專利名稱：可用于檢測漢賽巴爾通體的17-kDa多肽的重組片段和合成肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于檢測哺乳動物包括人中的傳染原的診斷測定領(lǐng)域。本文公開的具體實(shí)施方案包括17-kDa蛋白的新型重組片段和合成多肽，它們可用于漢賽巴爾通 # (Bartonella henselae)的中。
背景技術(shù)：
漢賽巴爾通體是貓抓病(CSD)的病原體(Bass等，1997 ； Bran ley等，1996 ； Chomel, 2000)并且也可以導(dǎo)致免疫低下患者中的桿菌性血管瘤病(BA) (Arvand等，1998 ； Asharaf 和 Letha，2002 ；Birtles 等，1991 ；Chomel, 1996)。CSD 常見于被受感染的家貓抓傷或咬傷的兒童和年輕人(Chomel，2000)并且其特征是發(fā)熱和近衛(wèi)淋巴結(jié)病(regional lymphadenopathy)。正常情況下，該病在約三(3)個(gè)月內(nèi)自行消退。然而，在免疫低下患者中，巴爾通體感染經(jīng)常表現(xiàn)為更加嚴(yán)重且威脅生命的疾患，包括BA、心內(nèi)膜炎、腦病和肺病 (Margileth 和 Baehren，1998 ；Regnery 和 Tappero，1995)。BA 的特征是皮膚和皮下血管病變，其中細(xì)菌侵襲內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血管瘤。BA最初描述于感染人免疫缺陷病毒的患者中并且已經(jīng)延伸至包括患有累及不同器官諸如骨、肝和脾的增生性血管病變的患者(Regnery和 Tappero,1995)。漢賽巴爾通體通過分子和血清學(xué)檢測進(jìn)行鑒定(Eskow等，2001)。通過PCR擴(kuò)增對細(xì)菌基因進(jìn)行分子鑒定僅適用于具有適當(dāng)設(shè)備、專家和質(zhì)量控制規(guī)程的實(shí)驗(yàn)室。PCR可用于早期感染期間的檢測，其中細(xì)菌仍然存在于外周血流中。通過PCR的分子檢測被推薦用于手術(shù)切除的感染的心臟瓣膜，但對于外周血樣品不太靈敏，其原因是病原體生物可利用度低。血清學(xué)目前是用于確定巴爾通體感染的最常用的診斷測試(Houpikian和 Raoult, 2002, 2003 ；Sander 等，2001)。通過培養(yǎng)對此難養(yǎng)生物(fastidiousorganism)進(jìn)行細(xì)菌分離很困難，因?yàn)檫^長的孵育期導(dǎo)致低靈敏度，尤其對于接受抗生素治療的患者(Agan 和 Dolan, 2002 ；La Scola 和 Raoult,1999)。免疫熒光測定(IFA)是用于檢測漢賽巴爾通體接觸的最常用的血清學(xué)測試。其是高度主觀的測試，并且因此易于由那些執(zhí)行測試的人作出錯(cuò)誤的解釋。在不同實(shí)驗(yàn)室中觀察的差異性的靈敏度常常導(dǎo)致血清學(xué)結(jié)果解釋的變化(Amerein等，1996 ；Bergmans等， 1997 ；Fournier 等，2002)。缺少關(guān)于表征漢賽巴爾通體的抗原的信息已經(jīng)極大地阻礙了開發(fā)用于檢測漢賽巴爾通體的靈敏的和特異的測定。美國專利號5，736，347描述了 17_kDa蛋白的鑒定 (Anderson等，1995 ；Sweger等，2000)，所述蛋白代表漢賽巴爾通體中據(jù)信在人中誘發(fā)抗體應(yīng)答的少數(shù)已表征的抗原之一。然而，‘347專利未能提供全長17-kDa蛋白的靈敏度和特異性。僅進(jìn)行了 PCR斑點(diǎn)印跡雜交和IFA檢測測定，因此不能肯定地確定17-kDa蛋白可能是 ELISA測定中的良好的檢測抗原，尤其對于IgM。因此，17-kDa蛋白是否能夠用作檢測IgM 應(yīng)答的抗原遠(yuǎn)未明確，更不用說17-kDa蛋白上負(fù)責(zé)免疫原應(yīng)答的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域。因此，對于改進(jìn)的用于檢測漢賽巴爾通體的測定和方法一直存在需求。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)的不足之處并且提供了出人意料的發(fā)現(xiàn)，即17-kDa蛋白C-末端上的長度跨越 10個(gè)氨基酸的單個(gè)結(jié)構(gòu)域，對于結(jié)合獲自感染漢賽巴爾通體的患者的IFA血清陽性的血清中存在的抗體是必不可少的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了可用于檢測漢賽巴爾通體的漢賽巴爾通體的多肽片段。本發(fā)明提供了重組和合成多肽以及在檢測對漢賽巴爾通體特異的抗體中使用它們的方法。所述多肽、 方法和試劑盒可用于檢測最近的和/或正在發(fā)生的漢賽巴爾通體感染，它們可以用于診斷貓抓病(CSD)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種具有如SEQ ID NO :22中所示的氨基酸序列的合成多肽，其中所述合成多肽當(dāng)在ELISA測定中進(jìn)行測定時(shí)與來自感染漢賽巴爾通體的患者的 IFA血清陽性的血清反應(yīng)且不與IFA血清陰性的血清反應(yīng)。SEQ ID NO :22的多肽含有10 個(gè)氨基酸的區(qū)段(即，EKLEKSDVRL)，該區(qū)段被認(rèn)為對于SEQ ID NO 22多肽與來自感染漢賽巴爾通體的患者的IFA血清陽性的血清反應(yīng)但不與IFA血清陰性的血清反應(yīng)是必不可少的 (但非足夠的)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了合成多肽，其中所述合成多肽包含氨基酸置換、缺失或添加。所述置換可以是保守氨基酸置換。所述置換、缺失或添加可以涉及單個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選的實(shí)施方案包括具有氨基酸置換、缺失或添加的SEQ ID N0:22。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供合成多肽的氨基酸修飾(即，SEQ ID NO :24、25、26、27、28、29、30、31和32)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有選自由SEQ ID NO 24, SEQ ID N0:25和SEQ ID NO 26組成的組的氨基酸序列的合成多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO :27所示的氨基酸序列的合成多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO :32所示的氨基酸序列的合成多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有選自由SEQ ID NO :30和SEQ ID NO 31組成的組的氨基酸序列的合成多肽。還在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包含如SEQ ID NO :10中所示的氨基酸序列的重組多肽，其中所述重組多肽當(dāng)在ELISA測定中進(jìn)行測定時(shí)與來自感染漢賽巴爾通體的患者的IFA血清陽性的血清反應(yīng)且不與IFA血清陰性的血清反應(yīng)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了重組多肽，其中所述重組多肽包含氨基酸置換、缺失或添加。所述置換可以是保守氨基酸置換。所述置換、缺失或添加可以涉及單個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選的實(shí)施方案包括具有氨基酸置換、缺失或添加的SEQ ID NO=IO0更優(yōu)選地，本發(fā)明提供重組多肽的氨基酸修飾(即，SEQ ID NO :42、43、44和45)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有選自由SEQ ID NO 42和SEQ ID NO 43組成的組的氨基酸序列的重組多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO :44中所示的氨基酸序列的重組多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有如SEQ ID NO :45中所示的氨基酸序列的重組多肽。還在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含具有如SEQ ID NO 9中所示的核苷酸序列的分離的多核苷酸的載體。所述載體還包含與所述分離的多核苷酸可操作地連接的DNA轉(zhuǎn)錄啟動子。在另一個(gè)方面，所述載體選自由pET、pENTR和pCR 8/GW/T0P0 組成的組，且所述啟動子選自由Iac啟動子、trp啟動子和tac啟動子組成的組。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含具有如SEQ ID N0:9中所示的核苷酸序列的分離的多核苷酸。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌 (E.coli)。示例性的大腸桿菌包括 NovaBlue、BL21(DE3)或 BL21pLsS (DE3)。還在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備具有如SEQ ID No 10、SEQ IDNO 42、SEQ ID NO 43,SEQ ID NO 44或SEQ ID NO :45中所示的氨基酸序列的重組多肽的方法，其包括以下步驟(a)將分離的多核苷酸引入至宿主細(xì)胞中，所述分離的多核苷酸具有如SEQID NO 9中所示的多核苷酸序列；和(b)使所述宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中在合適的條件下生長以容許產(chǎn)生所述重組多肽； 和(c)分離所述重組多肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測來自哺乳動物的生物樣品中對漢賽巴爾通體特異的抗體的方法。示例性的檢測來自哺乳動物的生物樣品中對漢賽巴爾通體特異的抗體的方法包括下列的步驟使根據(jù)本公開的重組多肽結(jié)合在固相載體上；使結(jié)合的重組多肽與所述樣品接觸，如果所述樣品中存在所述抗體，則形成抗體-抗原復(fù)合物；洗掉未結(jié)合的免疫球蛋白；并檢測任何形成的抗原-抗體復(fù)合物的存在，諸如通過使這樣的復(fù)合物與能夠引起可視化反應(yīng)的二抗接觸，所述可視化反應(yīng)諸如底物的顏色改變。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測來自哺乳動物的生物樣品中的漢賽巴爾通體的方法，其包括以下步驟(a)將合成多肽固定在固相載體上，其中所述合成多肽具有選自由SEQ IDNO :24、 SEQ ID NO 25,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 27,SEQ ID NO :30、SEQID NO 31 和 SEQ ID NO 32組成的組的氨基酸序列；(b)將生物樣品加入至所述載體上以容許存在于所述生物樣品中的抗體結(jié)合于所述固定的合成多肽；(c)洗滌以去除任何未結(jié)合的抗體；和(d)檢測所述結(jié)合的抗體，
其中所述結(jié)合的抗體的存在指示所述哺乳動物被漢賽巴爾通體感染。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。還在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種檢測來自哺乳動物的生物樣品中的漢賽巴爾通體的方法，其包括以下步驟(a)將重組多肽固定在固相載體上，其中所述重組多肽具有如SEQ ID NO 10中所示的氨基酸序列；(b)將生物樣品加入至所述載體上以容許存在于所述生物樣品中的抗體結(jié)合于所述固定的合成多肽；(c)洗滌以去除任何未結(jié)合的抗體；和(d)檢測結(jié)合的抗體，其中結(jié)合的抗體的存在指示所述哺乳動物被漢賽巴爾通體感染。優(yōu)選地，哺乳動物是人。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。根據(jù)示例性實(shí)施方案的試劑盒包含根據(jù)本公開的肽和在根據(jù)本公開的方法中使用所述肽的說明書。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種可用于檢測漢賽巴爾通體的試劑盒，所述試劑盒包含(a)具有如SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 10中所示的氨基酸序列的多肽；禾口(b)在ELISA測定中使用所述多肽的說明書。


圖1描繪了漢賽巴爾通體中17-kDa蛋白的核苷酸和氨基酸序列。圖2描繪了在巴爾通體細(xì)菌(Bartonella bacteria)中IV型分泌系統(tǒng)的組裝的示意圖(摘自 Shamaei-jTousi 等，J. Bact. 186 (14) :4796-4801，2004)。根據(jù)此模型，virB2 蛋白的主體存在于外膜外，并且17-kDa (即，virB5)蛋白包埋在周質(zhì)膜內(nèi)部。圖3描繪了顯示全長17-kDa蛋白的可接近性圖(accessibility plot)。顯示了不同重組片段之間的關(guān)系和它們的可接近性。圖4描繪了漢賽巴爾通體中17-kDa蛋白的重組片段1的核苷酸和氨基酸序列。圖5是用于克隆和表達(dá)其中表達(dá)的17-kDa片段的重組多肽的載體的示意圖。圖6是pET30EK/LIC載體中的17_kDa片段的1 %瓊脂糖凝膠分析，顯示來自轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的環(huán)狀和線性化質(zhì)粒DNA樣品的移動。圖7描繪了漢賽巴爾通體中17-kDa蛋白的重組片段2的核苷酸和氨基酸序列。圖8描繪了漢賽巴爾通體中17-kDa蛋白的重組片段4的核苷酸和氨基酸序列。圖9描繪了本發(fā)明的漢賽巴爾通體中17-kDa蛋白的重組片段3的核苷酸和氨基酸序列。圖10是顯示轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞中重組片段3的誘導(dǎo)表達(dá)的考馬斯藍(lán)染色的SDS 電泳凝膠。圖11描繪了表達(dá)后17-kDa重組蛋白片段的純化圖解。圖12是來自小規(guī)模純化重組片段3蛋白的每個(gè)步驟的洗脫樣品的考馬斯藍(lán)染色的SDS PAGE凝膠。
圖13是來自大規(guī)模純化重組片段3蛋白的每個(gè)步驟的洗脫樣品的考馬斯藍(lán)染色的SDS PAGE凝膠。圖14A是使用作為包被抗原的重組片段3和IFA陰性血清的ELISA測定的光學(xué)讀出數(shù)據(jù)的圖。圖14B是使用作為包被抗原的重組片段3和IFA陽性血清的ELISA測定的光學(xué)讀出數(shù)據(jù)的圖。圖15是比較作為包被抗原的重組片段3與12個(gè)IFA陽性血清和6個(gè)IFA陰性血清中的全長17-kDa蛋白的ELISA測定的光學(xué)讀出數(shù)據(jù)的圖。圖16描繪了多種合成多肽和重組17-kDa蛋白片段之間的關(guān)系。圖17是用IFA陽性和IFA陰性血清比較作為包被抗原的肽3C㈧和肽3C-CS1⑶ 的ELISA測定的光學(xué)讀出數(shù)據(jù)的圖。圖18描繪了圖示在ELISA測定中每個(gè)患者的血清對(固定的)17_kDa多肽的反應(yīng)性的散點(diǎn)圖(dot plot) ((A)描繪了肽3C;(B)描繪了肽3C-CS3 ;(C)描繪了肽3C_Del ； 和(D)描繪了肽3C-RD)。圖19是合成多肽:3B、3C和3D的受試者工作特征曲線比較(ROC)。圖20是全長17-kDa、重組片段3、合成肽3B、3C和3D的受試者工作特征曲線比較 (ROC)。圖21描繪了圖示每個(gè)患者的血清對合成多肽肽3C(A)和肽3E⑶的反應(yīng)性的散點(diǎn)圖。圖22描繪了 NCBI和本發(fā)明之間17_kDa片段3的氨基酸序列的比較。圖23描繪了 17-kDa片段3及其突變體的氨基酸序列。圖24是通過Kpn I限制性酶線性化的17-kDa片段3突變克隆質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠。圖25是顯示不同的轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆(A和B)中17-kDa片段3各種突變的誘導(dǎo)表達(dá)的考馬斯藍(lán)染色的SDS電泳凝膠。圖26是顯示17-kDa片段3和突變蛋白(可溶的相對于包含體)的純化的考馬斯藍(lán)染色的SDS PAGE。圖27是顯示17-kDa片段3保守突變E (13)D的Ni-NTA純化的考馬斯藍(lán)染色的 SDS PAGE。圖28是顯示17-kDa片段3保守突變L(16) V的Ni-NTA純化的考馬斯藍(lán)染色的 SDS PAGE。圖29是顯示17-kDa片段3缺失突變AQ(Il)的Ni-NTA純化的考馬斯藍(lán)染色的 SDS PAGE。圖30是顯示17-kDa片段3插入突變+V(17_18)的Ni-NTA純化的考馬斯藍(lán)染色的 SDS PAGE。圖31描繪了圖示在ELISA測定中每個(gè)患者的血清對17-kDa多肽、17-kDa片段3保守突變(固定的)的反應(yīng)性的散點(diǎn)圖(㈧描繪了 17-kDa全長；(B)描繪了保守突變E(13) D ； (C)描繪了保守突變L(16) V ；和(D)描繪了所有三種多肽的R0C)。圖32描繪了圖示在ELISA測定中每個(gè)患者的血清對17_kDa多肽、17_kDa片段3、 和缺失突變(固定的)的反應(yīng)性的散點(diǎn)圖((A)描繪了 17-kDa全長；(B)描繪了 17-kDa片段3 ;(C)描繪了缺失突變AQ(Il)；和⑶描繪了所有三種多肽的R0C)。圖33描繪了圖示在ELISA測定中每個(gè)患者的血清對17_kDa多肽、17_kDa片段3、 和插入突變(固定的)的反應(yīng)性的散點(diǎn)圖(㈧描繪了插入突變+V(17-18) ； (B)描繪了所有三種多肽的R0C)。
具體實(shí)施例方式從下面對優(yōu)選實(shí)施方案的描述并結(jié)合附圖可以更好地理解本發(fā)明。對于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)顯而易見的是本文提供的本發(fā)明的所述實(shí)施方案僅是示例性的和說明性的且非限制性的。其改型的大量實(shí)施方案被認(rèn)為包括在本發(fā)明及其等同形式的范圍內(nèi)。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容通過引用合并。定義貫穿本說明書使用的多個(gè)術(shù)語應(yīng)當(dāng)具有本文給出的定義。如本文所使用，術(shù)語“ 17-kDa”是指具有如SEQ ID NO :2 (登記號YP_034054)中所示的氨基酸序列的多肽。該多肽代表漢賽巴爾通體Houston-I株中的virB5蛋白(IV型分泌性蛋白系統(tǒng)中的12種蛋白質(zhì)之一)。本發(fā)明人顯示在ELISA測定中17-kDa多肽結(jié)合存在于巴爾通體患者血清中的抗體。如本文所使用，漢賽巴爾通體Houston-I株中的17_kDa基因具有如SEQ IDNO 1(登記號U23447)中所示的核苷酸序列。如本文所使用，術(shù)語“ELISA”是指“酶聯(lián)免疫吸附測定”且是一種用于檢測樣品中抗體或抗原的存在的生化技術(shù)。如本文所使用，術(shù)語“IFA”是指免疫熒光測定?！皝碜曰颊叩腎FA血清陽性的血清” 是指針對已經(jīng)感染了漢賽巴爾通體的細(xì)胞顯示陽性免疫熒光染色的血清(獲自患者)?！皝碜曰颊叩腎FA血清陰性的血清”是指針對已經(jīng)感染了漢賽巴爾通體的細(xì)胞顯示陰性免疫熒光染色的血清(獲自患者)。如本文所使用，術(shù)語“多肽”、“肽”或“蛋白”可互換使用。如本文所使用，術(shù)語“重組多肽”是指經(jīng)由使用已經(jīng)通過引入異源核酸被修飾的載體由宿主細(xì)胞重組表達(dá)的多肽。如本文所使用，“合成多肽”是指經(jīng)化學(xué)合成的多肽(非天然存在的多肽)。為了本發(fā)明的目的，這些多肽意在包涵多肽變體，只要它們在ELISA測定中仍然具有結(jié)合存在于巴爾通體感染患者中的抗體的能力。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員要理解的是，這些多肽的氨基酸序列變體可以包括氨基酸的(i)保守置換，( )置換，(iii)添加和 (iv)缺失。要進(jìn)一步理解的是，具有充分高的％氨基酸序列同一性(例如，>90%)的多肽變體意在包涵在本發(fā)明的范圍內(nèi)，條件是該多肽保持其抗體結(jié)合能力。如本文所使用，術(shù)語“％氨基酸序列同一性”被定義為與17-kDa多肽中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。用于測定氨基酸序列同一性百分比的比對可以以本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的多種方式來實(shí)現(xiàn)，例如，使用公共可獲得的計(jì)算機(jī)軟件諸如BLAST、 BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR)軟件。如本文所使用，術(shù)語“哺乳動物”是指哺乳動物綱的任何脊椎動物，其具有或多或少地被毛發(fā)遮蓋的身體，用來自乳腺的乳撫養(yǎng)幼仔，并且生出活幼仔，不包括產(chǎn)卵的單孔目動物。優(yōu)選地，哺乳動物是人。
如本文所使用，術(shù)語“引物”是指可以通過模板引導(dǎo)的聚合而延伸的核苷酸序列。 為了本申請的目的，術(shù)語“核苷酸序列”意在包括DNA或其修飾體。如本文所使用，術(shù)語“生物樣品”可以包括但不限于來自哺乳動物諸如人或家畜的血液(例如，全血，血清，等)、腦脊液、滑液等。從生物樣品中提取核酸對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說是已知的。如本文所使用，術(shù)語“R0C”是指受試者工作特征分析(Receiver OperatingCharacteristics Analysis)。ROC分析是用于評價(jià)臨床檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)工具。 對于假定為判定閾(即，區(qū)分兩組響應(yīng)的截止值)的判別變量的每個(gè)觀察值ROC根據(jù)“靈敏度”和“1-特異性”評估系統(tǒng)的性能。對于ELISA，截止值可以在一定范圍的觀察值(即， OD45tlIim讀數(shù))內(nèi)變換，并且可以對這些值的每一個(gè)建立靈敏度和1-特異性。靈敏度和特異性的最佳配對是在西北方向上具有最大距離的點(diǎn)。本發(fā)明提供了重組多肽和合成多肽，它們當(dāng)在ELISA測定中測定時(shí)與來自感染漢賽巴爾通體的患者的IFA血清陽性的血清反應(yīng)且不與IFA血清陰性的血清反應(yīng)。17-kDa蛋白上的C-末端結(jié)構(gòu)域和抗體識別在某些實(shí)施方案中，17-kDa多肽的蛋白序列通過親水性分析來表征(例如，Hopp 和 Woods，1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 :3824)。17-kDa 的親水性圖用來鑒定疏水和親水區(qū)域，其指示隱匿在折疊的多肽內(nèi)部的區(qū)域，和在多肽的外部上可接近的區(qū)域?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中可獲得的計(jì)算機(jī)軟件程序來實(shí)現(xiàn)對預(yù)測結(jié)構(gòu)的操作。ELISA測定中抗體結(jié)合程度提供關(guān)于結(jié)構(gòu)同源性的信息，和關(guān)于與用來生成在抗體識別中具有特異性的片段的多肽部分對應(yīng)的區(qū)域的可接近性的信息。本發(fā)明人已經(jīng)在17-kDa蛋白的C-末端上鑒定了 10個(gè)氨基酸的區(qū)域，該區(qū)域擁有所需的結(jié)合IFA陽性血清中存在的抗體的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有 EKLEKSDVRLA(SEQ ID NO 33)的氨基酸序列的多肽。因此，包含這10個(gè)氨基酸殘基的多肽代表可以在漢賽巴爾通體的檢測中例如，在ELISA測定中使用的活性多肽。SEQ ID NO 33 的多肽本身不足以獲得結(jié)合IFA陽性血清中存在的抗體的能力。然而，SEQ ID N0:22的多肽(其包含SEQ ID NO 33的10個(gè)氨基酸)擁有結(jié)合IFA陽性血清中存在的抗體的能力。 因此，SEQ ID NO 33的10個(gè)氨基酸是必不可少的但不足以獲得結(jié)合IFA陽性血清中存在的抗體的能力。重組多肽本發(fā)明具體地考慮了重組多肽和合成多肽的表達(dá)和制備，它們的特征在于能夠結(jié)合IFA陽性患者血清中存在的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，因此本發(fā)明包括具有圖1中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)的分離的核酸，和其簡并變體，和其片段。由本文所述的核酸表達(dá)的重組蛋白包括圖1中所示的那些蛋白(SEQ IDNO :2)，以及包含修飾的氨基酸的變體。 本文所述的重組蛋白擁有結(jié)合IFA陽性血清中存在的抗體(且不與IFA陰性血清反應(yīng))的能力，并且它們含有10個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID N0:33)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如SEQ ID NO. 10中所示的氨基酸序列的重組多肽。要理解，這些重組多肽包括變體。一種類型的變體包括重組多肽的氨基酸修飾； 諸如，例如，氨基酸的置換、缺失或添加。另一種類型的變體包括SEQ IDN0:10的片段。變體保留了針對來自感染巴爾通體的患者的IFA血清陽性的血清的抗體結(jié)合能力并且不與來自感染巴爾通體的患者的IFA血清陰性的血清反應(yīng)。這樣的重組多肽包涵在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以采用保守氨基酸置換，例如，用天冬氨酸置換谷氨酸；用亮氨酸置換異亮氨酸；用丙氨酸置換甘氨酸或纈氨酸、或任何不同氨基酸(divergent amino acid)，用組氨酸置換精氨酸或賴氨酸，和用色氨酸置換酪氨酸和/或苯丙氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以采用單個(gè)氨基酸的添加和缺失。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還要理解，在不改變當(dāng)在ELISA測定中測試時(shí)肽結(jié)合抗體的能力的情況下，可以從多肽的每一端或兩端，或從多肽的內(nèi)部包含或缺失幾個(gè)氨基酸。17kDa的重組表達(dá)載體和宿主轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)控序列，諸如啟動子、增強(qiáng)子、終止子等，它們提供編碼序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。當(dāng)表達(dá)控制序列控制和調(diào)節(jié)DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)，該DNA序列與該表達(dá)控制序列“操作性連接”或“可操作地連接”。術(shù)語“操作性連接”包括在要表達(dá)的DNA序列前面具有適當(dāng)?shù)钠鹗夹盘?例如，ATG)并且保持正確的閱讀框從而容許在該表達(dá)控制序列的控制下表達(dá)該DNA序列并產(chǎn)生由該DNA序列編碼的所需產(chǎn)物。如果期望插入至重組DNA分子中的基因不包含適當(dāng)?shù)钠鹗夹盘?，這樣的起始信號可以插入至基因的上游(5')并位于該基因的閱讀框中?！皢幼有蛄小笔悄軌蚪Y(jié)合細(xì)胞中的RNA聚合酶并且啟動下游(3'方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為了定義本發(fā)明的目的，啟動子序列通過轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合在其 3'末端并且向上游(5'方向)延伸以包含以本底之上的可檢測水平啟動轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目的堿基或元件。在啟動子序列內(nèi)會發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(例如，通過用核酸酶Sl作圖方便地確定)，以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本文公開的DNA序列的表達(dá)。如本領(lǐng)域中所公知的，DNA序列可以通過將它們操作性地連接至合適的表達(dá)載體中的表達(dá)控制序列并且采用該表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化合適的單細(xì)胞宿主來表達(dá)。當(dāng)然，本發(fā)明的DNA序列與表達(dá)控制序列的這種操作性連接包括在DNA序列上游的正確閱讀框中提供起始密碼子ATG(如果尚未是 DNA序列的一部分的話)。可以采用大量的宿主/表達(dá)載體組合來表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。 例如，可用的表達(dá)載體可以由染色體、非染色體和合成DNA序列的區(qū)段組成。合適的載體包括pET、pENTR和pCR 8/GW/T0P0 等。啟動子包含Iac啟動子、trp啟動子和tac啟動子。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含載體，所述載體包含本發(fā)明的分離的多核苷酸。 示例性的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌(E. coli.)。各種大腸桿菌菌株包括，例如，NovaBlue株、 BL21 (DE3)或 BL2IpLsS(DE3)。要理解的是，并非所有載體、表達(dá)控制序列和宿主都將同樣良好地發(fā)揮作用以表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。然而，在不背離本發(fā)明的范圍的前提下，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將能夠選擇適宜的載體、表達(dá)控制序列和宿主，無需過多地進(jìn)行試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)所需的表達(dá)。例如，在選擇載體時(shí)，必需考慮宿主，因?yàn)檩d體必需在其中發(fā)揮作用。也要考慮載體的拷貝數(shù)，控制該拷貝數(shù)的能力，和由該載體編碼的任何其他蛋白諸如抗生素標(biāo)志物的表達(dá)。在選擇表達(dá)控制序列時(shí)，通常要考慮多種因素。這些因素包括，例如，體系的相對強(qiáng)度，其可控性，和其與待表達(dá)的特定DNA序列或基因的相容性，特別地關(guān)于可能的二級結(jié)構(gòu)。選擇合適的單細(xì)胞宿主要考慮，例如，它們與所選擇的載體的相容性，它們的分泌特性，它們正確地折疊蛋白的能力，和它們的發(fā)酵要求，以及由待表達(dá)的DNA序列編碼的產(chǎn)物對宿主的毒性，和表達(dá)產(chǎn)物的純化的簡易性。考慮到這些和其他因素，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將能夠構(gòu)建多種載體 /表達(dá)控制序列/宿主組合，這些組合將在發(fā)酵時(shí)或在大規(guī)模動物培養(yǎng)時(shí)表達(dá)本發(fā)明的DNA 序列。合成多肽本發(fā)明提供了合成多肽，所述合成多肽具有結(jié)合IFA陽性患者血清中存在的抗體并且不與IFA陰性血清反應(yīng)的特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有至少SEQ ID NO 33中所示的氨基酸結(jié)構(gòu)的合成多肽。要理解該合成多肽的長度可以為 10至 30個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，合成多肽可以包含15至25個(gè)氨基酸。優(yōu)選合成多肽可以包含18個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，合成多肽具有SEQ ID NO 22中所示的氨基酸序列及其變體。合成多肽變體可以包含氨基酸的置換、缺失或添加。優(yōu)選地，置換可以包括保守氨基酸置換。優(yōu)選地， 缺失或添加可以包括單個(gè)氨基酸或若干個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，合成多肽是SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :26、SEQID NO :27、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31 或 SEQ ID NO :32。本文所述的合成蛋白擁有結(jié)合IFA陽性血清中存在的抗體(且不與IFA陰性血清反應(yīng))的能力，并且它們包含10個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID N0:33)。ELISA 測定對IFA血清陽性的血清中的抗體結(jié)合的檢測可以通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，例如，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、Western印跡等。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體結(jié)合通過檢測一抗上的標(biāo)記來評估。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一抗通過檢測二抗或二級試劑與一抗的結(jié)合來評估。在另外的實(shí)施方案中，標(biāo)記二抗。本領(lǐng)域中已知有許多方式用于在免疫測定中檢測結(jié)合，且這些方式包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，為了選擇重組或合成的多肽的特異性表位，可以在ELISA測定中評估抗體結(jié)合，其中所述多肽或其片段包含這樣的表位。采用重組和合成的17-kDa多肽的診斷試劑盒本發(fā)明提供了一種用于診斷CSD的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒是包含本文所述的重組多肽或合成多肽、包括一抗或二抗在內(nèi)的檢測試劑、和包括酶底物和顯色試劑在內(nèi)的其他必需試劑的ELISA試劑盒?？梢耘c這樣的試劑盒一起存在的其他組分包括說明書，所述說明書詳細(xì)說明了使用本發(fā)明的重組/合成多肽對漢賽巴爾通體的檢測步驟。本發(fā)明的診斷試劑盒還包括陽性和陰性血清對照。本發(fā)明的診斷試劑盒開可以用于診斷涉及漢賽巴爾通體的其他感染性疾病諸如桿菌性血管瘤病(bacillary angiomatosis)。作為說明且不作為限制地提供下列的實(shí)施例。試驗(yàn)研究實(shí)施例1 17-kDa重組片段17-kDa基因(圖1)最初在1995年被克隆(Anderson等，1995)；然而，關(guān)于該蛋白的功能了解很少。17-kDa基因位于與土壤桿菌屬(Agrobacterium)中的virB毒力操縱子同源的基因簇內(nèi)(Padmalayam等，2000)。編碼的17_kDa蛋白是漢賽巴爾通體中的IV型分泌系統(tǒng)(TIVSS)的一種成分(圖2)，并且其是已知介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲、促炎活化和抗凋亡保護(hù)的膜結(jié)合蛋白復(fù)合物(khmid等，2004)。從其氨基酸序列(圖1)，推斷17-kDa蛋白缺少跨膜結(jié)構(gòu)域，不擁有信號序列，并且被認(rèn)為是一種可溶性蛋白。在漢賽巴爾通體侵襲人內(nèi)皮細(xì)胞后證明在其中有17-kDa蛋白的誘導(dǎo)(Schmiederer等，2001)。設(shè)計(jì)使用酵母雙雜交系統(tǒng)來闡明TIVSS的亞基之間的相互作用的研究證明virB5(即，17-kDa)和virB7之間的物理結(jié)合作用(Shamaei-Tousi等，2004)。以前已經(jīng)顯示全長17-kDa多肽可以在Wfestern印跡(美國專利號5，736，；347)和 ELISA測定(Loa等，2005)中用于檢測對漢賽巴爾通體特異的抗體。因?yàn)閷Υ巳祟惒≡w鑒定的其他免疫原性抗原非常少，因此對此蛋白的一個(gè)或多個(gè)表位進(jìn)行進(jìn)一步的分析以努力設(shè)計(jì)更有效的用于檢測漢賽巴爾通體感染的方法、測定和試劑盒。使用電腦模擬(in silico)的方式，生成％可接近性圖(Accessibility Plot) (參見，圖幻。該圖顯示了具有高％可接近性的兩( 個(gè)區(qū)域的圖形表示，表明這兩個(gè)區(qū)域可能暴露在17-kDa蛋白表面上。具有高％可接近性的第一個(gè)區(qū)域包括從約#20至約#80 的氨基酸；并且具有高％可接近性的第二個(gè)區(qū)域包括從約#110至約#140的氨基酸?？缭郊s#80至約#110氨基酸的區(qū)域顯示低％可接近性。基于％可接近性圖，制備兩個(gè)(2)重組片段，并且它們跨越這兩個(gè)具有高％可接近性的區(qū)域。然后在ELISA測定中使用這兩個(gè)制備的重組片段來測定它們結(jié)合感染漢賽巴爾通體的患者(即，IFA血清陽性)中存在的抗體的能力。因?yàn)榭缭桨被?20至#80的區(qū)域具有最高的％可接近性，通過PCR克隆制備重組片段1 (參見，圖3和4 ；詳見下面的實(shí)施例幻。片段1跨越氨基酸#13至氨基酸#74(從N末端計(jì))并且含有總計(jì)62個(gè)氨基酸。 片段1的核苷酸和氨基酸序列(分別為SEQID NOs 3和4)繪制在圖4中。另外，制備片段2以跨越高％可接近性區(qū)域。片段2跨越氨基酸#63至氨基酸 #133。片段2的核苷酸和氨基酸序列(分別為SEQ ID NO :5和6)描繪在圖7中。制備片段4以覆蓋低％可接近性區(qū)域，作為對照。片段4跨越氨基酸#81至氨基酸#109。片段4 的核苷酸和氨基酸序列(分別為SEQ ID NO 7和8)描繪在圖8中。與片段2相比，制備片段3以覆蓋具有高％可接近性的第二區(qū)域。片段3含有 17-kDa蛋白的C-末端的最后15個(gè)氨基酸。當(dāng)與片段2比較時(shí)，片段3缺少片段2的N-末端的14個(gè)氨基酸。片段3跨越氨基酸#77至氨基酸#148。片段3的核苷酸和氨基酸序列 (SEQ ID NOs 9和10)描繪在圖9中。實(shí)施例2 17-kDa重組片段的克隆生成總計(jì)四個(gè)⑷重組片段(參見，圖3)?；诰幋a17-kDa蛋白(SEQ ID NO 2) 的基因的DNA序列(SEQ ID NO 1)，制備四⑷組正向和反向引物以從漢賽巴爾通體的基因組DNA中擴(kuò)增17-kDa蛋白的4個(gè)片段(參見，表1)。每個(gè)引物包括5'端和3’端上的 LIC延伸以促進(jìn)定向和框內(nèi)克隆至pET30Ek/LIC載體中(在下面詳述)。表1列舉了這四 (4)組正向和反向引物的核苷酸序列?？糜谂３删幋a漢蕃巴爾通體的17-kDa g白的四(4)個(gè)重組片段的多核苷Il 的引物
權(quán)利要求
1.一種具有如SEQ ID NO :22中所示的氨基酸序列的合成多肽，其中所述合成多肽當(dāng)在ELISA測定中進(jìn)行測定時(shí)與來自感染漢賽巴爾通體(Bartonellahenselae)的患者的IFA 血清陽性的血清反應(yīng)且不與IFA血清陰性的血清反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成多肽，其中所述合成多肽包含氨基酸的置換、缺失或添加。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成多肽，其中所述置換是保守氨基酸置換。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成多肽，其中所述合成多肽具有選自由SEQIDNO 24, SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26組成的組的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成多肽，其中所述合成多肽具有如SEQID N0:27中所述的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成多肽，其中所述缺失是單個(gè)氨基酸缺失。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的合成多肽，其中所述合成多肽具有如SEQID N0:32中所示的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成多肽，其中所述添加是氨基酸添加。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的合成多肽，其中所述合成多肽具有選自由SEQIDN0:30和SEQ ID NO 31組成的組的氨基酸序列。
10.一種具有如SEQ ID NO 10中所示的氨基酸序列的重組多肽，由此所述重組多肽當(dāng)在ELISA測定中進(jìn)行測定時(shí)與來自感染漢賽巴爾通體的患者的IFA血清陽性的血清反應(yīng)且不與IFA血清陰性的血清反應(yīng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組多肽，其中所述重組多肽還包括氨基酸的置換、缺失或添力口。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組多肽，其中所述置換是保守氨基酸置換。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組多肽，其中所述重組多肽具有選自由SEQIDNO :42和 SEQ ID NO :43組成的組的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組多肽，其中所述缺失是單個(gè)氨基酸缺失。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組多肽，其中所述重組多肽具有如SEQIDNO 44中所示的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組多肽，其中所述添加是單個(gè)氨基酸添加。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的重組多肽，其中所述重組多肽具有如SEQIDNO :45中所示的氨基酸序列。
18.—種檢測來自哺乳動物的生物樣品中的漢賽巴爾通體的方法，其包括以下步驟(a)將合成多肽固定在固相載體上，其中所述合成多肽具有選自由SEQIDNO :24、SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO :31 禾口 SEQ ID NO 32 組成的組的氨基酸序列；(b)將生物樣品加入至所述載體上以容許存在于所述生物樣品中的抗體結(jié)合于所述固定的合成多肽；(c)洗滌以去除任何未結(jié)合的抗體；和(d)檢測結(jié)合的抗體，其中所述結(jié)合的抗體的存在指示所述哺乳動物被漢賽巴爾通體感染。
19.一種檢測來自哺乳動物的生物樣品中的漢賽巴爾通體的方法，其包括以下步驟(a)將重組多肽固定在固相載體上，其中所述重組多肽具有選自由SEQIDNO :10、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO 44 和 SEQ ID NO 45 組成的組的氨基酸序列；(b)將生物樣品加入至所述載體上以容許存在于所述生物樣品中的抗體結(jié)合于所述固定的重組多肽；(c)洗滌以去除任何未結(jié)合的抗體；和檢測結(jié)合的抗體，其中所述結(jié)合的抗體的存在指示所述哺乳動物被漢賽巴爾通體感染。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
22.—種載體，其包含具有如SEQ ID NO :9中所示的核苷酸序列的分離的多核苷酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的載體，其中所述載體還包含與所述分離的多核苷酸可操作地連接的DNA轉(zhuǎn)錄啟動子。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的載體，其中所述載體選自由pET、pENTR和pCR 8/GW/T0P0 組成的組，且所述啟動子選自由Iac啟動子、trp啟動子和tac啟動子組成的組。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的載體，其中所述載體是pET且所述啟動子是Iac啟動子。
26.一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求22所述的載體。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的宿主細(xì)胞，其中所述大腸桿菌是NoVaBlUe、BL21(DE3)或 BL21pLsS(DE3)。
29.一種制備具有如SEQ ID No :10中所示的氨基酸序列的重組多肽的方法，其包括以下步驟(a)將分離的多核苷酸引入至宿主細(xì)胞中，所述分離的多核苷酸具有如SEQIDN0:9中所示的多核苷酸序列；和(b)使所述宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中在合適的條件下生長以容許產(chǎn)生所述重組多肽；和(c)分離所述重組多肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述重組多肽還包含氨基酸的置換、缺失或添加的修飾，其中所述修飾的重組多肽具有選自由SEQ ID NO 42, SEQID NO 43, SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO 45組成的組的氨基酸序列。
31.一種用于檢測漢賽巴爾通體的試劑盒，所述試劑盒包含(a)根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成多肽；和(b)在ELISA測定中使用所述合成多肽的說明書。
32.一種用于檢測漢賽巴爾通體的試劑盒，所述試劑盒包含(a)根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組多肽；和(b)在ELISA測定中使用所述重組多肽的說明書。
全文摘要
本發(fā)明內(nèi)容描述了漢賽巴爾通體的重組和合成多肽以及用于檢測對漢賽巴爾通體特異的抗體的相關(guān)方法和試劑盒。17-kDa多肽、方法和試劑盒可用于檢測最近的和/或正在發(fā)生的漢賽巴爾通體感染，它們可以用于診斷貓抓病(CSD)。
文檔編號G01N33/53GK102197045SQ200980142311
公開日2011年9月21日 申請日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日
發(fā)明者E·莫戴察, L·黃, 約翰·霍因, 馬丁·阿德爾森 申請人:醫(yī)學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室有限公司