6)表示。(d)為了進行免疫細胞的生物體外分析，把Ragl-/-老鼠的E.G7腫瘤與來自OT-1老鼠的CD8T細胞及適當?shù)南俨《竟餐囵B(yǎng)。最初注射腺病毒8日后，從老鼠的眼球靜脈收取PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)。通過流式細胞分析，從整體生存細胞算出0T-1CD8T細胞數(shù)，算出了 TCR Va2+，νβ+，Τ細胞(0T-1細胞)的比例。
[0030]圖9為通過Ad5mTR.sPDl處理時的2次腫瘤抑制效果示意圖。(a)把CT26腫瘤皮下移植到BALB/c老鼠，每隔3日注射I次，共3次注射5 X IO8PFU的Ad5mTR.sPDl0最初處理2周后，在想反側接種I X IO6個腫瘤細胞。最初注射病毒I周后，開始腹腔注射GCV (75mg/kg)，注射共12日。每三天檢測一次腫瘤大小。(b)向C57/BL6老鼠皮下移植E.G7腫瘤腫瘤，執(zhí)行與所述(a)相同的方法。(c)接種2次腫瘤7日后，以事先用Ad5mTR.sPDl處理的老鼠和未處理的老鼠，檢測了接種部位腫瘤大小。資料以平均土標準偏差值表示。
【具體實施方式】
[0031]為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種重組腺病毒，包括作用于癌特異性基因TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA (序列號 I)的對反式剪接核糖酶-HSVtk(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase)復合體進行編碼的多核苷酸及治癌基因。
[0032]本發(fā)明的單詞“癌特異性基因”是指只有癌細胞特異表達或顯著過表達的基因。所述癌特異性基因形成讓本發(fā)明的核糖酶對癌特異反應的基礎。這種癌特異性基因包括但不限于 TERT (Telomerase reverse transcriptase)的 mRNA、AFP(alphafetoprotein)mRNA、CEA(carcinoembryonic antigen)mRNA、PSA (Prostate-specific antigen)mRNA、或CKAP2(Cytoskeleton-associated protein2) mRNA 等。 [0033]本發(fā)明的單詞“TERT(Telomerase reverse transcriptase)”是調(diào)節(jié)癌細胞的永續(xù)性(immortality)及增殖(proliferation)能力的最重要的酶之一,在染色體上形成端粒(telomere)結構,通過保護染色體末端、抑制細胞的老化。正常細胞的機理來看，分裂時端粒的長度逐漸變短，最終遺傳物質(zhì)損失，細胞死亡。而癌細胞由于該酶讓端粒持續(xù)延長，直接作用于癌細胞的不滅性，是治癌的重大障礙因素。這種端粒酶(telomerase)在無限復制的生殖細胞、造血細胞及癌細胞中，有80至90%有端粒酶活性，而癌細胞周圍的正常細胞不具有這種活性。從本發(fā)明的目的來看，所述TERT可以作為本發(fā)明提供的治癌基因直接標志使用，但不受限于此。
[0034]本發(fā)明的單詞“核糖酶”是指表現(xiàn)反式剪接活性及自我剪接(self-splicing)活性的具有酶活性的RNA分子。本發(fā)明的目的來看，所述核糖酶通過反式剪接反應，阻礙癌特異性基因的活性，最終不僅可以表現(xiàn)出選擇性的抗癌效果，還可以以與治癌基因結合的形式表達，活化治癌基因，只要可以讓癌特異性基因失活、讓治癌基因得到激活的話，可以使用任何形式。最好是使用認知對癌癥有特異性的TERT (Telomerase reversetranscriptase)的mRNA,反式剪接能力得到驗證的hTERT標志反式剪接I組核糖酶Rib67核糖酶或由具有序列號2的堿基序列的多核苷酸編碼的核糖酶，但不限于此。
[0035]本發(fā)明的單詞“HSVtk(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase)” 是指來自單純皰疫病毒(HSV:herpes simplex virus)的胸苷激酶(thymidine kinase)。該酶把沒有毒性的前驅(qū)體轉變成毒性物質(zhì)，讓吸入該基因的細胞凋亡，是典型的藥敏化基因(drug-sensitizing gene)之一。本發(fā)明的目的來說,所述HSVtk基因可以與核糖酶結合的形式表達，作為表現(xiàn)抗癌活性的治癌基因。這種HSVtk基因最好是具有以序列號3表示的堿基序列，可以是但不限于基因庫(genbank)注冊號AAP13943、P03176、AAA45811、P04407、Q9QNF7、KIBET3、P17402、P06478、P06479、AAB30917、P08333、BAB84107、AAP13885、AAL73990、AAG40842、BABl 1942、NP_044624、NP_044492、CAB06747 等記載的。
[0036]本發(fā)明的單詞“治癌基因(ant1-cancer therapeutic gene)”是指對多肽(polypeptide)進行編碼的多核苷酸(polynucleotide)序列,所述多肽在癌細胞內(nèi)表達時表現(xiàn)治療效果。本發(fā)明中，所述治癌基因以與所述核糖酶結合的形式表達或獨立表達，表現(xiàn)抗癌活性。本發(fā)明的目的來看，所述治癌基因包括但不限于藥敏化基因、抑制細胞增殖基因、細胞毒性基因、腫瘤抑制因子基因、抗原性基因、細胞因子基因、抗血管生成基因等。本發(fā)明中，可以單獨使用或組合兩種以上使用所述治癌基因。
[0037]本發(fā)明的“藥敏化基因(drug-sensitizing gene) ”是指把沒有毒性的前驅(qū)體(prodrug)轉換成毒性物質(zhì)的酶相關基因，由于吸入基因的細胞會死亡，又稱自殺基因(suicide gene)。即，把在正常細胞中沒有毒性的前驅(qū)體投入全身時，前驅(qū)體只在癌細胞中轉變成毒性代謝產(chǎn)物(toxic metabolite),改變對藥劑的敏感性，破壞癌細胞。本發(fā)明的目的來看，所述藥敏化基因包括但不限于HSVtk(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase)基因、更昔洛韋(ganciclovir)、大腸菌的胞嘧唳脫氨酶(cytosine deaminase,⑶)基因、5-氟胞嘧唳(5-fluorocytosine, 5-FC)等。
[0038]本發(fā)明的單詞“細胞凋亡基因(proapoptotic gene)”是指表達后誘導程序化細胞凋亡的核苷酸序列。本發(fā)明的目的來看，所述細胞凋亡基因包括但不限于P53、腺病毒E3-11.6k (來自Ad2及Ad5)或腺病毒E3-10.5k (來自Ad)、腺病毒E4基因、p53路徑基因、編碼胱天蛋白酶(Caspase)的基因等。
[0039]本發(fā)明的單詞“細胞增殖抑制基因(cytostatic gene)”是指在細胞內(nèi)表達，在細胞周期中間停止細胞周期的核苷酸序列。本發(fā)明的目的來看，所述細胞增殖抑制基因包括但不限于p21、視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma)基因、E2F-Rb結合蛋白基因、對循環(huán)-從屬性激酶(kinase)抑制因子進行編碼的基因(比如、pl6、pl5、pl8及pl9)、停止生長特異性同源框(growth arrest specific homeobox, GAX)基因。
[0040]本發(fā)明的單詞“細胞毒性基因(Cytotoxic gene)”是指在細胞內(nèi)表達，表現(xiàn)毒性效果的核苷酸序列。本發(fā)明的目的來看，所述細胞毒性基因包括但不限于對假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、蓖麻毒素(ricin)、白喉毒素(diphtheria toxin)進行編碼的核苷酸序列等。
[0041]本發(fā)明的單詞“腫瘤抑制因子基因(tumor suppressor gene)”是指在細胞內(nèi)表達，可抑制腫瘤表現(xiàn)型或可誘導細胞凋亡的核苷酸序列。本發(fā)明的目的來看，所述腫瘤抑制因子包括但不限于腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor- α , TNF- α )、ρ53基因、APC基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-1基因、BRCA-2基因、WT-1基因、視網(wǎng)膜母細胞瘤基因、MMAC-1基因、腺瘤息肉病線圈蛋白質(zhì)(adenomatous polyposis coil protein)、缺損的結腸腫瘤(DCC)基因、麗SC-2基因、NF-1基因、位于染色體3p21.3的鼻咽喉腫瘤抑制基因、MTSl基因、CDK4 基因、NF-1 基因、NF-2 基因、VHL 基因、sPD-1 (soluble programmed death-1)等。
[0042]本發(fā)明的單詞“sFOl (soluble programmed death-1)”是指屬于免疫球蛋白(immunoglobulin)分子群的作為T細胞輔助阻礙分子(coinhibitory molecule)廣為認知的55kDa的第I型跨膜蛋白F1D-1 (programmed death-1)的細胞外區(qū)域。通常F1D-1與PD-Ll之間的相互作用下，腫瘤侵襲性淋巴球減少，T細胞受體介導增殖降低，癌細胞出現(xiàn)免疫豁免現(xiàn)象。但據(jù)最近的研究報告，PD-1的游離態(tài)sPDl與ro-1及ro-Li相互作用，抑制免疫豁免現(xiàn)象，可以有效誘導抗癌免疫反應。本發(fā)明的目的來看，所述sro1-1g基因可在本發(fā)明的核糖酶反式剪接活性作用下，與癌特異性基因結合，作為癌細胞的治療基因使用，最好是但不限于具有以序列號4表示的堿基序列。
[0043]本發(fā)明的單詞“抗原性基因(antigenic gene)”是指在目標細胞內(nèi)表達，生產(chǎn)可讓免疫體系認知的細胞表面抗原蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明的目的來看，所述抗原性基因包括但不限于癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、p53 等。[0044]本發(fā)明的單詞“細胞因子基因(cytokine gene)”是指在細胞內(nèi)表達，生成細胞因子的核苷酸序列。本發(fā)明的目的來看，所述細胞因子基因包括但不限于GM-CSF、白介素(interleukin) (IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-10、IL-19、IL-20)、干擾素 α、β、Y (interferon a -2b)、干擾素 α -2 α -1 等融合體。
[0045]本發(fā)明的單詞“抗血管生成基因(ant1-angiogenic gene) ”是指通過表達把抗-血管生成因子釋放到細胞外的核苷酸序列。本發(fā)明的目的來看，抗血管生成基因包括但不限于血管穩(wěn)定因子(Angiostatin)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的抑制因子、內(nèi)皮他丁(Endostatin)等。
[0046]本發(fā)明的單詞“腺病毒”與腺病毒載體有相同的含義，是指屬于腺病毒科(adenoviridae)的病毒。所述腺病毒科包括哺乳動物腺病毒(Mastadenovirus)屬所有動物性腺病毒。特別是人類腺病毒有A-F亞屬(subgenera)及其各個血清型，A-F亞屬包括但不限于人類的腺病毒第I型、第2型、第3型、第4型、第4a型、第5型、第6型、第7型、第8型、第9型、第10型、第11型(AdllA及AdllP)、第12型、第13型、第14型、第15型、第16型、第17型、第18型、第19型、第19a型、第20型、第21型、第22型、第23型、第24型、第25型、第26型、第27型、第28型、第29型、第30型、第31型、第32型、第33型、第34型、第34a型、第35型、第35p型、第36型、第37型、第38型、第39型、第40型、第41型、第42型、第43型、第44型、第45型、第46型、第47型、第48型、第91型。
[0047]作為本發(fā)明的另一實施形態(tài)，本發(fā)明提供一種作為有效成分含所述腺病毒的防治癌癥藥學合成物。
[0048]本發(fā)明提供的所述重組腺病毒包括作用于癌特異性基因TERT的對反式剪接核糖酶-HSVtk復合體進行編碼的多核苷酸及治癌基因，當把TERT投入到可以表達的癌細胞時，在TERT的作用下，HSVtk從反式剪接核糖酶-HSVtk復合體解離，解離的HSVtk不僅會呈現(xiàn)細胞毒性，還可以在癌治療基因的作用下，誘導對免疫細胞的攻擊，執(zhí)行癌治療劑的作用。與此相反，TERT投入到不表達的正常細胞時，HSVtk不會從反式剪接核糖酶-HSVtk解離，不表現(xiàn)細胞毒性。因此本發(fā)明的重組腺病毒對癌細胞表現(xiàn)優(yōu)秀的選擇性，可以用于更加安全的癌癥治療。
[0049]本發(fā)明的單詞“癌”是指細胞的正常分裂、分化及凋亡的調(diào)節(jié)功能發(fā)生問題，非正常過多增殖，侵襲周圍的組織及臟器，形成塊，破壞或變形原有結構的細胞或組織，包括但不限于胰腺癌、乳房癌、前例腺癌、腦腫瘤、頭頸部癌腫、黑瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、結腸癌、骨癌、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門癌、結腸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌腫、子宮頸部癌腫、陰道癌、陰門癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、腎癌、輸尿管癌、腎細胞癌、腎骨盆癌及中樞神經(jīng)系腫瘤。
[0050]本發(fā)明的單詞“預防”是指通過投入辦發(fā)明的重組腺病毒或合成物，抑制或延遲癌癥發(fā)病的一切行為。
[0051]本發(fā)明的單詞“治療”是指通過投入重組腺病毒或合成物，讓癌癥好轉或使之向有利方向轉變的一切行為。
[0052]另外，本發(fā)明的治療或預防癌癥的藥學合成物可以追加包括可在藥學層面使用的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0053]本發(fā)明的藥學合成`物包括的可在藥學層面使用的載體、賦形劑及稀釋劑有乳糖(lactose)、葡萄糖(dextrose)、鹿糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、木糖醇(xylitol)、赤蘚糖醇(Erythritol)、麥芽糖醇(Maltitol)、淀粉、阿拉伯樹膠(acacia gum)、藻酸鹽(Alginat)、明膠(gelatin)、憐酸鈣(Calcium Phosphate)、娃酸鈣(calcium silicate)、碳酸?丐(Calcium Carbonate)、纖維素(cellulose)、甲基纖維素(methyl cellulose)、聚乙烯吡咯燒酮(polyvinyl pyrrolidone)、水、輕苯甲酯(methyl hydroxybenzoate)、輕苯丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石(talc)、硬脂酸續(xù)(magnesium stearate)、礦物油。
[0054]本發(fā)明的藥學合成物可以按通常的方法以散劑、顆粒劑、片齊?、膠囊齊?、懸濁液、乳齊?、糖漿、氣凝膠形式，制造成口服劑、外敷劑、坐藥、及滅菌注射溶液使用。制劑化時，通常使用填充劑、增量劑、結合劑、濕潤劑、崩解劑、界面活性劑等稀釋劑或賦形劑制造?？诜霉虘B(tài)制劑包括片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等，這些固態(tài)制劑可以向所述從姜黃或郁金萃取物，從其分離的芳樟醇(Iinalool)化合物或其可在藥學層面使用的鹽，混合至少一種以上賦形劑，比如、淀粉、碳酸1丐(Calcium Carbonate)、鹿糖(sucrose)、乳糖(lactose)、明膠制造。除了單純的賦形劑之外，還使用硬脂酸鎂(magnesium stearate)、滑石等潤滑劑。口服用液態(tài)制劑包括懸濁液、內(nèi)用液劑、乳劑、糖漿劑等，除了可以包括通常使用的單純
稀釋劑-/K、液狀石臘(liquid paraffin)外,還可使用各種賦形劑，比如、濕潤劑、甘甜
劑、芳香基、保存劑等。非口服制劑包括滅菌水溶液、非水性溶劑、懸著劑、乳劑、凍結干燥制劑、做藥。非水性溶劑、懸池液可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙基乙二醇(Polyethyl glycol)、橄欖油(olive oil)等植物油，油酸乙酯(ethyl oleate)等可注射的酯(ester)等。作為坐藥(suppository)的基劑可以使用威特普索(音)(Witepsol)、聚乙二醇(Macrogol)Ji^jiIi (tween) 61、可可脂(cocoa butter)、亮葉肉實(Iaurinum)、甘油膠凍(glycerogelatin)等。
[0055]作為本發(fā)明的另一實施形式，本發(fā)明提供一種癌癥治療方法，其包括把含所述重組腺病毒或藥學合成物，以藥學層面有效的量，投入到需要治療的個體的步驟。
[0056]本發(fā)明的單詞“藥學層面有效的量”是指可在醫(yī)學治療層面適用的合理受惠/危險比例，可充分治療疾病的量，有效用量水平可以按患者的性別、年齡、疾病的種類、癥狀輕重、藥物的活性、對藥物的敏感程度、投入時間、投入路徑及排出比例、治療期間、同時使用的其他藥物，結合其他醫(yī)學領域公知的因素決定。本發(fā)明的藥學合成物可單獨使用或者與其他治療劑并用投入，即可與現(xiàn)有的治療劑前后分別投入、也可同時投入。另外，本發(fā)明的藥學合成物可通過單一的方式或多種方式投入。重要的是考慮上面的所有因素，避免副作用，以最少的量獲得最大效果，可以由本行業(yè)人員容易決定。具體地，本發(fā)明的合成物口服或靜脈注射為宜。
[0057]本發(fā)明的單詞“投入”是指，通過某種適當方法，向動物體內(nèi)輸入特定物質(zhì)，本發(fā)明的治療合成物的投入路徑，可以采用能夠到達目的組織的任何普通路徑，做經(jīng)口投入或非經(jīng)口投入。另外，本發(fā)明的治療合成物，可通過能讓其有效成分到達目標細胞的任意裝置投入。
[0058]本發(fā)明 的治療合成物的最佳投入量按患者的狀態(tài)及體重、疾病程度、藥物形式、投入路徑及期間有所不同，可由本行業(yè)人員適當選擇。為了獲得最佳效果，本發(fā)明的藥學合成物每天以I至10mg/kg投入為好，最好是以I至5mg/kg投入為宜。投入次數(shù)方面，即可以每天投入一次、也可以每天分數(shù)次投入。
[0059]本發(fā)明的治療合成物即可以單獨使用，也可以與外科手術療法等輔助治療方法并用?？梢耘c本發(fā)明的合成物一起使用的化學治療劑(chemotherapeutic agent)包括但不限于鉬化合物(cisplatin)、卡鉬(carboplatin)、甲基節(jié)肼(procarbazine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、環(huán)憐酸胺(cyclophosphamide)、異環(huán)憐酸胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、碧蘇爾蕃(音)(bisulfan)、亞硝基服(nitrosourea)、更生霉素(dactinomycin)、道諾霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博來霉素(bleomycin)、普利考麻星(音)(plicomycin)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、絲裂霉素(tamoxifen)、紫杉酌.(taxol)、反式鉬(trans platinum)、5_ 氟二氧嘧唳(5_fIuorouracil)、長春新堿(vincristin)、長春花堿(vinblastin)、甲氨蝶呤(methotrexate)。另外,可與本發(fā)明的合成物一起使用的放射療法包括但不限于X射線療法及Y射線療法。
[0060]本發(fā)明的一實施例中，為了讓辨認并切斷人類TERT (hTERT)的核糖酶與HSVtkmRNA連接，hTERT mRNA的3’末端發(fā)生切斷，本發(fā)明的各發(fā)明人設計反式剪接核糖酶(圖1)，并為了通過老鼠確認所述反式剪接核糖酶效果，設計了使用以老鼠的TERT mRNA(mTERT-TR)為目標的反式剪接核糖酶的類似體系，把此插入到缺乏E1/E3的腺病毒基因組，制作了含mTERT-TR-調(diào)節(jié)性HSVtk(mTERT-TR-HSVtk)的腺病毒(Ad5mTR)(圖2)，用詞感染來自BALB/c老鼠的大腸癌細胞株CT26細胞株的結果，以2.5M0I感染時，可以壞死大部分細胞(圖2b)，在體外環(huán)境下，與細胞毒性類似，向BALB/c老鼠皮下CT26腫瘤注射Ad5mTR時，腫瘤的生長明顯得到抑制(圖2c)。另外，本發(fā)明的發(fā)明人測試同系列B6老鼠皮下注射E.G7腫瘤，確認Ad5mTR細胞凋亡能力的結果，感染病毒后腫瘤抗原被釋放(圖3a)，來自以Ad5mTR處理的老鼠的D Cs以充分水平提供OVA抗原，刺激OVA特異性T細胞。(圖3b)
[0061]另外，本發(fā)明的各發(fā)明人制作包括腺病毒基因組EI領域中被mTERT-TR調(diào)節(jié)的HSVtk及位于E3領域的sPDl-1g的雙重-模塊腺病毒(Ad5mTR.sPDl)(圖4a)，對其活性做了測試。其結果，反應于腫瘤細胞的攻擊，在含sPDl-1g的上層液作用下，由抗原-特異性T細胞分泌IFN Y得到提高(圖4d)。同時，通過流式細胞術，測試出腫瘤細胞表面的I3D-Ll發(fā)生表達(圖5)。另外，以Ad5mTR.sPDl感染的CT26細胞顯示與以Ad5mTR感染的情況類似水平的生物體外細胞毒性(圖6a)，Ad5mTR.sPDl與Ad5mTR比較明顯促進了腫瘤衰退，實際上發(fā)生幾乎完全的腫瘤衰退(圖6b)。正如本發(fā)明預計，HSVtk在DCs作用下促進了抗原-特異性⑶8T細胞反應(圖3b)，sHH-1g在細胞外促進了抗-腫瘤⑶8T細胞反應性(圖4d)。
[0062]這種由雙重-模塊Ad5mTR.sPDl提高的腫瘤生長抑制效果在⑶8T細胞枯竭的老鼠中，幾乎完全消失(圖7a)，對抗-腫瘤活性產(chǎn)生影響的⑶8的枯竭，相對于Ad5mTR，在Ad5mTR.sPDl中效果更加明顯(1.9倍對4.76倍)(圖7b)，在CT26模型中，相對于Ad5mTR,對Ad5mTR.sPDl呈現(xiàn)更強的效果(1.61倍對6.58倍)(圖8b)，向攜帶E.G7的Ragl-/-老鼠靜脈注射的OT-1 T細胞作用下，產(chǎn)生抗原-特異性T細胞反應時，投入腺病毒時的所述抗-腫瘤效果恢復，所述效果相對于投入Ad5mTR，在投入Ad5mTR.sPDl時大幅增加(圖8d)。
[0063]對這種腺病毒 效果，在生物體內(nèi)做了確認。其結果，投入Ad5mTR.sPDl的老鼠第一次腫瘤以最小規(guī)模增殖，沒有生長2次腫瘤(圖9a及9c)，在含E.G7腫瘤模型的B6老鼠身上也看到了同樣的結果(圖％及9c)。[0064]本發(fā)明的重組腺病毒的效果通過老鼠得到了確認，但是誘發(fā)所述腺病毒效果的TERT不僅在老鼠體內(nèi)表達，而且還會在人類的腫瘤表達。因此本發(fā)明提供的重組腺病毒可以用于人類的癌癥治療。
[0065]發(fā)明的實施形式
[0066]下面，為了更好地理解本發(fā)明，提示最佳實施例。顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。
_7] 實施例1:材料及方法
[0068]實施例1-1:細朐及老鼠
[0069]所有細胞通過含10%FBS (fetal bovine serum)與 l%penicillin/streptomycin的RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)。6周齡雌性BALB/c老鼠及C57/BL6老鼠從SLC(Japan)采購。OT-1老鼠(B6background)及 Ragl-/-老鼠(B6background)從 Jackson laboratory 米購。所有動物實驗遵守了韓國國立癌中心(National Cancer Center, Korea)的實驗動物使用與管理相關規(guī)定(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)。
[0070]實施例1-2:腺病毒的制作
[0071]為了在CMV啟動子的調(diào)解下，生成含老鼠的TERT-TR-HSVtk基因的Ad5mTR，使用了 AdenoZAPTM 及 AdenoQuickTM 體系。Pavq-CMViTERT ASlOORib (+67)TK 中，處理 SpeI/SacII，獲得了包括CMV.mTR.HSVtk的DNA片段，把所述片段插入pZAPl.1的Spel/EcoRV切斷部位，制作了 pZAPl.1.CMV.mTR.HSVtk0 把 pZAPl.1.CMV.mTR.HSVtk 以 Pacl/Dralll 切斷，連接在RightZAPl.2后，引入到HEK293細胞。為了制作sPDl_Ig，通過使用下述處理劑(primer)的PCR方法增幅了 F1D-1的細胞外區(qū)域。
[0072]正方向處理劑:5’-CCGCTC GAG CTC ACC ATG TGG GTC CGG CAG GTA CCC TGG-3’(序列號5)
[0073]反方向處理劑:5’AGATCT TCC TCC TCC TCC TTG AAA CCG GCC TTC TGG TTTGGG-3’ (序列號6)
[0074]把所述增幅產(chǎn)物插入pFUSE-migG2A.Fcl 載體(Invitrogen, San Diego, CA)的 XhoI/BgHI 左位，制作 7 pFUSE-migG2A.Fcl.EFl.sPD_l。把來自 pFUSE_migG2A.Fcl.EFl.sPDl-1g 的 EFl.sPDl-1g 插入到載體(0D260)的 EcoRI/Swal 左位，只做了pE3.1.EFl.sPDl-1g。把 pZAPl.1.CMV.mTR.HSVtk 的 CMV.mTR.HSVtk 片段插入 pEl.2 載體(0D260)的 BamHI/Spel 左位，制作了 pEl.2.CMV.mTR.HSVtk0 為了制作 Ad5mTR.sPDl,把 pEl.2.CMV.mTR.HSVtk 和 pE3.1.EFl.sPDl-1g 通過限制酶 Dralll/PflMI 進行切斷，連接到 AdenoQuickl3.1 后，引入到 HEK293 細胞。為了制作 Ad5EFl.sPDl,以與 Ad5mTR.sPDl相同的方式，以限制酶Dralll/PflMI切斷ρΕ3.1.EFl.sPDl-1g和pE1.2載體后，連接在AdenoQuickl3.1，引入到 HEK293 細胞。
[0075]實施例1-3:細胞外環(huán)境中的GCV吸收劑細胞毒性分析
[0076]HSVtk酶活性，通過檢測細胞中磷酸化的GCV累積量，做了估算。細胞增殖分析(cell proliferation assay,Dojindo Laboratories,Rockville,MD),通過標準方法，以平價腺病毒細胞毒性的方式執(zhí)行`。概括的話，把細胞(3X 103)接種到96-孔板，在37°C條件下培養(yǎng)一天晚上。向培養(yǎng)的細胞感染多種MOI (multiplicity of infection)的腺病毒。I日后，添加GCV，使最終濃度達到200μΜ，在3日間檢測了細胞增殖。所有測試反復進行了3次。
[0077]實施例1-4杭體及施藥
[0078]為了確認Ad5CMV.mTR.sPDl 的 sPDl-1g 蛋白質(zhì)表達情況，向 HEK293 細胞(4X 105)感染了 2M0I的腺病毒。感染24小時后的時間點上，對培養(yǎng)上層液和細胞殘留物(80 μ g)，利用抗-Pdcd-1 抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA),以免疫印跡方式進行了分析。為了讓⑶8T細胞凋亡，在感染腺病毒2日之前腹腔注射500 μ g2.43 α抗-⑶8抗體,之后的15天內(nèi)，每5天進行腹腔注射。
[0079]實施例1-5 =IFN Y生產(chǎn)暈分析所需CD8T細胞/DC共同培養(yǎng)分析
[0080]把來自吸收性淋巴結的DCs (DLN-DCs),使用17.5%Nycodenze gradient增幅，通過使用抗-⑶IIc微珠(Micenyi Biotec, Auburn, CA)的MACS分析柱進行提純。使用抗-⑶8微珠，分離了來自OT-1老鼠的純粹⑶8T細胞。把DLN-DCs(5X IO4)與⑶8T細胞(I X IO5)，在96-孔板培養(yǎng)72小時。72小時后，收取上層液，以ELISA (eBioscience, San Diego7CA)檢測了 IFNy含量。
[0081]實施例1-6:細胞外環(huán)境0T-1T細胞活化分析
[0082]通過6-孔板培養(yǎng)了穩(wěn)定表達卵清蛋白(ovalbumin) (OVA)的老鼠大腸癌細胞
MC38, B6background)-MC38/0VA細胞。從24小時感染10M0I腺病毒的HEK293培養(yǎng)上
層液，收取 sPDl-1g 后 ，加 0T-1CD8T 淋巴球(I X 106)的 MC38/0VA 細胞(I X 104)，培養(yǎng)了 72小時。把來自0T-1老鼠純粹CD8+T淋巴球，通過上述方法，使用MACS分析柱進行分離。⑶8T淋巴球生產(chǎn)的IFNy生成量，通過老鼠IFN Y CBA assay工具(BD bioscience, San Jose,CA)，做了檢測。
[0083]實施例1-7:牛物體內(nèi)動物研究及牛物體外分析
[0084]向6周齡雌性BALB/c老鼠皮下接種IX IO6個CT26細胞。檢測到腫瘤時(經(jīng)過7天)，向腫瘤內(nèi)注射5X IO8PFU腺病毒，每日注射兩側GCV(75mg/kg)、共14日。間隔7天，投入2次腺病毒。腫瘤體積通過如下公式計算。
[0085]長度X 寬度 2 X 0.5236
[0086]在⑶8T細胞凋亡試驗中執(zhí)行皮下腫瘤形成與病毒注射所需類似過程。把E.G7細胞(C57/BL6backgound ; I X IO6)向Ragl-/-老鼠或C57/BL6老鼠注射，以上述方法處理腺病毒和GCV。為了執(zhí)行生物體外分析，向Ragl-/-老鼠老鼠的E.G7腫瘤，以從0T-1老鼠分離的⑶8T細胞的靜脈投入方法，處理了 Ad5mTR.sPDl。感染剛經(jīng)過8日時，從血液收取PBMCs(peripheral blood mononuclear cells),執(zhí)行流式細胞術。
[0087]實施例2:結果
[0088]實施例2-1:含老鼠TERT-TR-HSVtk的腺病毒的制作
[0089]本發(fā)明的各發(fā)明人使用腫瘤標記TERT，利用腫瘤特異性腺病毒，開發(fā)了新HSVtk表達策略。在所述策略中，把認知人類TERT (hTERT)并切斷的核糖酶，利用重組腺病毒傳達到腫瘤細胞。另外，所述核糖酶與HSVtk mRNA連接，在hTERT mRNA的3’末端切斷，這引發(fā)了腫瘤細胞中的HSVtk mRNA的新毒性。這種核糖酶定義為反式剪接核糖酶(圖1)。理論上，通過反式剪接核糖酶調(diào)節(jié)的HSVtk的表達，只局限于包括腫瘤細胞在內(nèi)的以較高水平表達hTERT mRNA的細胞。從而，這種體系不影響以較低水平表達hTERT的周圍正常組織的細胞，可向腫瘤細胞有效傳達HSVtk。實際上，這種策略在異體移植老鼠模型中，對移植的人類大腸癌細胞表現(xiàn)出較高效果。免疫學層面分析時，這種體系的一個問題是利用人類腫瘤細胞的試驗，在異體移植條件下，排斥反應被抑制的老鼠體內(nèi)執(zhí)行。從而，這種體系不適合準確評價HSVtk對抗-腫瘤免疫化的效果。為了解決這種局限性，本發(fā)明的各發(fā)明人設計出使用以老鼠TERT mRNA (mTERT-TR)為目標的反式剪接核糖酶的類似系統(tǒng)，使用同系列老鼠腫瘤模型，評價了 TERT-TR-調(diào)節(jié)的HSVtk的免疫學層面效果。所述TERT辨認序列位于HSVtk編碼序列附近，HSVtk的表達依存于mTERT轉錄體的存在(圖1)。把被CMV啟動子調(diào)節(jié)的這種整體型表達框，插入到缺乏E1/E3的腺病毒基因組內(nèi)，制造了含mTERT-TR-調(diào)節(jié)性HSVtk (mTERT-TR-HSVtk)的腺病毒(Ad5mTR)(圖 2a)。
[0090]另外，作為對比群，制造了除去所述表達框的腺病毒(Ad5M0CK)。為了確認Ad5mTR作用下的HSVtk表達是否對老鼠的腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性，本發(fā)明使用了來自BALB/c老鼠的大腸癌細胞株CT26細胞，所述細胞株可以較高水平表達mTERT mRNA。在GCV存在的條件下，把CT26細胞暴露在多種MOI的Ad5mTR中。2.5M0I條件下，可以充分殺死大部分細胞，而Ad5M0CK在50M0I條件下也未呈現(xiàn)細胞毒性(圖2b)。與體外環(huán)境的細胞毒性類似，在BALB/c老鼠皮下CT26腫瘤中注射Ad5mTR時，腫瘤的生長明顯得到了抑制(圖2c)。
[0091]從而，Ad5mTR對包括人類TERT-TR-HSVtk在內(nèi)，呈現(xiàn)與腺病毒抗-腫瘤效果類似的效果，可知這適合使用于老鼠的抗-腫瘤免疫性研究。
[0092]實施例2-2:提示在HSVtk作用下效能提高的DC-介導性腫瘤抗原
[0093]據(jù)知，通過引入DNA或感染腺病毒，誘發(fā)HSVtk的表達，可以提高細胞毒性⑶8T細胞的抗原反應。存在生物體GCV的條件下，HSVtk的表達即便不在整個腫瘤范圍內(nèi)發(fā)生，也可以在明顯的水平層面誘導細胞凋亡，從凋亡的細胞誘導的抗原，可通過諸如DCs等APCs檢測，而這些細胞移動到 與腫瘤抗原特異性T細胞反應的淋巴結。雖然這種模型已經(jīng)在有關文獻提示，但本發(fā)明的各發(fā)明人決定使用所定義的抗原特異性T細胞進行實驗，驗證這種可能性。為了進行這種實驗，本發(fā)明的各發(fā)明人作為模型腫瘤抗原使用了老鼠的腫瘤細胞株E.G7(穩(wěn)定表達卵清蛋白的EL4細胞的誘導體)，從模型腫瘤-抗原(OVA)-特異性CD8T細胞群使用過的OVA特異性T細胞受體形質(zhì)轉換的老鼠，提取了 T細胞。從OT-1老鼠提取的所有CD8T細胞是OVA特異性細胞毒性T細胞。首先，本發(fā)明通過皮下注射E.G7腫瘤的同系列B6老鼠，測試了 Ad5mTR的誘導腫瘤細胞凋亡的能力。分離腫瘤，投入Ad5mTR后，以組織學層面評價的過程中，觀察了明顯的細胞凋亡。這意味著感染病毒后，釋放出腫瘤抗原(圖3a)。接下來，本發(fā)明從腫瘤-吸收淋巴結提取DCs，利用DC/CD8T細胞共同培養(yǎng)分析方法，評估了是否IFNy的生成是否受到OVA的影響。使用以Ad5mTR處理過的含腫瘤老鼠、通過來自該老鼠的DCs培養(yǎng)出的OT-1 T細胞，與使用以對比群病毒處理的老鼠、通過來自該老鼠的DCs培養(yǎng)出的OT-1 T細胞相比，產(chǎn)生了大量IFNy。這種結果表明，來自以Ad5mTR處理的老鼠的DCs充分提供OVA抗原，刺激OVA特異性T細胞(圖3b)。從而，腫瘤中HSVtk的表達及與之相關的GCV誘導性細胞凋亡是腫瘤抗原的釋放結果，這些抗原在可刺激腫瘤抗原特異性細胞毒性T細胞的DCs的作用下，有效得到捕捉。
[0094]可知，HSVtk的腫瘤特異性表達，不僅可以通過DCs有效刺激抗-腫瘤T細胞活性，還能直接誘導腫瘤細胞的細胞毒性。
[0095]實施例2-3:同時包括mTERT-TR-HSVtk及sPDl_Ig的腺病毒的制作
[0096]已知，Ad5mTR可以刺激抗-腫瘤⑶8T細胞的反應性。本發(fā)明的另一策略是讓腫瘤-誘導的免疫抵抗性失活。這些方案的組合可以額外提高抗-腫瘤T細胞的細胞反應性。PD-Ll是從腫瘤細胞表面表達的公知的免疫抑制劑。本發(fā)明只做了可中和ro-Ll，具有PD-Ll受體受容性形式的SPD1，去除了 ro-Ll的介導性T細胞抑制作用。在生物體內(nèi)，為了提高SPDl的穩(wěn)定性，把SPDl融合在IgG2a的Fe領域，制作了 sPDl-1g。本發(fā)明制造了一種雙重-模塊腺病毒(Ad5mTR.sPDl)，其包括在腺病毒基因組El區(qū)域被mTERT_TR調(diào)節(jié)的HSVtk及位于E3區(qū)域的sPDl-1g (圖4a)。通過所述Ad5mTR.sPDl感染HEK293細胞，在細胞外環(huán)境中表達分泌sPDl-1g，并通過免疫印跡分析法加以確認(圖4b)。把Ad5mTR.sPDl感染細胞中的HSVtk表達水平與通過酶活性檢測的Ad5mTR感染細胞做了比較(圖4c)。另外，本發(fā)明通過實驗檢測了生物體外環(huán)境中分泌的sPDl-1g是否可以中和腫瘤細胞表面的H)-L1，提高抗-腫瘤T細胞的反應性。向感染Ad5mTR.sPDl后的293HEK細胞的培養(yǎng)上層液，添加表達OVA的腫瘤細胞與OVA特異性OT-1 T細胞的共同培養(yǎng)物，根據(jù)IFN Y分泌量，測定了 T細胞的反應性。正如期盼，反應于腫瘤細胞的攻擊，抗原-特異性T細胞的IFNy分泌，在含sPDl-1g的上層液中有所提高(圖4d)。通過流式細胞術測出了腫瘤細胞表面的PD-Ll的表達(圖5)。這些結果表明，所述雙重-模塊腺病毒可以在生物體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境中提高抗-腫瘤T細胞的反應性。
[0097]實施例2-4:Ad5mTR.sPDl對腫瘤牛長的有效抑制
[0098]為了確認sHH-1g是否在生物體內(nèi)提高HSVtk的抗-腫瘤活性，使用了 CT26大腸癌模型(圖2c)。CT26細胞在這些細胞表面以較高水平表達H)-L1，因此選擇了該模型(圖5)。被Ad5mTR.sPDl感染的CT26細胞，與被Ad5mTR感染的情況相比，表現(xiàn)出類似的生物體外細胞毒性，預計sPDl-1g依靠HSVtk的細胞毒性不會成為直接原因(圖6a)。與之相比，Ad5mTR.sPDl相對于Ad5mTR，明顯促進了腫瘤的衰退，實際上讓腫瘤完全衰退(圖6b)。單獨包括SH)1-1g的對比群腺病毒(Ad5EFl a.sPDl)在這些模型中不表現(xiàn)出任何抗-腫瘤效果，這表明，腫瘤組織中，sHH-1g的表達無法充分誘導腫瘤衰退，為了 sPDl-1g的效果提高，需要依靠HSVtk進行抗原反應。
[0099]實施例2-5 =SPD1-1r的腫瘤生長抑制效果受CD8T細胞的介導
[0100]HSVtk依靠DCs促進抗原-特異性CD8T細胞的反應(圖3b)，sPDl-1g在細胞外促進抗-腫瘤CD8T細胞的反應性(圖4d)。這種結果表明，在生物體內(nèi)得到提高的CD8T細胞反應性，受益于Ad5mTR.sPDl的抗-腫瘤效果的提高。為了確認這一可能性，向攜帶CT26腫瘤的老鼠投入抗-⑶8抗體，讓⑶8T細胞凋亡。通過雙重-模塊Ad5mTR.sPDl提高的腫瘤生長抑制效果，在CD8T細胞枯竭的老鼠體內(nèi)，基本全部消失(圖7a)。值得注意的是，Ad5mTR的抗-腫瘤活性同樣降低，這表明CT26老鼠腫瘤模型中，Ad5mTR的效果依存于由⑶8T細胞介導的抗-腫瘤免疫反應。但是影響抗-腫瘤活性的⑶8的枯竭，與Ad5mTR相比，Ad5mTR.sPDl的效果更加明顯(1.9倍對4.76倍)(圖7b)。為了更直接評價腫瘤-特異性⑶8T細胞的作用，使用了 E.G7腫瘤模型和OVA-特異性OT-1 T細胞。投入Ad5mTR.sPDl的同系列B6老鼠的E.G7腫瘤腫瘤皮下注射，與CT26模型類似，顯示出提高的腫瘤衰退結果。與之相比，同樣的試驗進行在同系列淋巴球-缺乏Ragl-/-老鼠時，兩種病毒的抗-腫瘤效果顯著減少(圖8a)。CT26模型中，與⑶8T細胞的枯竭效果一直，減少的程度Ad5mTR.sPDl比Ad5mTR更大(6.58倍對1.61倍)(圖8b)。向含E.G7的Ragl-/-老鼠靜脈注射的OT-1T細胞的作用下，抗原-特異性T細胞反應形成時，投入腺病毒的所述抗-腫瘤效果得到恢復，所述效果與投入Ad5mTR的情況相比，投入Ad5mTR.sPDl時更加明顯(圖8c)。特別是，血液中的OT-1 T細胞數(shù)量，投入Ad5mTR.sPDl時比投入Ad5mTR增加更多(圖8d)。結果表明，Ad5mTR.sPDl直接提高腫瘤特異性⑶8T細胞的功能，促進腫瘤的衰退。
[0101]實施例2-6:Ad5mTR.sPDl處理的杭癌效果 [0102]向第1次腫瘤部位注射病毒，在老鼠的遠位部，投入抑制2次腫瘤可能性更高的Ad5mTR.sPDl的老鼠血液內(nèi)，增加了癌特異性T細胞。向發(fā)生在BALB/c老鼠體內(nèi)的CT26腫瘤，以3天間隔投入3次Ad5mTR.sPDl0從最初投入日計，14日后在同一老鼠的相反側部位，試圖引發(fā)2次CT26腫瘤。這時，投入Ad5mTR.sPDl的老鼠的I次腫瘤以最小限度增殖，而投入Ad5mTR的老鼠出現(xiàn)了很大(>600mm3)的I次腫瘤。吧正常BALB/c老鼠新集團作為2次腫瘤發(fā)生對比群使用。對比群順利生長了 2次腫瘤，但投入Ad5mTR.sPDl的老鼠沒有生長2次腫瘤(圖9a及9c)。同一結果在含E.G7腫瘤模型的B6老鼠身上同樣得到確認(圖9b及圖9c)。可知，雙重模塊腺病毒的注射提高抗癌免疫性，可得到抗癌效果。
【權利要求】
1.一種重組腺病毒，其特征在于:包括作用于癌特異性基因TERT(Telomerase reversetranscriptase)mRNA (序列號 I)的對反式剪接核糖酶-HSVtk (Herpes Simplex VirusThymidine Kinase)復合體進行編碼的多核苷酸及治癌基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于: 所述對復合體進行編碼的多核苷酸包括對Rib67核糖酶進行編碼的序列號2的堿基序列和對HSVtk進行編碼的序列號為3的多核苷酸。
3.—種重組腺病毒，其特征在于: 所述治癌基因選自藥敏化基因、細胞凋亡基因、抑制細胞增殖基因、細胞毒性基因、腫瘤抑制因子基因、抗原性基因、細胞因子基因、抗血管生成基因。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組腺病毒，其特征在于: 所述治癌基因是多核苷酸，該多核苷酸含對sPD-1 (soluble programmed death-1)進行編碼的序列號為4的喊基序列。
5.一種預防或治療癌癥的藥學合成物，其特征在于: 包括權利要求1至4中的某一項所述重組腺病毒。
6.根據(jù)權利要求5所述的藥學合成物，其特征在于: 追加包括可在醫(yī)藥學層面使用的載體、賦形劑、或稀釋劑。
7.一種治療癌癥的方法，其特征在于: 包括把權利要求1至4中的某一項所述重組腺病毒，以藥學層面有效的量投入到需要治療的個體的步驟。
【文檔編號】A61K35/76GK103732739SQ201280040192
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年8月20日 優(yōu)先權日:2011年8月19日
【發(fā)明者】李相辰 申請人:國立癌中心