專利名稱：熱穩(wěn)定的核糖核酸酶h的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽，更具體地涉及具有核糖核酸酶H活性的多肽，它對于遺傳工程是特別有意義的。本發(fā)明還涉及用于通過遺傳工程生產(chǎn)所述多肽的基因。本發(fā)明還涉及通過遺傳工程生產(chǎn)所述多肽的方法。
背景技術(shù)：
存在內(nèi)型和外型核糖核酸酶(RNA降解酶)。它們的底物特異性是不同的，它們參與復(fù)雜的生理活動。已知酶，例如核糖核酸酶T1，核糖核酸酶T2，核糖核酸酶H，核糖核酸酶P，核糖核酸酶I，核糖核酸酶II，核糖核酸酶III，核糖核酸酶IV，核糖核酸酶L具有核糖核酸酶活性。
W.H.Stein和P.Hausen于1969年從小牛胸腺中首次分離出核糖核酸酶H(在下文中也稱作RNA酶H)。目前將RNA酶H分成細胞RNA酶H和病毒RNA酶H。細胞RNA酶H廣泛地存在于真核生物(例如各種動物細胞和酵母)和原核生物(例如大腸桿菌)中，而病毒RNA酶H則存在于RNA腫瘤病毒中。細胞中存在幾種RNA酶H活性。它們需要二價金屬離子，例如Mg2+和Mn2+。
來自大腸桿菌的RNA酶H是由155個氨基酸組成的水解酶，分子量為約17kDa，具有特異性地以內(nèi)切方式只剪切DNA-RNA雜交體中的RNA鏈的底物特異性。得到的寡聚物在5′端具有磷酸基，在3′端具有羥基。
已經(jīng)鑒別出RNA酶H I和RNA酶H II為來自大腸桿菌的RNA酶H。已經(jīng)證實，RNA酶H I在Col E1質(zhì)粒的復(fù)制中起下述生理作用1)它降解結(jié)合到正常復(fù)制起點以外的區(qū)域的RNA，確保正常的復(fù)制起點；2)它合成對正常復(fù)制起點具有特異性的RNA引物；另一方面，仍不清楚RNA酶H II的功能。
RNA酶H具有下述列舉的基于底物特異性的應(yīng)用，人們的注意力集中在將RNA酶H作為非常有用的酶1)在cDNA克隆基礎(chǔ)上除去模板mRNA；2)除去mRNA中的poly(A)區(qū)域；和3)裂解RNA。
隨著遺傳工程的發(fā)展，認為RNA酶H日益變得重要。但是，該酶在大腸桿菌中的表達水平非常低。然后，已經(jīng)試圖使用重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)該酶。現(xiàn)在，BRL、Amersham Pharmacia Biotech，Takara Bio等公司已經(jīng)供應(yīng)使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的RNA酶H。
這些可以商業(yè)獲得的重組RNA酶H是使用大腸桿菌作為宿主來生產(chǎn)的(Kanaya等.，The Journal of Biological Chemistry，26411546-11549(1989))。已經(jīng)報導(dǎo)了使用大腸桿菌從嗜熱生物中生產(chǎn)RNA酶H的方法，它比來自大腸桿菌的RNA酶H更穩(wěn)定得多(Kanaya等.，Dai 2 Kai NipponTanpakukougakukai Nenkai Program/Abstract(1990)69頁；日本專利No.2533671)。但是，使用大腸桿菌從嗜熱生物中生產(chǎn)的RNA酶H的酶活性比來自大腸桿菌的RNA酶H的活性低。
如上所述，只是獲得了熱穩(wěn)定的RNA酶H，它的產(chǎn)率和酶活性都低于來自大腸桿菌的RNA酶H。因此，為了拓展RNA酶H的用途，需要開發(fā)熱穩(wěn)定的RNA酶H，且其產(chǎn)率和酶活性等同于或高于來自大腸桿菌的RNA酶H。
這樣，為了解決上述問題，已經(jīng)克隆了具有不同熱穩(wěn)定性的RNA酶H。其實例包括WO 02/22831中所述的來自熱堅芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)、激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)、海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、Thermococcus litoralis、速生熱球菌(Thermococcus celer)和Pyrococcus horikoshii的RNA酶H。
其它的實例包括來自嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)(NucleicAcids Research，卷19，No.16，4443-4449頁(1991)、美國專利號5268289)、激烈熱球菌(美國專利號5610066)，熱球菌屬物種(Pyrococcus sp.)KOD1(JP-A 11-32772)和閃爍古生球菌(Journal of Molecular Biology，卷307，541-556頁(2001))的RNA酶H。
但是，已經(jīng)存在許多有待改善的關(guān)于這些RNA酶H的問題，例如低熱穩(wěn)定性、降低的對具有短RNA鏈的DNA-RNA雜交體的活性和低特異性的活性。這樣，為了滿足被認為隨著遺傳工程的發(fā)展而變得越來越重要的RNA酶H的重要性，已經(jīng)需要開發(fā)其它的具有獨特的底物特異性或作用模式的熱穩(wěn)定的RNA酶H。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種具有RNA酶H活性的多肽，它對遺傳工程是告訴有價值的，一種編碼所述多肽的基因和通過遺傳工程生產(chǎn)所述多肽的方法。
考慮到上述的環(huán)境，為了得到熱穩(wěn)定的RNA酶H，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)進行了深入的研究和篩選。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有高RNA酶H活性的熱穩(wěn)定的RNA酶H多肽。而且，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這樣得到的熱穩(wěn)定的RNA酶H在利用遺傳工程技術(shù)的生產(chǎn)中的產(chǎn)率較高。這樣，已經(jīng)完成了本發(fā)明。
本發(fā)明如下所述。本發(fā)明的第一方面涉及具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的多肽，它選自由下述多肽組成的組(a)具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽；(b)具有這樣的氨基酸序列的多肽，其中在SEQ ID NO1的氨基酸序列中有至少一個氨基酸殘基被刪除、添加、插入或取代；和(c)具有這樣的氨基酸序列的多肽，它與SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少54％的同源性。
本發(fā)明的第二方面涉及編碼具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的多肽的核酸，它選自由下述核酸組成的組(a)編碼具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽的核酸；(b)編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽的核酸，其中在SEQ ID NO1的氨基酸序列中有至少一個氨基酸殘基被刪除、添加、插入或取代；(c)編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽的核酸，所述氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少54％的同源性；(d)具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的核酸；(e)由核苷酸序列組成的核酸，其中在SEQ ID NO2的核苷酸序列中有至少一個核苷酸被刪除、添加、插入或取代，這樣該核苷酸的刪除、添加、插入或取代導(dǎo)致翻譯成氨基酸序列；(f)能夠在嚴緊條件下與(a)至(d)中的任意一種核酸或其互補鏈雜交的核酸；和(g)具有與SEQ ID NO2的核苷酸序列有至少61％的同源性的核苷酸序列的核酸。
本發(fā)明的第三方面涉及包含第二方面的核酸的重組DNA。
本發(fā)明的第四方面涉及用第三方面的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的第五方面涉及生產(chǎn)具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)第四方面的轉(zhuǎn)化體；和從培養(yǎng)物中收集具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的多肽。
本發(fā)明的第六方面涉及具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的、可以通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒pApr108的轉(zhuǎn)化體來獲得的多肽。根據(jù)布達佩斯條約，具有該質(zhì)粒的大腸桿菌菌株于2002年8月20日(原始保藏日)以保藏號FERM BP-8433保藏在國際專利生物保藏機構(gòu)國立高級工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究所(International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本。


圖1舉例說明了本發(fā)明的RNA酶H的熱穩(wěn)定性。
實施本發(fā)明的最佳方式在下文中，將詳細描述本發(fā)明。
如這里所使用的，RNA酶H是指具有特異性地以內(nèi)切方式只剪切DNA-RNA雜交體中的RNA鏈的底物特異性的水解酶，其中剪切得到的寡聚物在5′端具有磷酸基，在3′端具有羥基。
雖然無意限制本發(fā)明，如這里使用的關(guān)于多肽的“具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性”是指多肽在70℃或以上的溫度孵育15分鐘后具有RNA酶H活性。
例如，可以如下測定熱穩(wěn)定的RNA酶H活性。
將1mg poly(rA)或poly(dT)(均來自Amersham Pharmacia Biotech)溶解到含有1mM EDTA的1ml 40mM tris-HCl(pH7.7)中，制備poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。
然后將poly(rA)溶液(至20μg/ml的終濃度)和poly(dT)溶液(至30μg/ml的終濃度)加入到含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM tris-HCl(pH7.7)中?；旌衔镌?7℃反應(yīng)10分鐘，然后冷卻到4℃，制備poly(rA)-poly(dT)溶液。
將1μl酶溶液加入到100μl poly(rA)-poly(dT)溶液中。將混合物在40℃反應(yīng)10分鐘。向其中加入10μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。然后在260nm測定吸光度。作為對照，向反應(yīng)混合物中加入10μl 0.5M EDTA，得到的混合物在40℃反應(yīng)10分鐘，然后測定吸光度。通過從沒有EDTA的反應(yīng)的吸光度減去對照吸光度確定一個值(吸光度差異)。這樣，通過酶反應(yīng)從poly(rA)-poly(dT)雜交體釋放出來的核苷酸的濃度就在吸光度差異的基礎(chǔ)上予以確定。這樣，可以確定根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定的RNA酶H活性。
作為選擇，可以如下確定根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定的RNA酶H活性。將100μl已經(jīng)在40℃孵育的反應(yīng)混合物[20mM HEPES-氫氧化鉀(pH8.5)，0.01％牛血清白蛋白(Takara Bio)，1％二甲基亞砜，4mM醋酸鎂，20μg/ml poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)，30μg/ml poly(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)]加入到1μl待測定活性的酶溶液中?；旌衔镌?0℃反應(yīng)10分鐘。然后通過加入10μl 0.5M EDTA(pH8.0)終止反應(yīng)。然后在260nm測定吸光度。
將RNA酶H的1個單位定義為增加對應(yīng)于在10分鐘內(nèi)釋放出1nmol核糖核苷酸的A260的酶量，它可以根據(jù)下面的方程計算單位＝[吸光度差異×反應(yīng)體積(ml)]/0.0152本發(fā)明的多肽通過具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽來舉例說明。本發(fā)明還包括具有這樣的氨基酸序列的多肽，其中在SEQ ID NO1的氨基酸序列中有至少一個氨基酸殘基被刪除、添加、插入或取代，只要它表現(xiàn)出熱穩(wěn)定的RNA酶H活性。
在天然存在的多肽的中會產(chǎn)生氨基酸序列的突變，例如氨基酸的刪除、插入、添加或取代。這種突變可以由于多態(tài)性或編碼多肽的DNA的突變，或由于多肽的體內(nèi)修飾或在合成后的純化過程中產(chǎn)生。但是，已知這種突變的多肽可表現(xiàn)出基本上與沒有突變的多肽等同的生理或生物活性，如果這樣的突變是在對于維持多肽的活性或結(jié)構(gòu)并不重要的區(qū)域。
這可以應(yīng)用到這樣多肽，其中該突變被人工地導(dǎo)入了多肽的氨基酸序列。在該情況下，會產(chǎn)生更多的不同突變。例如，已知其中的人白細胞介素-2(IL-2)的氨基酸序列中的半胱氨酸殘基替換為絲氨酸的多肽保持白細胞介素-2活性(Science，2241431(1984))。
而且，已知某些多肽具有對它們的活性不是必不可少的肽區(qū)域。這樣的肽區(qū)域可以通過要分泌到細胞外的多肽中的信號肽或在蛋白酶的前體中發(fā)現(xiàn)的前序列或前原序列來例證。大多數(shù)這樣的區(qū)域在翻譯或轉(zhuǎn)化為活性多肽后被去除。這樣的多肽的一級結(jié)構(gòu)與沒有去除該區(qū)域的多肽不同，但是最終表現(xiàn)出相同的功能。
根據(jù)本發(fā)明分離的具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的基因編碼具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽。該多肽具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性。本發(fā)明的多肽包括這樣的多肽，其中的對于其活性不是必不可少的肽區(qū)域已經(jīng)從其中刪除。
當(dāng)通過遺傳工程生產(chǎn)多肽時，可以將與目標多肽的活性無關(guān)的肽鏈添加到多肽的氨基端或羧基端。例如，為了提高目標多肽的表達水平，可以制備融合多肽，其中將在要使用的宿主中高水平表達的多肽的部分氨基端區(qū)域添加到目標多肽的氨基端。在另外一種情況下，為了有利于表達的多肽的純化，可以將對特異性的底物具有親和力的肽添加目標多肽的氨基端或羧基端。如果添加的肽不會對目標多肽的活性產(chǎn)生不利的影響，則可以保留添加。如果必要，可以將它設(shè)計成能夠通過適當(dāng)?shù)奶幚韺⑵鋸哪繕硕嚯娜コ?，例如通過蛋白酶的限制酶切。
這樣，本發(fā)明包括具有這樣的氨基酸序列的多肽，其中在這里公開的SEQ ID NO1的氨基酸序列中有至少一個氨基酸殘基被刪除、添加、插入或取代，如果它具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性。
而且，本發(fā)明包括具有這樣的氨基酸序列的多肽，其與在這里公開的SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少54％、優(yōu)選地60％、更優(yōu)選地70％、最優(yōu)選地85％的同源性，如果它具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性。
同源性可以使用例如計算機程序DNASIS-Mac(Takara Bio)、計算機算法FASTA(3.0版；Pearson，W.R.等.，Pro.Natl.Acad.Sci.，852444-2448，1988)或計算機算法BLAST(2.0版，Altschul等.，Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)來確定。
例如，本發(fā)明包括具有這樣的氨基酸序列的多肽，其與來自深處古生球菌(Archaeoglobus profundus)的核糖核酸酶H的氨基酸序列(SEQ IDNO1)有至少54％的同源性，如果它具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性。
本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)可以例如通過(1)從生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的微生物的培養(yǎng)物中純化，或(2)從含有編碼本發(fā)明的多肽的核酸的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中純化。
(1)從生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的微生物的培養(yǎng)物中純化生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的微生物通過深處古生球菌(DSM5631)例證，它可以從Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH購買。該微生物在適合于微生物生長的條件下培養(yǎng)。優(yōu)選地，使用能提高目標多肽表達水平的培養(yǎng)條件。根據(jù)用于純化蛋白的常規(guī)方法，可以純化在細胞或培養(yǎng)基中生成的目標多肽。
可以用培養(yǎng)熱穩(wěn)定的細菌的常規(guī)方法來培養(yǎng)上述菌株。向培養(yǎng)基中添加能被該菌株利用的營養(yǎng)物質(zhì)。例如，淀粉可以用作碳源，而胰蛋白胨、蛋白胨和酵母提取物可以用作氮源?？梢韵蚺囵B(yǎng)基中添加作為微量元素的金屬鹽，例如鎂鹽、鈉鹽或鐵鹽。另外，可以有利地使用人工海水來制備培養(yǎng)基，例如對于熱穩(wěn)定的海生細菌。
培養(yǎng)可以是靜止培養(yǎng)(standing culture)或攪拌培養(yǎng)。例如，可以使用在Applied and Environmental Microbiology，552086-2088(1992)中記載的滲析培養(yǎng)方法。優(yōu)選地，根據(jù)要使用的菌株或培養(yǎng)基的組成來確定培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間，以便使多肽的產(chǎn)率最大化。
為了得到多肽，首先制備無細胞提取物。無細胞提取物的制備可以是例如通過離心、過濾等從培養(yǎng)物中收集細胞，然后破碎細胞進行。用于高效提取目標酶的細胞破碎方法可以選自超聲處理、珠破碎、水解酶處理等。如果多肽是分泌到培養(yǎng)物上清液中，培養(yǎng)物上清液中的多肽是通過硫酸銨沉淀、超濾等濃縮。濃縮的多肽用作無細胞提取物?？梢杂眉兓鞍椎某Ｒ?guī)方法來從這樣得到的無細胞提取物中分離多肽。例如，可以組合使用硫酸銨沉淀、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析等。
(2)從用含有編碼本發(fā)明的多肽的核酸的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中純化本發(fā)明的多肽可以從用含有編碼本發(fā)明的多肽的核酸(例如，具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的核酸)的重組DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體中獲得。具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽是使用具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的核酸生成。
本發(fā)明的多肽可以從通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)有本發(fā)明的質(zhì)粒pApr108的轉(zhuǎn)化體得到的培養(yǎng)物中純化。
關(guān)于待轉(zhuǎn)化的宿主沒有特別的限制。其實例包括常規(guī)用于重組DNA領(lǐng)域的那些，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酵母、絲狀真菌、植物、動物、培養(yǎng)的植物細胞和培養(yǎng)的動物細胞。
例如，本發(fā)明的多肽可以這樣得到通過在常規(guī)培養(yǎng)條件下，例如于37℃在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，5g/l NaCl，pH7.2)中培養(yǎng)含有質(zhì)粒(其中本發(fā)明的核酸連接在lac啟動子或T7噬菌體啟動子的下游)的大腸桿菌直至對數(shù)生長期，以1mM的終濃度向其中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，再于37℃培養(yǎng)以在培養(yǎng)的細胞中表達多肽。
培養(yǎng)后通過離心收集細胞，超聲破碎，通過離心收集的上清液用作無細胞提取物。該無細胞提取物表現(xiàn)出熱穩(wěn)定的RNA酶H活性?？梢酝ㄟ^使用已知的方法，例如離子交換層析、凝膠過濾、疏水層析和硫酸銨沉淀從無細胞提取物中純化本發(fā)明的多肽。自然地，在上述的純化過程中得到的部分純化的產(chǎn)物也表現(xiàn)出RNA酶H活性。由于在含有連接到本發(fā)明的核酸上的質(zhì)粒的大腸桿菌中表達的本發(fā)明的多肽是熱穩(wěn)定的，它可以如下純化。例如，在40℃或更高的溫度加熱培養(yǎng)的細胞和/或無細胞提取物大約10分鐘，除去來自宿主的熱變性的不溶蛋白?？梢詾闊崽幚砗线m地選擇最佳溫度或時間。
如上所述，當(dāng)使用含有編碼多肽的核酸的轉(zhuǎn)化體在常溫(例如37℃)表達本發(fā)明的多肽時，得到的表達產(chǎn)物保持活性、熱穩(wěn)定性等。就是說，本發(fā)明的多肽能呈現(xiàn)出其固有的高級結(jié)構(gòu)，即使它是在與原始生成細胞的生長溫度非常不同的溫度下被表達。
本發(fā)明的核酸是編碼本發(fā)明的多肽的核酸。更具體地，它是(1)編碼具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽的核酸，或編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽的核酸，其中在序列中有至少一個氨基酸殘基被刪除、添加、插入或取代，且具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性；(2)具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的核酸；(3)具有這樣的核苷酸序列的核酸，它能夠在上述嚴緊條件下與(1)或(2)的核酸雜交，或與上面(1)或(2)的核苷酸序列有至少61％、優(yōu)選地70％、更優(yōu)選地80％、最優(yōu)選地90％的同源性，且編碼具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性的多肽，或類似物。
核苷酸序列的同源性可以使用計算機程序DNASIS-Mac或計算機算法FASTA(3.0版)或BLAST(2.0版)確定。
如這里使用的，核酸是指單鏈的或雙鏈的DNA或RNA。如果上面(2)的核酸是RNA，它由這樣的核苷酸序列代表，例如其中將SEQ ID NO2的核苷酸序列中的T替換為U。
例如，本發(fā)明的核酸可以如下得到。
可以如下分離具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的上面(2)的核酸。根據(jù)常規(guī)方法，從為本發(fā)明的多肽進行上述培養(yǎng)的深處古生球菌(DSM5631)中制備基因組DNA。該基因組DNA用于構(gòu)建DNA文庫。核酸可以從DNA文庫中分離。也可以通過使用基因組DNA作模板的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的核酸來得到核酸。
而且，在本發(fā)明提供的編碼本發(fā)明的多肽的核酸的核苷酸序列(例如SEQ ID NO2的核苷酸序列)的基礎(chǔ)上，可以得到編碼與本發(fā)明的多肽相似的具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性的多肽的核酸。更具體地，使用編碼本發(fā)明的多肽的核酸或核苷酸序列的一部分作為雜交探針，可以從從細胞中提取出的DNA、使用DNA作模板得到的PCR產(chǎn)物等中篩選出編碼具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性的多肽的DNA。作為選擇，使用基因擴增方法，例如使用在上述核苷酸序列的基礎(chǔ)上設(shè)計的引物的PCR，可以擴增編碼具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性的多肽的DNA。另外，可以化學(xué)合成編碼具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性的多肽的DNA。根據(jù)該方法可以得到上面(1)或(3)的核酸。
根據(jù)上述方法，可以得到只含有目標核酸的一部分的核酸片段。在該情況下，可以如下得到完整的目標核酸。測定得到的核酸片段的核苷酸序列，以確定該片段是目標核酸的一部分。使用作為探針的核酸片段或其一部分進行雜交?；蛘撸褂迷诤怂崞蔚暮塑账嵝蛄械幕A(chǔ)上合成的引物進行PCR。
“在嚴緊條件下的雜交”是指核酸能在T.Maniatis等.(編輯)，Molecular CloningA Laboratory Manual 2nded.，Cold Spring HarborLaboratory(1989)所述的條件或類似條件下進行雜交。例如，它是指在下述條件下的雜交能力。在含有0.5％SDS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％菲可(Ficoll)400和0.01％變性的鮭魚精子核酸的6×SSC(1×SSC0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)中，于50℃將其上固定有核酸的膜與探針孵育12-20小時。孵育后，在37℃，在含有0.5％SDS的2×SSC中洗滌膜，同時將SSC濃度下調(diào)至0.1×且溫度上調(diào)至50℃，直到來自固定的核酸的信號能從背景中區(qū)分開，然后檢測探針。如上所述確定這樣得到的新型核酸編碼的蛋白的活性，由此確定該核酸是否是目標核酸。
如果要使用寡核苷酸探針，雖然無意限制本發(fā)明，“嚴緊條件”是指，例如，在含有6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt’s和0.01％變性的鮭魚精子核酸的溶液中，在[Tm-25℃]的溫度下孵育過夜。
可以例如根據(jù)下面的方程確定寡核苷酸探針或引物的TmTm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)其中N為寡核苷酸探針或引物的鏈長度；％G+C是鳥嘌呤和胞嘧啶殘基在寡核苷酸探針或引物中的含量。
如果寡核苷酸探針或引物的鏈長度小于18個堿基，可以估算Tm，例如，為A+T(腺嘌呤和胸腺嘧啶)殘基數(shù)目乘以2(℃)得到的積與G+C殘基數(shù)目乘以4(℃)得到的積之和 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明包括能夠在嚴緊條件下與編碼本發(fā)明的多肽的核酸雜交的核酸，只要它能編碼具有熱穩(wěn)定的RNA酶H活性的多肽，即使它不具有這里公開的上述的相同核苷酸序列。
已知為每個氨基酸指定了1至6個密碼子(3個堿基的組合)，它們在基因中定義氨基酸。這樣，許多核酸都能編碼一個特定的氨基酸序列，雖然它依賴于氨基酸序列。天然的核酸不一定是穩(wěn)定的。在核苷酸序列中發(fā)生突變不是異常的。核酸中發(fā)生的突變可能不會改變編碼的氨基酸序列(稱作沉默突變)。在該情況下，可以認為產(chǎn)生了編碼相同氨基酸序列的不同核酸。這樣，人們不能否認在含有編碼一個特定的氨基酸序列的分離的核酸的生物的傳代過程中會產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的不同核酸的可能性。而且，如果人們使用各種遺傳工程技術(shù)，不難人工產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的不同的核酸。
例如，如果在編碼目標蛋白的原始核酸中使用的密碼子是在要通過遺傳工程生產(chǎn)蛋白的宿主中使用較低的密碼子，蛋白的表達水平會較低。在該情況下，為了提高目標蛋白的表達水平，人工地將密碼子轉(zhuǎn)化成一個在宿主中常用的密碼子而不改變編碼的氨基酸序列(例如JP-B 7-102146)。無需說明，可以如上所述人工制備編碼一個特定氨基酸序列的不同核酸。它們也會自然產(chǎn)生。
可以將編碼本發(fā)明的多肽的核酸(例如具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的核酸)連接到合適的載體上，以構(gòu)建重組DNA。關(guān)于用于構(gòu)建重組DNA的載體沒有特別的限制。例如，可以使用質(zhì)粒載體、噬菌體載體和病毒載體。選擇對目標重組DNA合適的載體。
而且，可以通過將重組DNA轉(zhuǎn)入合適宿主中生成轉(zhuǎn)化體。關(guān)于用于生成轉(zhuǎn)化體的宿主沒有特別限制?？梢允褂梦⑸锢缂毦⒔湍负徒z狀真菌以及培養(yǎng)的來自動物、植物、昆蟲等的細胞?？梢酝ㄟ^培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以在培養(yǎng)物中生產(chǎn)本發(fā)明的多肽來大量生產(chǎn)本發(fā)明的多肽，。
(3)本發(fā)明的多肽如上得到的本發(fā)明的多肽可以用于核酸擴增方法，例如在WO00/56877或WO 02/16639中記載的。根據(jù)在嵌合的核酸(例如DNA-RNA-DNA)中的RNA部分的長度，可以降低一些常規(guī)RNA酶H的RNA酶H活性。本發(fā)明的多肽較不敏感影響RNA部分的長度。這樣，可以優(yōu)選地用于如WO 02/064833中所述的堿基取代檢測方法或BioTechniques，卷.20，No.2，240-248頁(1996)中所述的循環(huán)探針方法。由于本發(fā)明的多肽具有這樣的性質(zhì)——其在95℃處理15分鐘后仍然可以保留RNA酶H活性，它可以用于多種用途。
實施例下面的實施例更詳細地解釋了本發(fā)明，但是不應(yīng)當(dāng)理解為限制其范圍。
實施例1深處古生球菌RNA酶H基因的克隆(1)從深處古生球菌制備基因組DNA將從10ml培養(yǎng)物中收集的深處古生球菌細胞(購自DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSM5631)懸浮到100μl含有20％蔗糖和50mM tris-HCl(pH8.0)的混合物中。向其中加入20μl 0.5M EDTA和10μl 10mg/ml溶菌酶氯化物水溶液(Nacalai Tesque)?；旌衔镌?0℃反應(yīng)2小時。反應(yīng)后，向反應(yīng)混合物中加入800μl含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的混合物、10μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Bio)和50μl 10％硫酸月桂酯鈉水溶液?；旌衔镌?7℃孵育1小時。反應(yīng)后，對混合物進行苯酚-氯仿萃取、乙醇沉淀和空氣干燥。然后將沉淀溶解到50μl TE中，以得到基因組DNA溶液。
(2)克隆RNA酶H基因的中間部分在不同熱穩(wěn)定的RNA酶H的氨基酸序列間的保守部分的基礎(chǔ)上，合成了寡核苷酸RN-F1(SEQ ID NO3)和RN-R2(SEQ ID NO4)。
使用5μl在實施例1-(1)中制備的深處古生球菌基因組DNA溶液作為模板，100pmol每一種RN-F1和RN-R2作為引物，在100μl體積中進行PCR。根據(jù)所附的方法，用TaKaRa Ex Taq(Takara Bio)作為PCR的DNA聚合酶。PCR如下進行94℃進行30秒、45℃進行30秒和在72℃進行1分鐘，進行50個循環(huán)。反應(yīng)后，對反應(yīng)混合物進行Microcon-100(Takara Bio)，以除去引物并濃縮反應(yīng)混合物，以得到約0.5-kb DNA片段AprF1R2。
(3)克隆RNA酶H基因的上游和下游部分測定在實施例1-(2)中得到的約0.5-kb片段AprF1R2的核苷酸序列。在測定的核苷酸序列的基礎(chǔ)上，合成用于克隆上游部分的特異性寡核苷酸AprRN-1(SEQ ID NO5)和用于克隆下游部分的特異性寡核苷酸AprRN-2(SEQ ID NO6)。另外，合成了表1所示的48個引物。表1中的tag序列如SEQ ID NO7所示。
表15′-tag序列-NN-SSSSSSS-3’(NG，A，T和C的混合物；S代表下面的核苷酸序列)編號 核苷酸序列 編號 核苷酸序列 編號 核苷酸序列1 ggagcag19gtaacgg37gcgcaag2 ggcaaag20gtaagcg38gcgcttg3 ggcaacg21gtacacg39gcggacg4 ggcacag22gtagacg40gcgtaag5 ggcattg23gtagcgg41gctacgg6 ggccaag24gtcaacg42gctcacg7 ggccttg25gcaccag43gctccag8 ggctaag26gcagacg44gcttgcg9 ggctacg27gcagcag45gcttggg10ggctcag28gcatggg46ggacacg11ggctttg29gccaaag47ggaccag12gggacag30gccacag48ggagacg13gggcaag31gccattg14gggcttg32gcccaag15gggtacg33gcccttg16ggtaacg34gcctacg17ggtacgg35gcctcag18ggtagcg36gcctttg在含有下述物質(zhì)的反應(yīng)混合物中進行PCR1μl作為模板的在實施例1-(1)中制備的深處古生球菌基因組DNA溶液，20pmol AprRN-1或20pmol AprRN-2和20pmol表1所列的48個引物中的一個的組合，20mM tris-醋酸鹽(pH8.5)，50mM醋酸鉀，3mM醋酸鎂，0.01％BSA，30μM每一種dNTP和2.5單位TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio)。如下進行PCR在94℃孵育3分鐘；和在98℃進行10秒、在50℃進行10秒和在72℃進行40秒，進行40個循環(huán)。對每一個PCR產(chǎn)物的一部分進行瓊脂糖凝膠電泳。用Microcon-100(Takara Bio)除去來自選擇產(chǎn)生單一帶的反應(yīng)混合物的引物，和濃縮反應(yīng)混合物。直接對濃縮物進行測序，以篩選含有RNA酶H的上游或下游部分的片段。結(jié)果表明，約600-堿基對的PCR擴增片段Apr-1A5含有RNA酶H基因的上游部分，約500-堿基對的PCR擴增片段Apr-2D9含有下游部分。
(4)克隆整個RNA酶H基因在核苷酸序列的基礎(chǔ)上，合成引物AprNde(SEQ ID NO8)和AprBam(SEQ ID NO9)。
使用1μl在實施例1-(1)中制備的深處古生球菌基因組DNA溶液作為模板，20pmol每一種AprNde和AprBam作為引物，在100μl體積中進行PCR。根據(jù)所附的方法，用Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio)作為PCR的DNA聚合酶。PCR如下進行在94℃進行30秒、在55℃進行30秒和在72℃進行1分鐘，進行40個循環(huán)。用NdeI和BamHI(均購自Takara Bio)酶切約0.7-kb的擴增DNA片段。然后，通過將得到的DNA片段分別整合進質(zhì)粒載體pTV119Nd(在該質(zhì)粒中，pTV119N中的NcoI位點被轉(zhuǎn)化成NdeI位點)或pET3a(Novagen)的NdeI和BamHI位點之間，構(gòu)建質(zhì)粒pAPR111Nd和pApr108。
(5)測定含有RNA酶H基因的DNA片段的核苷酸序列根據(jù)雙脫氧法，測定在實施例1-(4)中得到的插入到pAPR111Nd和pApr108中的DNA片段的核苷酸序列。
測定的核苷酸序列分析表明存在一個推測是編碼RNA酶H的開放閱讀框架。pApr108中的開放閱讀框架的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。從該核苷酸序列推測出的RNA酶H的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。PCR片段AprF1R2、Apr-1A5和Apr-2D9分別對應(yīng)于SEQ ID NO2中的第11個至第449個核苷酸區(qū)域、從第59個核苷酸向5’端的區(qū)域和從第373個核苷酸向3’端的區(qū)域。將用質(zhì)粒pApr108轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HMS174DE3指定并標記為大腸桿菌HMS174/pApr108，并于2002年8月20日(原始保藏日)以保藏號FERM BP-8433保藏在國際專利生物保藏單位國立高級工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究所(International Patent Organism Depositary，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本。使用DNA序列輸入分析系統(tǒng)DNASIS 3.6版(Takara Bio)的分析表明，24.4kDa蛋白的等電點為8.50?；诤塑账嵝蛄袑Ρ?，設(shè)想將該蛋白歸入NA酶H II。
(6)深處古生球菌RNA酶H基因的表達將pAPR111Nd轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109接種到10ml含有100μg/ml氨芐青霉素和1mM IPTG的LB培養(yǎng)基中，在37℃搖動培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，將通過離心收集的細胞懸浮到176.3μl緩沖液(20mM tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)中，超聲破碎。將通過在12,000rpm離心超聲處理的懸浮液10分鐘得到的上清液在70℃加熱10分鐘，然后再在12,000rpm離心10分鐘，以收集上清液作為加熱的上清液。類似地，將pApr108轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HMS174(DE3)接種到10ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃搖動培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，根據(jù)如上所述方法處理通過離心收集的細胞，以得到Apr RNA酶H的加熱的上清液。
如下測定加熱的上清液的酶活性。
將1mg poly(rA)或poly(dT)(均購自Amersham Pharmacia Biotech)溶解到1ml含有1mM EDTA的40mM tris-HCl(pH7.7)中，以制備poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。
然后將poly(rA)溶液(至終濃度20μg/ml)和poly(dT)溶液(至終濃度30μg/ml)加入到含有4mM MgCl2、0.1％DMSO和0.01％BSA的20mMHEPES-KOH(pH7.8)。混合物在40℃反應(yīng)10分鐘，然后冷卻到4℃，以制備poly(rA)-poly(dT)溶液。
將1μl加熱的Apr RNA酶H上清液加入到100μl poly(rA)-poly(dT)溶液中?；旌衔镌?0℃反應(yīng)10分鐘。向其中加入10μl 0.5M EDTA以終止反應(yīng)。然后在260nm測定吸光度。作為對照，向反應(yīng)混合物中加入10μl 0.5M EDTA，得到的混合物在40℃反應(yīng)10分鐘，然后測定吸光度。從沒有EDTA的反應(yīng)的吸光度中減去對照組的吸光度產(chǎn)生一個值——吸光度差。在吸光度差的基礎(chǔ)上，測定通過酶反應(yīng)從poly(rA)-poly(dT)雜交體釋放出的核苷酸濃度。將RNA酶H的1個單位定義為增加對應(yīng)于在10分鐘內(nèi)釋放出1nmol核糖核苷酸的A260的酶量，它可以根據(jù)下面的方程計算。如果使用稀釋過的酶溶液，基于稀釋比例校正使用該方程得到的值單位＝[吸光度差異×反應(yīng)體積(ml)]/0.0152作為結(jié)果，對加熱的Apr RNA酶H上清液觀察到了RNA酶H活性。
(7)純化的RNA酶H制劑的制備將用在實施例1-(4)中得到的pApr108轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)接種到400ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃搖動培養(yǎng)17小時。培養(yǎng)后，將通過離心收集的細胞懸浮到500ml緩沖液A[20mMtris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，2mM苯基甲烷磺酰氟，10mM 2-巰基乙醇]中，超聲破碎。將通過在14,000rpm離心超聲處理的懸浮液30分鐘得到的上清液在70℃加熱15分鐘。然后再在14,000rpm離心30分鐘，收集上清液。這樣得到400ml加熱的上清液。
將加熱的上清液加到用緩沖液A平衡的DE52陰離子交換柱(Whatman)，用緩沖液A洗滌。作為結(jié)果，RNA酶H流過DE52柱。
將流過DE52柱的蛋白溶液加到用緩沖液B(20mM tris-HCl(pH7.0)，1mM EDTA，100mM NaCl，10mM 2-巰基乙醇)平衡的P-II陽離子交換柱(Whatman)，用100mM至1000mM的NaCl線性梯度洗脫。作為結(jié)果，得到用約500mM NaCl洗脫的RNA酶H級分。
使用聚乙二醇(PEG)20000將150ml RNA酶H級分濃縮至50ml的體積。向濃縮液中加入150mM緩沖液C(20mM tris-HCl(pH7.0)，1mMEDTA，10mM 2-巰基乙醇)，將混合物加到用緩沖液B平衡的肝素-瓊脂糖OL-6B肝素親和柱(Amersham BioSciences)，用100mM至500mM的NaCl線性梯度洗脫。作為結(jié)果，得到用約250mM NaCl洗脫的RNA酶H級分。
使用PEG 20000將130ml RNA酶H級分濃縮至10ml的體積。將濃縮液中加到用緩沖液D(20mM tris-HCl(pH7.0)，0.5mM EDTA，200mMNaCl，10mM 2-巰基乙醇)平衡的HiLoad 26/60 Superdex G200HR凝膠過濾柱(Amersham BioSciences)，用緩沖液D洗脫。作為結(jié)果，得到25mlRNA酶H級分。
將35ml緩沖液C加入到25ml RNA酶H級分，將混合物加到用緩沖液B平衡的SP-瓊脂糖FF陽離子交換柱(Amersham BioSciences)，用100mM至500mM的NaCl線性梯度洗脫。作為結(jié)果，得到50ml用約250mM NaCl洗脫的RNA酶H級分。
通過使用Ultrafree-4 BIOMAX-5K(Millipore)離心，將50ml RNA酶H級分濃縮至11ml的體積。在Shape緩沖液(25mM tris-HCl(pH7.0)，0.5mM EDTA，30mM NaCl，5mM 2-巰基乙醇，50％甘油)中透析11ml濃縮液，得到4.5ml RNA酶H溶液。
這樣得到的RNA酶H用作Apr RNA酶H制劑。
如在實施例1-(6)中所述測量Apr RNA酶H制劑的酶活性。作為結(jié)果，對Apr RNA酶H制劑觀察到RNA酶H活性。
實施例2同源性研究對在實施例1中得到的來自深處古生球菌(Apr)的RNA酶H的氨基酸序列和編碼它的核苷酸序列進行同源性研究。使用計算機算法FASTA(3.2版；Pearson，W.R.等.，Pro.Natl.Acad.Sci.，852444-2448，1988)作為研究程序進行同源性計算。
使用計算機算法FASTA對Apr RNA酶H進行基因數(shù)據(jù)庫搜索。結(jié)果，Apr RNA酶H的氨基酸和核苷酸序列與假定為核糖核酸酶的一個的氨基酸和核苷酸序列的最高同源性分別為53％和60％。
實施例3RNA酶H的熱穩(wěn)定性檢驗使用在實施例1-(6)中得到的用pApr108轉(zhuǎn)化的大腸桿菌研究深處古生球菌RNA酶H的熱穩(wěn)定性。培養(yǎng)該大腸桿菌菌株，將從培養(yǎng)物中制備的粗酶提取物在95℃加熱15分鐘，根據(jù)實施例1-(6)中所述的方法檢測RNA酶H活性。結(jié)果，對來自深處古生球菌的RNA酶H觀察到RNA酶H活性。
另外，將濃度為5單位/ml的處于熱處理緩沖液(25mM tris-HCl(pH8.0)，5mM巰基乙醇，30mM NaCl，0.5mM EDTA，0.1％BSA，50％甘油)中的Apr RNA酶H在50、60、70、80或90℃加熱10分鐘，檢測殘余活性。以0.2單位/ml的終濃度，將熱處理的或未熱處理的樣品加入到活性檢測溶液(在終濃度，32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)，100mM醋酸鉀，1％DMSO，0.05％BSA，4mM醋酸鎂，0.2μM底物DNA-RNA-DNA和1μM模板W49(SEQ ID NO16))。用探針W3(SEQ ID NO15)檢測每個酶單位的降解速度。結(jié)果如圖1所示，將未熱處理的RNA酶H的活性定義為100。Apr RNA酶H在50至80℃加熱后具有幾乎100％的活性，在90℃反應(yīng)10分鐘后具有86.9±7.0％的殘余活性。
實施例4使用含Apr RNA酶H的ICAN系統(tǒng)進行HBV檢測的研究通過TA克隆，將對應(yīng)于部分HBV X蛋白基因(SEQ ID NO10)的560-堿基對的PCR-擴增片段插入到pT7Blue T載體中。得到的質(zhì)粒用作HBV陽性對照。
反應(yīng)混合物的組成如下在終濃度，32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)，100mM醋酸鉀，1％DMSO，0.01％BSA，4mM醋酸鎂，600μM每一種dNTP，11單位的BcaBEST DNA聚合酶，50pmol的每一種引物HBVF-2(SEQ ID NO11)和HBVR-1(SEQ ID NO12)，103個拷貝的HBV陽性對照和1.625、3.25、6.5或13單位的Apr RNA酶H(終體積25μl)。將反應(yīng)混合物置于已經(jīng)設(shè)定在55℃的熱循環(huán)器中，孵育60分鐘。
反應(yīng)后，3μl的每一種反應(yīng)混合物在3.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結(jié)果，使用各量的RNA酶H觀察到76-堿基對的目標擴增產(chǎn)物。
使用102拷貝、10拷貝或1拷貝的HBV陽性對照，進行類似的實驗檢測HBV陽性對照的靈敏度。結(jié)果，當(dāng)加入6.5單位的Apr RNA酶H時，觀察到最高靈敏度，能夠檢測出1拷貝的HBV陽性對照。
接著，按照WO 02/22831所述制備來自激烈熱球菌的RNA酶H II(PfuRNA酶H II)，來自閃爍古生球菌的RNA酶H II(Afu RNA酶H II)和來自Thermococcus litoralis的RNA酶H II(Tli RNA酶H II)。使用上述的ICAN系統(tǒng)，用它們檢測HBV，將靈敏度于用Apr RNA酶H觀察到的進行對比。當(dāng)使用Pfu RNA酶H II時，在10拷貝HBV陽性對照的靈敏度的條件下加入2.2單位的酶觀察到最高靈敏度。當(dāng)使用Afu RNA酶H II時，在10拷貝HBV陽性對照的靈敏度的條件下加入2.2單位的酶觀察到最高靈敏度。當(dāng)使用Tli RNA酶H II時，在10拷貝HBV陽性對照的靈敏度的條件下加入8單位的酶觀察到最高靈敏度。
如上所述，使用ICAN系統(tǒng)，使用Apr RNA酶H檢測HBV基因可以檢測到1個拷貝的HBV陽性對照。這樣，證實了能夠達到最高靈敏度。
實施例5Apr RNA酶H的底物的降解速度與底物形式的差異的比較使用在其序列中含有不同數(shù)目的RNA的三個DNA-RNA-DNA(探針W1(SEQ ID NO13)、探針W2(SEQ ID NO14)和探針W3(SEQ ID NO15))之一作為底物檢測RNA酶H的降解速度，檢測差異。另外，使用上述的底物，對比了如WO 02/22831所述制備的來自激烈熱球菌的RNA酶H II(PfuRNA酶H II)和來自Pyrococcus horikoshii的RNA酶H II(Pho RNA酶H II)與來自嗜熱棲熱菌(Tth RNA酶H I)(Toyobo)的RNA酶H I的剪切速度。
如果含有探針W1、探針W2或探針W3的溶液暴露于位于最大激發(fā)波長FAM(495nm)附近的波長的光，作為底物5’端的修飾的FAM會在最大波長519nm發(fā)射熒光。但是，熒光因為作為3’端的修飾的DABCYL的熒光共振能量傳遞(FRET)而受到削弱。如果底物被RNA酶H剪切，在519nm的熒光強度會因為釋放FRET而增強。這樣，通過確定剪切底物之前和之后在519nm測得的熒光強度的差異，可以監(jiān)測底物的降解。
如果底物濃度與酶濃度相比足夠高，酶反應(yīng)產(chǎn)物的量與時間成比例增加。如果要通過使用與酶量相比足夠過剩量的底物確定在519nm的熒光強度來監(jiān)測降解速度，使用線性方程可以約計反應(yīng)開始時每單位時間的熒光強度的增加。近似線的斜率對應(yīng)于單位時間的熒光強度的增加((熒光強度)/(分鐘))。假設(shè)當(dāng)熒光強度的增加達到平臺期且熒光強度達到其最大值時反應(yīng)系統(tǒng)中的底物被完全降解，則(最大熒光強度)-(酶切前的熒光強度)對應(yīng)于每單位的降解的底物量的熒光強度的增加。基于該值和單位時間的熒光強度的增加((熒光強度)/(分鐘))可以確定反應(yīng)速度v((降解的底物的量)/(分鐘))。
以0.4、0.8、1.6或2.4單位/ml的終濃度，將Apr RNA酶H加入活性檢測溶液(在終濃度，32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)，100mM醋酸鉀，1％DMSO，0.05％BSA，4mM醋酸鎂，0.2μM底物DNA-RNA-DNA和1μM模板W49(SEQ ID NO16))。用實時PCR測量儀器Smart Cycler(Takara Bio)檢測RNA酶H反應(yīng)和熒光強度。通過在55℃反應(yīng)100分鐘，確定反應(yīng)速度v((降解的底物的量)/(分鐘))。在由反應(yīng)速度v((降解的底物的量)/(分鐘))相對于Apr RNA酶H濃度繪圖制備的標準曲線的斜率的基礎(chǔ)上，確定每個酶單位的反應(yīng)速度((降解的底物的量)/(分鐘·單位))。使用Pfu RNA酶H II、Pho RNA酶H II或Tth RNA酶H I以類似的方法進行活性測量，以確定每個酶單位的反應(yīng)速度((降解的底物的量)/(分鐘·單位))。關(guān)于Tth RNA酶H I，以10、20、30或40單位/ml的終濃度將Tth RNA酶H加入到活性測量溶液中。
使用探針W1、探針W2或探針W3確定的各酶的每酶單位的反應(yīng)速度如表2所示。pmol/(分鐘·單位)的值顯示在表中。在括號中標明了將使用探針W3的每酶單位的反應(yīng)速度定義為100％的相對反應(yīng)速度。使用AprRNA酶H，在所有各種RNA數(shù)目的情況下，都觀察到比使用其它RNA酶H觀察到的更高的剪切速度。使用具有兩個RNA的底物觀察到最高剪切速度。使用具有一個或兩個RNA的底物觀察到的剪切速度接近于使用具有三個RNA的底物觀察到的剪切速度。
表2探針W1(RNA＝1) 探針W2(RNA＝2) 探針W3(RNA＝3)Apr RNA酶H II 17.0(61.6) 41.1(148.9) 27.6(100)Pfu RNA酶H II 3.3(34.8) 5.3(55.9) 9.5(100)Pho RNA酶H II 2.7(55.6) 3.2(67.8) 4.8(100)Tth RNA酶H I 0.0(0) 0.0(2.2)1.4(100)如上所述，證明了Apr RNA酶H的剪切速度對RNA長度的影響不太敏感，它可以用于核酸擴增反應(yīng)和核酸檢測反應(yīng)。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了對于遺傳工程是高度有價值的具有RNA酶H活性的多肽、編碼所述多肽的基因和通過遺傳工程生產(chǎn)所述多肽的方法。由于本發(fā)明的RNA酶H是熱穩(wěn)定的，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)在工業(yè)上有利的RNA酶H的方法。
現(xiàn)在，可以將本發(fā)明的RNA酶H用于根據(jù)本發(fā)明的各種用途。
序列表獨立文本SEQ ID NO3用于克隆來自深處古生球菌的編碼具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物RN-F1SEQ ID NO4用于克隆來自深處古生球菌的編碼具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物RN-R2SEQ ID NO5用于克隆來自深處古生球菌的編碼具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprRN-1SEQ ID NO6用于克隆來自深處古生球菌的編碼具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprRN-2SEQ ID NO7tag序列SEQ ID NO8用于擴增來自深處古生球菌的編碼具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprNdeSEQ ID NO9用于擴增來自深處古生球菌的編碼具有核糖核酸酶H II活性的多肽的基因的PCR引物AprBamSEQ ID NO11擴增部分乙肝病毒X蛋白的嵌合寡核苷酸引物?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO12擴增部分乙肝病毒X蛋白的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO13指定為探針W1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO14指定為探針W2的嵌合寡核苷酸。“核苷酸9-10是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO15指定為探針W3的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?-11是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO16指定為模板W49的寡核苷酸。
序列表<110>寶生物工程株式會社<120>熱穩(wěn)定RNA酶H<130>663952<150>JP2002-254153<151>2002-08-30<160>16<210>1<211>211<212>PRT<213>深處古生球菌(Archaeoglobus profundus)<400>9Met Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Pro Val Ile Gly1 5 10 15Pro Leu Val Ile Cys Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Thr Val Glu20 25 30Tyr Leu Lys Ser Val Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Asp Arg35 40 45Arg Lys Arg Glu Glu Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Ser Leu Cys Lys50 55 60Val Lys Val Leu Lys Ile Ser Val Glu Asp Leu Asn Arg Leu Met65 70 75
Glu Tyr Met Ser Ile Asn Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Val Glu80 85 90Ile Ile Arg Ser Leu Met Pro Lys Val Val Tyr Ile Asp Cys Pro95 100 105Asp Ile Asn Val Glu Arg Phe Lys His Glu Ile Glu Glu Arg Thr110 115 120Gly Val Glu Val Phe Ala Ser His Lys Ala Asp Glu Ile Tyr Pro125 130 135Ile Val Ser Ile Ala Ser Ile Val Ala Lys Val Glu Arg Asp Phe140 145 150Glu Ile Asp Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly155 160 165Tyr Pro Ser Asp Leu Arg Thr Ile Glu Phe Leu Arg Ser Tyr Leu170 175 180Arg Glu His Lys Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg Lys Arg Trp Lys185 190 195Thr Leu Lys Arg Leu Thr Thr His Thr Leu Ser Asp Phe Phe Glu200 205 210Val211<210>2<211>636<212>DNA<213>深處古生球菌(Archaeoglobus profundus)<400>2atgattgctg ggatagacga agctggaaaa ggacctgtaa taggccctct tgtaatatgc 60ggagtactgt gcgatgaaga gaccgtagaa tacttgaaga gcgtaggcgt taaagattca 120
aagaagctgg ataggaggaa gagagaggaa ctttacaata tcataaaatc gctttgcaag 180gttaaggtat tgaaaatatc tgtcgaggat ttgaacaggt taatggaata catgagtata 240aatgaaatct tgaagagagc ttacgttgaa ataataaggt ctttgatgcc taaagttgtg 300tacatagact gtccagatat taatgtggag agatttaagc acgaaataga ggagagaacg 360ggagtggagg tatttgcgag ccataaagcg gacgagatat atccaatagt atctatagct 420tcgatagtcg caaaagttga aagggatttt gaaatagaca agctgaagaa gatttatgga 480gactttggga gtggatatcc atcagatcta agaaccatcg aatttttaag gagttatcta 540agggaacaca aaagttttcc accaatcgta agaaagagat ggaaaactct caaaagattg 600acaacgcaca ctttaagcga tttctttgaa gtttag 636<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆來自深處古生球菌的編碼具有RNA酶H活性的多肽的基因的PCR引物RN-F1<400>3ggcattgatg aggctggnar rgg 23<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆來自深處古生球菌的編碼具有RNA酶H活性的多肽的基因的PCR引物RN-R2
<400>4ggtagggaaa gctgraancg 20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆來自深處古生球菌的編碼具有RNA酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprRN-1<400>5ctcttcatcg cacagtactc cg22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆來自深處古生球菌的編碼具有RNA酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprRN-2<400>6tttgcgagcc ataaagcgga cg22
<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>Tag序列<223>
<400>7ggcacgattc gataacg 17<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴增來自深處古生球菌的編碼具有RNA酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprNde<400>8aatcgatggt gttcatatga ttgctgggat agacgaagc 39<210>9<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴增來自深處古生球菌的編碼具有RNA酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprBam<400>9gcccacgccc tgggatccct aggctacggg tcctttaag 39<210>10<211>560<212>DNA<213>乙肝病毒<400>10ccttcccatg gctgctcggg tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg tcctttgtct 60acgtcccgtc ggcgctgaat cccgcggacg acccgtctcg gggccgtttg ggcctctacc 120gtcccttgct ttctctgccg ttccagccga ccacggggcg cacctctctt tacgcggtct 180ccccgtctgt gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct ctgcacgtcg 240catggagacc accgtgaacg gccaccaggt cttgcccaag ctcttacata agaggactct 300tggactctca gcaatgtcaa caaccgacct tgaggcatac ttcaaagact gtttgtttaa 360agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc tttgtactag gaggctgtag 420gcataaattg gtctgttcac cagcaccatg caactttttc acctctgcct aatcatctca 480tgttcatgtc ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcatggac 540attgacccgt ataaagaatt<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴增部分乙肝病毒X蛋白的嵌合寡核苷酸引物?！搴塑账? .s18-20為核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸″<400>11ctcttggact ctcagcaaug 20<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴增部分乙肝病毒X蛋白的嵌合寡核苷酸引物?！搴塑账?0-22為核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸″<400>12tcctcccagt ctttaaacam ac22<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計為探針W1的嵌合寡核苷酸?！搴塑账?為核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸″
<400>13cctacgccac cagctccaac20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計為探針W2的嵌合寡核苷酸?！搴塑账?-10為核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸″<400>14cctacgccac cagctccaac20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計為探針W3的嵌合寡核苷酸?！搴塑账?-11為核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸″<400>15cctacgccac cagctccaac20<210>16<211>49
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計為模板W49的寡核苷酸<400>16ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgac49
權(quán)利要求
1.一種具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的多肽，它選自由下述多肽組成的組(a)具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽；(b)具有這樣的氨基酸序列的多肽，其中在SEQ ID NO1的氨基酸序列中有至少一個氨基酸殘基被刪除、添加、插入或取代；和(c)具有這樣的氨基酸序列的多肽，它與SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少54％的同源性。
2.一種編碼具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的多肽的核酸，它選自由下述核酸組成的組(a)編碼具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽的核酸；(b)編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽的核酸，其中在SEQ ID NO1的氨基酸序列中有至少一個氨基酸殘基被刪除、添加、插入或取代；(c)編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽的核酸，所述氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸序列有至少54％的同源性；(d)具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的核酸；(e)由核苷酸序列組成的核酸，其中在SEQ ID NO2的核苷酸序列中有至少一個核苷酸被刪除、添加、插入或取代，這樣該核苷酸的刪除、添加、插入或取代導(dǎo)致翻譯成氨基酸序列；(f)能夠在嚴緊條件下與(a)至(d)中的任意一種核酸或其互補鏈雜交的核酸；和(g)具有與SEQ ID NO2的核苷酸序列有至少61％的同源性的核苷酸序列的核酸。
3.一種重組DNA，其包含權(quán)利要求2定義的核酸。
4.一種轉(zhuǎn)化體，其用權(quán)利要求3定義的重組DNA轉(zhuǎn)化。
5.一種生產(chǎn)具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求4定義的轉(zhuǎn)化體；和從培養(yǎng)物中收集具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的多肽。
6.一種具有熱穩(wěn)定的核糖核酸酶H活性的、可以通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體來獲得的多肽，所述轉(zhuǎn)化體中轉(zhuǎn)移了由大腸桿菌HMS174/pApr108(保藏號FERM BP-8433)含有的質(zhì)粒pApr108。
全文摘要
在基因工程中特別有用的具有RNA酶H活性的多肽，編碼所述多肽的基因和生產(chǎn)所述多肽的遺傳工程方法。
文檔編號C12N1/19GK1678736SQ0382054
公開日2005年10月5日 申請日期2003年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者外園成和, 上森隆司, 田中哲基, 加藤郁之進 申請人:寶生物工程株式會社