專利名稱：松弛素肽合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽合成，特別是肽激素的合成。本發(fā)明尤其涉及胰島素家族肽的合成，特別是松弛素(relaxin)的合成。
背景技術(shù)：
松弛素(RLX)由FrederickHisaw[Hisaw, F. (1926) Experimental relaxation of the pubic ligament of the guinea pig. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 23,661-663]于 1926年發(fā)現(xiàn)，其作為能夠松弛骨盆韌帶并調(diào)節(jié)雌性生殖道功能的底物。松弛素家族的肽類包括松弛素-I (RLXl)、松弛素-2 (RLX2)和松弛素_3 (RLX3)。松弛素肽類屬于較大家族的胰島素樣肽類(insulin like peptides，INSL)。該肽家族包括胰島素和胰島素樣肽3、4、5和
6。這些肽類具有高度的結(jié)構(gòu)相似性。除雌性生殖道功能以夕卜，已知松弛素參與一系列的醫(yī)療病癥(medicalconditions)，例如其參與心臟保護(hù)，如在 Samuel，C. S. and Hewitson，T. D. (2006)Relaxinin cardiovascular and renal disease ；Kidney Int.69，1498—1502 ;Bani， D. ， Nistri，S. ， Bani Sacchi, T.and Bigazzi, M. (2005)Basic progress and future therapeuticperspectives of relaxin in ischemic heart disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1041，423-430 ；SamueI, C. S.，Du，X. J.，Bathgate，R. A. D. and Summers, R. J. (2006) “Relaxin”thestiffened heart and arteries the therapeutic potential for relaxin in thetreatment of cardiovascular di sease.Pharmacol. Ther. 112，529—552 ;Dschietzig，T.，Bartsch，C.，Baumann，G. and Stangl, K. (2006) Relaxin-a pleiotropic hormoneand its emerging role for experimental and clinical therapeutics. Pharmacol.Ther. 112，38-56 中所公開的；其參與纖維變性，如在 Bathgate，R. A. D.，Hsueh，A. J. andSherwood，0. D. (2006)Physiology and molecular biology of the relaxin peptidefamily. In Physiology of Reproduction. (Knobil，E. and Neill, J. D.，Eds)，679-770.Elsevier, San Diego ；Sherwood, 0. D. (2004)Relaxins physiological roles and otherdiverse actions. Endocr. Rev. 25, 205-234 ；Samuel, C. S. (2005) Relaxin antifibroticproperties and effects in models of disease.Clin. Med. Res. 3,241-249 中所公開的；其參與過敏反應(yīng)，如在 Bani, D. (1997) Relaxin apleiotropic hormone. Gen.Pharmacol. 28，13-22.中所公開的;其參與癌癥，如在 Silvertown, J. D.，Summerlee,A. J. and Klonisch, T. (2003)Relaxin-Iike peptides in cancer. Int. J. Cancer 107，513-519 ；Kamat, A. A.，F(xiàn)eng, S.，Agoulnik，I. U.，Kheradmand，F(xiàn).，Bogatcheva，N. V.，Coffey, D.，Sood，A. K.and Agoulnik，A. I. (2006)The role of relaxin in endometrialcancer. Cancer Biol. Ther. 5，71-77中所公開的；且其參與創(chuàng)傷愈合，如在Yamaguchi，Y. and Yoshikawa, K. (2001)Cutaneous wound healing an update. J. Dermatol. 28,521-534 ；113 Wyatt, T. A. , Sisson, J. H. , Forget, M. A. , Bennett, R. G. , Hamel, F. G. andSpurzem,J. R. (2002)Relaxin stimulates bronchial epithelial cell PKA activation,migration, and ciliary beating, Exp.Biol. Med. (Maywood)227,1047-1053 ；Casten,G. G. and Boucek, R. J. (1958)Use of relaxin in the treatment of scleroderma. J. Am.Med. Assoc. 166,319-324 中所公開的。RLX2其他的治療應(yīng)用被認(rèn)為與它控制膠原更新(collagen turnover)的能力有關(guān)，如在 Samuel CS, Hewitson TD, Unemori EN, Tang ML, Cell Mol Life Sci. 2007,64,1539-57. Drugs of the future :the hormone relaxin 中所公開的。RLX2潛在地具有寬范圍的治療應(yīng)用，對(duì)于其在研究和用于治療目的的應(yīng)用，存在著顯著的需求。由于對(duì)生產(chǎn)或分離其他松弛素存在著困難，因此它們的治療潛能沒有得到普遍研究。RLX具有兩個(gè)肽鏈，通常稱為A鏈(RLXA)和B鏈(RLXB)。這些鏈(A鏈和B鏈)通過兩個(gè)分子間半胱氨酸橋連接，并且鏈A包含另外的分子內(nèi)二硫鍵。鏈的構(gòu)象排布是松弛素，尤其是RLXl和RLX2的重要特征，并且兩個(gè)鏈必須通過適當(dāng)?shù)亩蜴I連接，以顯示出適當(dāng)?shù)纳锘钚?。此外，RLXB通常在水溶液中高度不溶。RLXB的不溶性和確保形成適當(dāng)二硫鍵的需要意味著通過隨機(jī)鏈結(jié)合的合成是非常困難的，并且使得RLXB如通過色譜方法的純化非常困難，如在 J.-G. Tang et al, Biochemistry 2003，42，2731-2739 ；ffade, J. D.,和 Tregear, G. ff. (1997) Relaxin. Methods EnzymoI. 289,637-646 中所公開的。利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)松弛素的方法，已在US-A-4758516和US-A-4758516的分案US-A-5023321中公開。在這些專利中，與用于利用重組DNA技術(shù)合成肽類的方法一起，公開了用于表達(dá)人前松弛素原(前原松弛素，preprorelaxin)和其亞基(subunits)的基因和DNA轉(zhuǎn)移載體(DNAtransfer vectors),包括用于表達(dá)人松弛素原(prorelaxin)和A鏈、B鏈和C鏈的基因和轉(zhuǎn)移載體。US-A-5464756公開了用于將一個(gè)肽切割為兩個(gè)多肽組分的方法，其通過用切割試劑處理還原的游離半胱氨酸形式的多肽，并特別是培養(yǎng)包含編碼該多肽并在待切割位置處具有至少一個(gè)Asp密碼子的DNA的細(xì)胞，以致在宿主細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)DNA以產(chǎn)生多肽，并用稀酸處理游離-半胱氨酸形式的多肽，以產(chǎn)生所期望的切割。重組DNA技術(shù)可能是冗長和復(fù)雜的，并且不能滿足用于大規(guī)模生產(chǎn)松弛素。此外，因?yàn)樵谠摷夹g(shù)中使用的材料是基于動(dòng)物的，通過這樣的方法生產(chǎn)的松弛素的使用，可能會(huì)在宗教地區(qū)或因?yàn)榈赖略蚨痪芙^，限制通過該方式生產(chǎn)的松弛素產(chǎn)品的應(yīng)用。松弛素的化學(xué)合成已普遍證明是有問題的。RLXl的化學(xué)合成是未知的并因此也無法研究合成RLXl的可能治療應(yīng)用。E.Bullesbach and C.Schwabe, Journal Biol. Chem. 1991，266，10754-10761 ;E. Bullesbach and C. Schwabe, J. Biol. Chem. 2005,280,14586-14590 公開了 RLX2 的化學(xué)合成。該方法包括兩個(gè)單獨(dú)鏈的固相合成，和它們的位點(diǎn)定向結(jié)合(組合，combination),其保護(hù)特定的半胱氨酸殘基，以確保預(yù)定半胱氨酸殘基結(jié)合而形成特定的二硫鍵。在鏈組裝之后，需要要求施加氟化氫的兩個(gè)反應(yīng)步驟和用于位點(diǎn)定向鏈結(jié)合的三個(gè)反應(yīng)步驟，用 于完成RLX2的合成。然而，該方法非常費(fèi)力，具有較小的產(chǎn)率，并且不合乎期望地要求使用高毒性和危險(xiǎn)的氟化氫。US-A-4835251公開了用于結(jié)合人松弛素的A鏈和人松弛素的B鏈的方法，通過在7至12的pH下在氧(氣氛)下將還原游離-半胱氨酸形式的A鏈和還原游離-半胱氨酸形式的B鏈在水性介質(zhì)中混合以產(chǎn)生生物活性的人松弛素，其中B鏈，而非產(chǎn)物，是變性的。然而對(duì)于生產(chǎn)合成人松弛素的嘗試還未得到滿意的結(jié)果。人松弛素-I的鏈B(RLXlB)和人松弛素-2的B鏈(RLX2B)以及中間體小肽和片段是高度不溶的或疏水的(hydrophobic),并在 RLXlB 和 RLX2B 的序列 Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys 周圍延伸妝鏈中已遇到困難。固相合成路線包括非常難的偶聯(lián)(coupling)和脫保護(hù)步驟。另外，由于在松弛素合成期間B鏈的不溶性導(dǎo)致不期望的沉淀或B鏈的未溶解，對(duì)于RLXlB和RLX2B與相應(yīng)松弛素A鏈，在形成適當(dāng)?shù)逆滈g二硫鍵結(jié)合中遇到了困難。

發(fā)明內(nèi)容
存在對(duì)于不利用重組DNA技術(shù)并且不包括冗長或復(fù)雜過程或使用危險(xiǎn)試劑生產(chǎn)胰島素型肽類(例如，松弛素類，尤其是人松弛素類)的方法的需求。另外，不采用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)松弛素將提供材料的來源，且尤其利于對(duì)潛在治療應(yīng)用的研究。我們現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了用于生產(chǎn)胰島素型肽類的合成路線，其利用胰島素型肽類和包含至少一個(gè)甲硫氨酸亞砜殘基的松弛素(尤其是松弛素I和松弛素2)、松弛素型產(chǎn)品和它們的前體的B鏈的(例如，松弛素的B鏈)的較高溶解性。尤其是，本申請(qǐng)?zhí)峁┝?RLX2(其結(jié)構(gòu)在圖2中示出)改進(jìn)的化學(xué)合成，以及RLXl (其結(jié)構(gòu)在圖 I 中示出)、RLX1B、RLX2B 和 Met (0)24_RLX1B 和 Met (0) 25-RLX2B (其結(jié)構(gòu)分別在圖5和圖6中示出)的新化學(xué)合成。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于生產(chǎn)具有至少兩個(gè)肽鏈A和B的胰島素型肽的方法，其中鏈A和鏈B通過至少一個(gè)二硫鍵(disulphide link)連接，該方法包括，提供肽鏈A和鏈B (每種鏈包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基并且鏈A和鏈B中的至少一個(gè)包含氧化的甲硫氨酸殘基)，使鏈A和鏈B在(一定)條件下結(jié)合，以致鏈A中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基和鏈B中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合以使鏈連接在一起，并還原氧化的甲硫氨酸殘基以產(chǎn)生胰島素型肽。適當(dāng)?shù)?，胰島素型肽為松弛素，例如松弛素I和松弛素2，并且鏈A為松弛素A鏈而鏈B為松弛素B鏈。適當(dāng)?shù)?，氧化的甲硫氨酸殘基為甲硫氨酸氧化物殘基，且殘基在B鏈中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于生產(chǎn)生物活性松弛素的方法，包括提供具有至少一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的松弛素A鏈、以及其中B鏈中至少一個(gè)甲硫氨酸殘基被氧化的松弛素B鏈，B鏈可選地包含分子內(nèi)二硫鍵，使A鏈和B鏈在(一定)條件下結(jié)合，以致在A鏈和所述B鏈之間形成至少一個(gè)分子間二硫鍵，以使鏈連接在一起，并還原氧化的甲硫氨酸殘基以產(chǎn)生松弛素。在本申請(qǐng)的一個(gè)方面，松弛素為人松弛素，在特定的方面，松弛素為人松弛素1，其中B鏈為Met (0) 24RLXlB或人松弛素2，其中B鏈為Met (0) 25RLX2B。在另一個(gè)方面，含有一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸亞砜殘基的松弛素的B鏈表現(xiàn)出比不含 有甲硫氨酸亞砜殘基的松弛素的相應(yīng)B鏈更高的溶解性。尤其是，人Met (0)24-RLXlB和人Met (O) 25-RLX2B分別比RLXlB和RLX2B鏈具有更高的溶解性。甲硫氨酸亞砜類似物的更高溶解性，使得能夠易化鏈間結(jié)合反應(yīng)中松弛素和B鏈的合成以及純化和應(yīng)用，以產(chǎn)生生物活性松弛素。適當(dāng)?shù)?，鏈間結(jié)合反應(yīng)在室溫下在水溶液中于中性或期望地堿性pH下進(jìn)行。鏈間反應(yīng)可在存在氧化劑或還原劑的條件下進(jìn)行。B鏈的還原形式具有游離半胱氨酸基團(tuán)，其可用于催化鏈間反應(yīng)，并可以不需要單獨(dú)的氧化劑或還原劑。在另一個(gè)方面，A鏈以至少與B鏈化學(xué)計(jì)量相同并期望地以化學(xué)計(jì)量過量的水平出現(xiàn)，期望地，以摩爾計(jì)，高于I : I至3 1，并優(yōu)選I. 01至2 I。氧化的甲硫氨酸殘基可以利用任何適于在肽合成中還原且期望地對(duì)甲硫氨酸氧 化物殘基的還原特異的已知還原劑進(jìn)行還原。優(yōu)選碘化物，例如碘化銨。在用于實(shí)施鏈間反應(yīng)的另一種實(shí)施方式中，松弛素A鏈適當(dāng)?shù)匾噪p環(huán)形式存在，而甲硫氨酸氧化的松弛素B鏈以環(huán)狀形式或以完全還原形式存在。在另外的方面中，提供了合成生產(chǎn)的人松弛素I (其結(jié)構(gòu)在圖I中示出)，以及其藥用鹽、衍生物或前藥。在另外的方面，本申請(qǐng)公開了用于生產(chǎn)具有至少兩個(gè)肽鏈，A和B的胰島素型肽的方法，鏈A和鏈B通過至少一個(gè)二硫鍵連接并且鏈B具有至少一個(gè)氧化的甲硫氨酸殘基，該方法包括提供肽鏈A和鏈B，每種鏈含有至少一個(gè)半胱氨酸殘基并且鏈B包含氧化的甲硫氨酸殘基，使鏈A和鏈B在(一定)條件下結(jié)合，以致鏈A中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基和鏈B中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合以使鏈連接在一起，以產(chǎn)生具有氧化的甲硫氨酸殘基的胰島素型肽。在另外的實(shí)施方式中，本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了生物活性、合成的胰島素型多肽，其包含一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸亞砜殘基，例如具有在圖3中說明的序列的人Met (O)24-松弛素I和具有在圖4中說明的序列的人Met(O)25-松弛素2，以及其藥用鹽、衍生物、或前藥。在一方面，合成胰島素型多肽為松弛素。在另外的方面，合成胰島素型多肽為人松弛素。松弛素A鏈可以通過一系列方法生產(chǎn)，可選地包括在合成肽鏈中使用已知的保護(hù)基團(tuán)，以及鏈適當(dāng)?shù)亟?jīng)受環(huán)化反應(yīng)，其中形成一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，例如在圖9至14中所示出的。本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了合成嵌合多肽，包含合成松弛素的全部或部分多肽序列和非來源于松弛素的多肽序列。本申請(qǐng)還提供了合成多肽，包含合成松弛素的全部或部分多肽序列，優(yōu)選合成松弛素的B鏈，并可選包含一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸亞砜殘基。本文中描述的實(shí)施方式和方面的胰島素型肽類適用于治療應(yīng)用。本申請(qǐng)還提供了合成胰島素型多肽，包括人松弛素、和合成多肽，以及其藥用鹽、衍生物或前藥，其用于通過治療來處理人或動(dòng)物體的方法中，尤其是用于提供心臟保護(hù)、治療心臟疾病、纖維變性、過敏反應(yīng)、癌癥的一種或多種，以及傷口愈合和要求控制膠原更新的疾病治療中。在另外的方面，提供了一種藥物組合物，包含合成多肽，優(yōu)選合成松弛素，例如合成松弛素-I、合成松弛素-2和含有至少一個(gè)甲硫氨酸亞砜殘基的合成松弛素、以及藥用載體。
含有甲硫氨酸亞砜殘基的胰島素型多肽與其不具有亞砜的類似物相比更高的溶解性，提供了更大的配制靈活性，使得它們尤其適用于配制藥物組合物，并可提供增強(qiáng)的生物活性以及具有期望的性質(zhì)，以容許形成合成松弛素。適當(dāng)?shù)?，本文中表示為“Met (0)”的甲硫氨酸亞砜殘基，可利用本領(lǐng)域中已知的N-保護(hù)的Met (0)衍生物在肽鏈中在要求的位置處引入。


本發(fā)明和代表性合成路線結(jié)合附圖進(jìn)行說明，在附圖中圖I顯示合成人松弛素I (ShRLXl)的結(jié)構(gòu)(序列)；圖2顯示合成人松弛素2 (shRLX2)的結(jié)構(gòu)(序列); 圖3顯示B-Met (0) 24_合成人松弛素I (B_Met (0) 24ShRLXl)的結(jié)構(gòu)(序列)；圖4顯示B-Met (0) 25_合成人松弛素2 (B-Met (0) 25shRLX2)的結(jié)構(gòu)(序列)；圖5顯示DMSO氧化；還原的(線性)Met (O)24-人松弛素IB鏈[化合物9，Met(0)24-shRLXlB]、氧化的(環(huán)狀)Met (O)24-人松弛素IB鏈[化合物10，Met(0)24-shRLXlB]和氧化的(環(huán)狀)人松弛素IB鏈[化合物11，shRLXlB]的合成；圖6顯示還原的(線性)Met (O)25-人松弛素2B鏈[化合物13，Met (0)25_shRLX2B]、氧化的(環(huán)狀)Met (0)25-人松弛素2B鏈[化合物14，Met (0) 25-shRLX2B]和氧化的(環(huán)狀)人松弛素2B鏈[化合物15，shRLX2B]的DMSO氧化合成；圖7顯示碘氧化；氧化的(環(huán)狀)Met (O)24-人松弛素IB鏈[化合物10，Met(O) 24-shRLXlB]的合成；圖8顯示氧化的(環(huán)狀)Met (0) 25_人松弛素2B鏈[化合物14，Met (0) 25_shRLX2B]的合成；圖9顯示雙環(huán)RLXlA[化合物24]的合成，并應(yīng)用S-Mmt和Trt保護(hù)基團(tuán)。圖10顯示雙環(huán)人松弛素2鏈A[化合物28 ;雙環(huán)RLX2A]的合成，并應(yīng)用S-Mmt和Trt保護(hù)基團(tuán)；圖11顯示雙環(huán)人松弛素I鏈A[RLX1A鏈；化合物24 ;雙環(huán)RLX1A]的合成，并應(yīng)用S-Mmt和Trt保護(hù)基團(tuán)；圖12顯示雙環(huán)人松弛素2鏈A[化合物19 ;雙環(huán)RLX2A]的合成，并應(yīng)用S-Acm和Trt保護(hù)基團(tuán)；圖13顯示由線性鏈松弛素I鏈A的DMSO氧化合成雙環(huán)合成人松弛素I鏈A [化合物24、35-36 ;雙環(huán)RLX1A]的混合物；圖14顯示由線性鏈松弛素2鏈A的DMSO氧化對(duì)合成人松弛素2鏈A [化合物28、39-40 ;雙環(huán)RLX2A]的混合物的合成；圖15顯示用于合成RLXs A鏈和B鏈的三苯甲基和二苯甲基型樹脂的實(shí)例；圖16顯示由雙環(huán)RLXlA和還原的Met (0) 24-RLXlB鏈的鏈結(jié)合合成Met (0) 24_松弛素l[Met(0)24-RLXl ;化合物3]和松弛素I [RLX1 ;化合物I]；圖17顯示由雙環(huán)RLXlA和環(huán)狀RLXlB鏈以及少量的線性RLXlB鏈的鏈結(jié)合合成Met (O)24-松弛素 l[Met(0)24-RLXl]；圖18顯示由雙環(huán)RLX2A和還原的Met (0) 25-RLX2B的鏈結(jié)合合成Met (0) 25-RLX2]和 RLX2 ；圖19顯示由雙環(huán)RLX2A和環(huán)狀Met (0) 25-RLX2B以及少量的線性RLX2B鏈的鏈結(jié)合合成人松弛素2 [RLX2 ;化合物2]和Met (0) 25_人松弛素2 [Met (0) 25-RLX2]；[化合物4]；
具體實(shí)施例方式衍生物可包括如圖5至8中說明的以及如本文所提供的Fmoc-Met (0) -0H、Boc-Met(0)-OH 和 Trt-Met(0)-0H。制備包含Met (0)的RLXB可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^Met殘基的樹脂上氧化(on-resinoxidation)進(jìn)行,如在圖5和6中說明的。該方法適當(dāng)?shù)夭捎醚趸瘎┖腿軇┻M(jìn)行。在一個(gè)特定的方面，氧化劑包括過氧化氫和過氧2-氯苯甲酰(2-chlorobenzoyl peroxide)。適當(dāng)?shù)夭捎糜袡C(jī)溶劑如四氫呋喃。圖5和圖6說明合成Met(O)24-人松弛素IB鏈[Met (0) 24_hRLXlB]以及Met (0)25-人松弛素2B鏈[Met (0) 25-hRLX2B]相應(yīng)序列的實(shí)例。RLX28可在肽鏈的25位、在肽鏈的4位或如果要求在4位和25位兩個(gè)位置處包含Met (O)。僅在4位包含Met(O)的RLX2B與非氧化類似物相比也顯示出更高的溶解性。在一個(gè)方面，本申請(qǐng)使得能夠在松弛素中形成正確的分子內(nèi)和分子間二硫鍵。氧化半胱氨酸巰基(硫醇基，thiol group)以形成分子內(nèi)二硫鍵可利用任何適合的氧化劑實(shí)現(xiàn)，但優(yōu)選利用 DMSO (J. P. Tam, et al. J. Am. Chem. Soc. 1991，113,6657-6662)，尤其是在RLXA鏈和RLXB鏈未被保護(hù)的情況下，例如，如在圖5和6中所示的，并且在以被保護(hù)或部分保護(hù)的肽進(jìn)行氧化的情況下，如在圖7-12所示的，使用碘。適當(dāng)?shù)丶兓沙谒氐腁鏈和B鏈。半胱氨酸殘基經(jīng)受的用以形成分子內(nèi)二硫鍵的反應(yīng)，適當(dāng)?shù)匮趸磻?yīng)，可在單獨(dú)的A鏈和/或B鏈純化之前或之后進(jìn)行。在肽的合成中，如果要求，可采用已知的保護(hù)基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)可在形成二硫鍵之前除去，或可被保留并可與保護(hù)形式的肽形成二硫鍵。肽合成可采用的標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)，例如在Barany and Merrifield在“The Peptides”Vol. 2, Ed. Gross and Minehoffer, AcademicPress, pp. 233-240(1980)中公開，其公開內(nèi)容并入文中。A鏈和B鏈兩者之一或兩者的合成可在固體載體上進(jìn)行。可在將肽從樹脂上切割后或如果要求可與其從樹脂上切割的同時(shí)，在樹脂上進(jìn)行二硫鍵的形成。適當(dāng)?shù)?，可在肽組裝過程中采用任何巰基保護(hù)領(lǐng)域已知的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)半胱氨酸殘基的巰基。優(yōu)選使用4-甲氧基三苯甲基(4-methoxytrityl) (Mmt) (Barlos etal. Int J Pept Protein Res. 1996,47,148-53)、三苯甲基(Trt)以及乙酸氨基甲基(acetamidomethyl) (Acm)基團(tuán)。除了由于氧化甲硫氨酸殘基的存在而出乎意料地提高B鏈的溶解性以外，可以實(shí) 現(xiàn)A鏈和B鏈溶解性的進(jìn)一步提高。一旦分子內(nèi)二硫鍵已形成，環(huán)狀鏈的洗脫與相應(yīng)還原鏈相比在分析和制備HPLC上則更快，其他雜質(zhì)的洗脫也更快。具有分子內(nèi)二硫鍵(即環(huán)狀I(lǐng)NSL肽類)的A鏈和B鏈，與相應(yīng)的線性A鏈和B鏈相比，可獲得更高水平的純度。因此，可從環(huán)狀I(lǐng)NSL肽類中獲得比從單獨(dú)的A鏈和B鏈所獲得的更高純度。在特定方面，環(huán)狀I(lǐng)NSL肽類以高于95%、高于96%、高于97%、高于98%、和高于99%純度獲得。對(duì)于鏈A中分子內(nèi)二硫橋的選擇性形成，可使用任何正交巰基保護(hù)基團(tuán)對(duì)(orthogonal thiol protecting group pair)，但優(yōu)選 Trt/Mmt、Trt/Acm 和 Mmt/Acm 中的一個(gè)。制備RLXl和RLX2的雙環(huán)鏈A的實(shí)例在圖9_12中顯示。在使用Trt/Mmt對(duì)的情況下,S-Mmt基團(tuán)可被選擇性地除去,接著在釋放的巰基官能團(tuán)(thiol functions)之間通過用適當(dāng)?shù)难趸瘎?如DMSO或空氣)氧化形成二硫鍵,如圖9至10所示。S-Trt-基團(tuán)的去除以及釋放的巰基官能團(tuán)的氧化適當(dāng)?shù)貙?dǎo)致第二個(gè)二硫鍵的形成。優(yōu)選第二個(gè)二硫鍵通過用碘氧化去除S-Trt或S-Acm基團(tuán)而產(chǎn)生。通過利用用于A鏈的固相合成的2_氯三苯甲基(2-chlorotrtyl)樹脂(K. Barlos et al, Int. J. Pept.Protein Res. 1991，37，513-520)或具有相似酸敏感性的樹脂，S-Mmt官能通過弱酸解的選擇性去除，適當(dāng)?shù)嘏c受保護(hù)肽從樹脂上切割同時(shí)進(jìn)行。 對(duì)于氧化去除S-Trt-官能隨后形成二硫鍵，可以使用任何本領(lǐng)域中已知的氧化齊U，但優(yōu)選碘。在采用Trt/Acm對(duì)的情況下，可在存在S-Acm基團(tuán)的情況下，通過用適當(dāng)?shù)乃崛芤核峤馓幚黼臉渲x擇性地去除S-Trt基團(tuán)，酸溶液優(yōu)選三氟乙酸，在二氯甲烷中以10-100%濃度的三氟乙酸酸解(acidolytic)并適當(dāng)?shù)丶尤肭宄齽?凈化劑，scavenger),清除劑優(yōu)選以有效比例的硫醇、硅烷和水。然后適當(dāng)?shù)赝ㄟ^用本領(lǐng)域中已知的任何氧化劑，優(yōu)選用DMSO或空氣進(jìn)行氧化來實(shí)現(xiàn)第一個(gè)二硫鍵的形成。第一個(gè)二硫鍵的形成還可通過利用用于氧化去除(如果存在)S-Trt-官能的碘來實(shí)現(xiàn)。這可在受保護(hù)的肽從樹脂上切割之前、之中或之后發(fā)生(K. Barlos et al,Int. J. ofPeptide&Protein Research,1991,38,562-568)。適當(dāng)?shù)?，且不期望被任何理論約束，如果碘解(iodolysis)在低溫如0°C至15°C進(jìn)行，所期望的二硫鍵在存在S-Acm基團(tuán)的條件下選擇性地產(chǎn)生。適當(dāng)?shù)?，反?yīng)在親脂性(Iypophilic)溶劑中進(jìn)行，優(yōu)選氯化烴，例如二氯甲烷，和氟化醇如三氟乙醇，以及弱酸如乙酸和三氟乙酸，如圖11-12中說明的。在另外的實(shí)施方式中，第二個(gè)二硫鍵可通過在反應(yīng)混合物中加入極性組分如乙酸、甲醇、三氟乙醇、三氟乙酸或/和水在更加極性溶劑中碘解(iodolysis)而形成。氧化期間，優(yōu)選碘解(iodolysis)期間的溫度，不是關(guān)鍵性的，但優(yōu)選在5至25°C范圍內(nèi)進(jìn)行。適當(dāng)?shù)兀沙谒卦诠滔嘀泻铣?。在?yōu)選的實(shí)施方式中，可采用任何本領(lǐng)域中已知的樹脂，但優(yōu)選合成在三苯甲基型樹脂或連接物上進(jìn)行，例如，如圖15中所示的2-氯三苯甲基氯樹脂(K. Barlos, et al.，Tetrahedron Lett. , 1989, 30, 3943 ；K. Barlos, et al.，Tetrahedron Lett. ,1989, 30, 3947 ；K. Barlos, et al. , Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 1991,30, 590 ;K. Barlos, et al. , Int. J. Pept. Protein Res. ,1991,37,513 ；K. Barlos, et al.，Int. J. Pept. Protein Res.，1991，38，562)和圖 15 中的 4-甲基二苯甲基溴樹脂(K. Barloset al, Liebigs Annalen der Chemie(1989)，(10)，951-5)。已知采用高價(jià)低負(fù)載的聚苯乙烯-Peg-樹脂用于相應(yīng)的合成(E. Bullesbach andC. Schwabe. J. Biol. Chem. 266，17，10754-10761，1991)。然而，這些樹脂有半胱氨酸易被外消旋化的缺點(diǎn)。由于需要將酯化作用和鏈組裝期間由Cys-外消旋化形成的D-非對(duì)映異構(gòu)肽分離，這導(dǎo)致復(fù)雜化和顯著更高的成本。另外，合成肽的切割不能由已知的樹脂定量，導(dǎo)致更高的生產(chǎn)成本。在另外的實(shí)施方式中，提供了利用三苯甲基型樹脂或連接物，例如2-氯三苯甲基氯樹脂和4-甲基二苯甲基溴(4-methylbenzhydryl-bromide)樹脂,用于在固相合成中生產(chǎn)RLXlA或RLX2A的方法。本申請(qǐng)中，描述了使用這些樹脂用于制備RLXlA和RLX2A，這二者在其羧基-末端位置包含Cys殘基。有益地，這些樹脂高度優(yōu)于本領(lǐng)域中使用的其他樹脂，因?yàn)榻?jīng)觀察沒有或極少有半胱氨酸殘基外消旋化。適當(dāng)?shù)匦纬婶人狨?或鹽)物質(zhì)，而不是酸類物質(zhì)，用于與樹脂反應(yīng)，尤其是與三苯甲基和二苯甲基型樹脂反應(yīng)。另外，可實(shí)現(xiàn)從樹脂定量切割肽(Fujiwara et al, Chem. Pharm. Bull. 42，724，1994)。在形成松弛素中，A鏈和B鏈在有效形成分子間二硫鍵并提供所期望松弛素構(gòu)象的條件下結(jié)合以提供生物活性。一般而言，且不期望被任何理論約束，在形成鏈間-S-S-鍵時(shí)，包含分子內(nèi)二硫鍵的環(huán)肽類(參見圖5至8中的化合物10、11、14和15)比相應(yīng)線性肽反應(yīng)更快。環(huán)肽類將顯得像活化的環(huán)肽類一樣反應(yīng)，并以更簡(jiǎn)易的方式經(jīng)受與第二個(gè)鏈的鏈間連接。適當(dāng)?shù)兀淎的線性鏈肽類用例如DMS0、空氣或其他氧化劑氧化以產(chǎn)生環(huán)狀鏈A異 構(gòu)體的混合物，如在圖13和14中說明的。環(huán)狀松弛素鏈B可類似地由線性松弛素鏈B產(chǎn)生。松弛素可由雙環(huán)鏈A的異構(gòu)體的混合物或任何純雙環(huán)異構(gòu)體與環(huán)狀或線性形式的鏈B反應(yīng)形成。適當(dāng)?shù)?，鏈A和鏈B之間的反應(yīng)或相互作用在存在氧化劑或還原劑的條件下進(jìn)行。其中線性鏈A以及尤其線性鏈B存在時(shí)，雖然可能是優(yōu)選的但不要求加入另外的氧化劑或還原劑。在另外的實(shí)施方式中，鏈A和鏈B之間的反應(yīng)/相互作用在存在可優(yōu)選作為催化劑的還原劑的條件下進(jìn)行。不期望被任何理論約束，認(rèn)為二硫橋還原為游離巰基并建立環(huán)狀和鏈間連接肽的平衡，其導(dǎo)致熱力學(xué)更穩(wěn)定的產(chǎn)物，其為天然的RLX蛋白，如圖18和19中所示。作為還原劑，可使用任何有機(jī)或無機(jī)還原劑，但采用有機(jī)硫醇類，如還原的鏈A、還原的鏈B、還原型谷胱甘肽、半胱氨酸、苯硫酚、苯甲硫醚、吡啶-硫醇、3或5硝基吡啶-2-硫醇、節(jié)硫醇(benzyImercaptam)、二硫蘇糖醇。在另外實(shí)施方式中,優(yōu)先采用還原的鏈A、還原的鏈-B或其混合物作為催化劑。催化劑可在混合鏈A和鏈B之前、之后或之中加入到混合物中。催化劑可以以多種量加入以建立平衡混合物，但可以以基于A鏈和B鏈的量計(jì)算的1至5%摩爾比的量加入。在折疊反應(yīng)(其中A-連和B鏈結(jié)合)期間的溫度不是關(guān)鍵的，但可以是大約室溫，例如20至25°C。適當(dāng)?shù)兀軇樗芤夯蛩陀袡C(jī)溶劑和/或堿(bases)的混合物。用于鏈結(jié)合的溶液pH不是關(guān)鍵性的，但優(yōu)選堿性并期望為10至11。還原的鏈A在存在適當(dāng)氧化劑的條件下適當(dāng)?shù)嘏c鏈B結(jié)合，以促進(jìn)期望RLX的形成。適當(dāng)?shù)?，反?yīng)通過形成單環(huán)和雙環(huán)鏈A的混合物而進(jìn)行。在另外的實(shí)施方式中，可使用氧化的鏈A，因?yàn)橥ǔＴ摲磻?yīng)將比采用還原的鏈A更加快速。在一個(gè)方面，雙環(huán)和單環(huán)鏈A和鏈B的混合物反應(yīng)以提供天然RLXs。在另外的實(shí)施方式中，如圖16和18中所示，通過加入作為氧化劑以促進(jìn)反應(yīng)的DMS0，例如15% DMS0，使雙環(huán)鏈A與還原的鏈B結(jié)合。鏈A和鏈B的摩爾比可為I : I至2 1，或鏈A和鏈B的摩爾比可為I. I I摩爾。伴隨增加過量的鏈A，反應(yīng)速度提高。適當(dāng)過量的雙環(huán)和單環(huán)鏈A在純化期間回收，例如通過HPLC。其中不采用氧化劑如DMSO時(shí)，鏈A與鏈的摩爾比可至少為4 I。
在另外的實(shí)施方式中，其中松弛素A鏈或松弛素B鏈作為鏈間折疊反應(yīng)的副產(chǎn)物形成，副產(chǎn)物經(jīng)受氧化以提供氧化的甲硫氨酸類似物，其適當(dāng)?shù)啬軌蜃鳛榉磻?yīng)物參與進(jìn)一步的鏈間折疊反應(yīng)。適當(dāng)?shù)?，包含Met(O)的RLXs用還原劑如碘化銨還原成天然蛋白。碘化銨是有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)槠溥x擇性地使Met(O)還原成Met，而保持分子內(nèi)和分子間半胱氨酸橋完整。還原可在A鏈和/或B鏈純化之前或之后進(jìn)行。適當(dāng)?shù)?，反?yīng)幾乎是定量的。作為溶劑，可以使用水溶液或水與有機(jī)溶劑的混合物。RLX1A、RLX2A、RLX1B、RLX2B、RLX1、RLX2、Met (0) 24-RLXl 和 Met (0) 25-RLX2 的純化可通過HPLC利用任何適合溶劑而進(jìn)行，但可采用含有TFA、甲酸和乙酸的水和乙腈。純化的RLX1A、RLX2A、RLX1B、RLX2B、RLX1、RLX2、Met (0) 24-RLXl 和 Met (0) 25-RLX2可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^冷凍干燥或沉淀分離。如果必要，適當(dāng)?shù)乩秒x子交換樹脂如Dowex進(jìn)行脫鹽。治療應(yīng)用本文中制備的所有松弛素類似物已被測(cè)試并已被證明具有類似于重組制備的松弛素-2的那些(生物活性)的生物活性。根據(jù)本文中所描述的方法制備的松弛素化合物的治療應(yīng)用，包括治療膜腺炎；參見Cosen-Binker LI et al,World K. Gastroenterol. 2006,12 :1558-1568 ;先兆子癇(preeclampsia);參見 Mohaupt, M. Mol. Aspects Med. 2007,28:169-191 ;關(guān)節(jié)炎；參見 K. Santora et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007, 322 :887-893 ;子宮內(nèi)膜血管發(fā)生(endometrial angiogenesis) ；J. E. Girling et al, Angiogenesis, 2005 ；8 :89-99 ;急性心力衰竭；參見 S. L. Teichman et al, Heart fail. Rev. 2009 ； 14 :321-329 ；心臟過敏性反應(yīng)并作為一種新的抗過敏藥物；參見Daniele Bani, et al. , Curr AllergyAsthma Rep. 2006 Feb. ;6 (I) :14_9，16476189 ;通過降低腎間質(zhì)纖維化減慢腎病的發(fā)展；參見 S L Garber, YMirochnik, et al. ；Kidney Int. 2001Mar ；59 (3) :876-82,11231342 ；年齡相關(guān)的肺纖維化發(fā)展；參見 Chrishan S Samuel, et al.，F(xiàn)ASEB J. 2003Jan ；17(1)121-3，12424226 ;哮喘樣反應(yīng)；參見 D Bani, et al. , Endocrinology. 1997May ；138(5)1909-15,9112386 ;控制人乳腺癌細(xì)胞的生長；參見 M. Bigazzi et al, Cancer. 1992AugI ；70(3) :639-43,1320450 ;硬皮病的管理；R.K.Winkelmann，et al. , Semin Cutan MedSurg. 200IMar ；20(1) :27_37，11308134 ;以及焦慮、肥胖癥和涉及纖維變性疾病的治療；參見Emma T. van der Westhuizen et al,Drug Discovery Today,Volume 13,Issues 15-16,August 2008, Pages 640-651。本申請(qǐng)引用的公開特定治療應(yīng)用和其使用方法的所有參考文獻(xiàn)，均以其全部內(nèi)容通過參考并入文中。本申請(qǐng)通過下面的非-限制性實(shí)施例進(jìn)行說明。實(shí)施例實(shí)施例I人RLX1A、RLX2A、Met (0)24-RLXlB 和 Met (0)25-RLX2B 以及它們受保護(hù)的片段的固
相合成。一般過程。Al.加載2-氯三苯甲基氯(CTC)樹脂的制備；一般過程
CTC-Cl 樹脂(IOOg ;加載 I. 6mmol/g)裝入 2L肽反應(yīng)器中，并用 700ml DCM在 25°C溶脹(swell) 30min。將樹脂排空(drain),然后加入IOOmmol Fmoc-氨基酸和300mmol 二異丙基乙胺(diisopropylethylamine, DIEA)在500ml 二氯甲燒(DCM)中的溶液。混合物在氮?dú)庀略?5°C的溫度下攪拌2小時(shí)。然后，將保留在2-CTC樹脂上的活性位點(diǎn)通過加A IOml MeOH而包封(end-cap) I小時(shí)。將樹脂排空，并用400ml 二甲基甲酰胺(dimethylformamide, DMF)清洗2次。將樹脂排空，然后用500mL 25體積％的哌啶處理30分鐘兩次。然后樹脂用500ml DMF清洗四次。樹脂通過用500ml異丙醇(IPA)清洗3次消溶脹(de-swell,退溶脹)。干燥樹脂至恒重。樹脂上 加載70_95mmol使用的氨基酸。A2.加載 4_ 甲基二苯甲基溴(4-methylbenzhydryl bromide) (MBH)樹脂的制備，一般過程MBH-Br樹脂(100g ;190mmol)裝入2L肽反應(yīng)器中，并用700mlDCM在25 °C溶脹30min。將樹脂排空，然后加入Fmoc-氨基酸和DIEA在500ml DCM中的溶液?；旌衔镌诘?dú)庀略?5°C溫度下攪拌6小時(shí)。然后，將保留在MBH樹脂上的活性位點(diǎn)通過加入IOml MeOH包封24小時(shí)。將樹脂排空，并用400ml DMF清洗2次。將樹脂排空，然后用500mL25體積％的哌啶處理30分鐘兩次。然后樹脂用500ml DMF清洗四次。樹脂通過用500ml IPA清洗3次消溶脹。真空(15Torr，25°C)下干燥樹脂至恒重。樹脂上加載60-90mmol使用的氨基酸。B.固相分步合成，一般方案以I. Og各種氨基酸-CTC樹脂或MBH樹脂(按該實(shí)施例I的A部分所示加載)開始，在24°C進(jìn)行固相合成。對(duì)于整個(gè)合成，使用以下方案BI.樹脂溶脹將樹脂放置在15ml固相反應(yīng)器中，并用7mLN-甲基吡咯烷酮(NMP)處理兩次，然后排空。B2.氨基酸活化稱取Fmoc氨基酸(3. 0當(dāng)量)和I-羥基苯并三唑(4. 0當(dāng)量)，用2. 5倍體積的NMP溶解于反應(yīng)器中并冷卻至0°c。然后，加入二異丙基碳二亞胺(diisopropylcarbodiimide)(DIC) (3. 0當(dāng)量)，并將混合物攪拌15min。B3.偶聯(lián)將制得的B2溶液加入到BI反應(yīng)器中。燒瓶用I. 0倍體積的DCM清洗并加至反應(yīng)器中，然后將反應(yīng)器在25_30°C攪拌1-3小時(shí)。取樣用于Kaiser測(cè)試(Kaiser Test)以檢測(cè)反應(yīng)(是否)完成。如果偶聯(lián)反應(yīng)在3小時(shí)后未完成(陽性Kaiser測(cè)試)，則排空反應(yīng)器，并在新鮮活化氨基酸溶液中進(jìn)行再偶聯(lián)。完成偶聯(lián)反應(yīng)后，排空偶聯(lián)溶液(couplingsolution)并將樹脂用NMP清洗4次(每次清洗5vol)。B4.去除 Fmoc-基團(tuán)排空B3中獲得的樹脂，然后用5ml 25體積％的哌啶處理30min。然后樹脂用5mlNMP清洗三次。B5.肽鏈延伸完成每個(gè)氨基酸的引入后，重復(fù)步驟B2至B5直至完成肽鏈。對(duì)于單個(gè)氨基酸的引入，使用下列的Fmoc-氨基酸衍生物Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met (0)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Glu (tBu)-OH、pGlu、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-0H> Fmoc-Ser(Trt)-0H> Fmoc-Thr(tBu) -0H>Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-0H> Fmoc-Tyr(Clt) - 0H> Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Asn (Trt)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Gln (Trt) -0H> Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-0H> Fmoc-His(Trt)-0H> Fmoc-Cys(Trt)-0H> Fmoc-Cys(Mmt)-OH和 Fmoc-Cys(Acm)-OH 以及下列 Boc-氛基酸Boc-Arg (Pbf)-OH、Boc-Gln-OH、Boc-Gln(Trt) -OH、Boc-Lys (Boc)-OH和 Boc-Asp(tBu)-OH。C :在N-末端均包含來自CTC樹脂的Fmoc-或Boc-基團(tuán)的側(cè)鏈保護(hù)的RLXA和RLXB以及其受保護(hù)的片段的切割，一般過程如上面所描述的在B1-B5下獲得的樹脂結(jié)合肽或肽片段用5ml NMP清洗4次，用5ml IPA清洗3次，并最終用7ml DCM清洗5次，以除去任何NMP或其他堿性(basic)污染物。然后將樹脂冷卻到O°C。排空DCM，并將樹脂用IOml I %三氟乙酸(TFA)/DCM在5°C預(yù)冷卻的溶液處理兩次，在0°C攪拌20min然后過濾。然后樹脂用IOml DCM清洗三次。然后將吡啶加入到合并的濾液(1.3當(dāng)量，相對(duì)于TFA)中以中和TFA。然后將DCM切割溶液與 相對(duì)于DCM等體積的水合并。所得混合物在減壓下蒸餾以除去DCM(350Torr，在28°C下)。當(dāng)DCM除去時(shí)，肽或肽片段從水中析出。片段用水清洗，然后在15Torr真空下在30_35°C干燥。實(shí)施例2線性還原的RLX1A、RLX2A、Met (O) 24-RLXlB 和 Met (O) 25-RLX2B 以及它們的衍生物的脫保護(hù)。一般過程按以上在實(shí)施例I中所描述獲得的受保護(hù)的RLX-鏈A(0. Olmmol)用IOml的TFA/二硫蘇糖醇(DTT)/水(90 5 5)的混合物在5°C處理三小時(shí)，然后在15°C處理I小時(shí)。然后真空濃縮制得的溶液，并通過加入二異丙基醚使溶液沉淀，然后用IOml 二異丙基醚清洗三次。然后真空干燥(25°C，15Torr)獲得的固體至恒重。用以氧化甲硫氨酸基團(tuán)保護(hù)的RLX鏈B重復(fù)操作。實(shí)施例3單和雙環(huán)RLXlA、RLX2A、Met (0) 24-RLXlB 和 Met (0) 25-RLX2B 的脫保護(hù)。一般過程按以上在實(shí)施例I中所描述獲得的受保護(hù)的RLX (0. 005mmol)用5ml的TFA/三異丙基娃燒(triisopropylsilane,TIPS)/苯甲醚/水(91 : 4 : I : 4)的混合物在5°C處理三小時(shí)，然后在15°C處理I小時(shí)。然后真空濃縮制得的溶液，并通過加入二異丙基醚使溶液沉淀，然后用5ml 二異丙基醚清洗三次。然后真空干燥(25°C，15Torr)獲得的固體至恒重。對(duì)于每種鏈A和鏈B重復(fù)操作。實(shí)施例4脫保護(hù)的RLX1A、RLX2A、Met (0) 24-RLXlB 和 Met (0) 25-RLX2B 以及其單和雙環(huán)衍生物的純化，一般過程粗制脫保護(hù)的RLXlAMet (0) 24Met (0)25的三氟乙酸鹽溶解于25 %的乙腈水溶液中，并加載到半制備型10x25mm柱上。Lichrospher 100, RP-18,12微米(Merck);相六=乙腈中1% -TFAJg B =水中1% -TFA ;梯度=25% -A至65% -A的線性梯度30min。純化產(chǎn)率在30-80%之間變化。對(duì)于RLX2A、Met (0)24-RLXlB和Met (0)25-RLX2B以及其單和雙氧化的衍生物，重復(fù)操作。
實(shí)施例5受保護(hù)肽從CTC-樹脂的切割以及同時(shí)用碘單氧化。單氧化人松弛素A鏈和B鏈、Met (0)24-RLXlB和Met (0)25-RLXB以及它們的片段(圖7 (化合物16至17)、8 (化合物18-19)、11 (化合物29-30)、和12 (化合物31至32))的制備。按上面實(shí)施例I和實(shí)施例2中所描述獲得的N-和側(cè)鏈保護(hù)的樹脂-結(jié)合肽或肽片段用5ml NMP清洗4次，用5ml IPA清洗3次，并最后用7mlDCM清洗5次，以除去任何NMP或其他堿性污染物。然后樹脂冷卻到0°C。排空DCM，并將樹脂用在5°C預(yù)冷卻的IOmlDCM中的1% -TFA溶液處理兩次，其相對(duì)于樹脂結(jié)合肽含有10當(dāng)量的碘，在0°C攪拌5min然后過濾(代替1% TFA，使用相同體積的二氯甲烷/乙酸/三氟乙醇的混合物作為具有相似結(jié)果的溶劑)。然后樹脂用IOml DCM清洗三次。然后將合并的濾液在15°C加熱并另外攪拌30min。然后加入吡啶(1.3當(dāng)量，相對(duì)于TFA)以中和TFA。然后將DCM切割溶液與相對(duì)于DCM等體積的3% -硫代硫酸鈉或抗壞血酸水溶液合并以消除過量的碘。通過混合物的脫色對(duì)其進(jìn)行指示。所得混合物然后在減壓下蒸餾以除去DCM(350Torr在28°C下)。當(dāng) DCM除去時(shí)，受保護(hù)的肽或肽片段從水中析出。肽用水進(jìn)一步清洗，然后在15Torr真空下在30-35°C干燥。按在實(shí)施例2、3和4中所描述的進(jìn)行脫保護(hù)和純化?？偖a(chǎn)率在45-65%之間變化。對(duì)于每種物質(zhì)重復(fù)該過程。實(shí)施例6受保護(hù)的單環(huán)人RLXlA和RLX2A通過DMSO氧化的合成。一般過程Al. Cys (Mmt)選擇性去除。部分脫保護(hù)RLX1A、RLX2A(圖9_化合物21-22和圖10化合物25至26)按上面所描述的在B1-B5下獲得的包含兩個(gè)由Trt保護(hù)的Cys殘基以及兩個(gè)用Mmt保護(hù)的Cys殘基的N-和側(cè)鏈保護(hù)的樹脂-結(jié)合肽片段RLXA (0. 005mmol)，用5ml NMP清洗4次，用5ml IPA清洗3次，并最后用7ml DCM清洗5次，以除去任何的NMP或其他堿性污染物。然后樹脂冷卻到0°C。排空DCM，并將樹脂用在5°C預(yù)冷卻的25ml 1.5%TFA(在圖中，這為I. 1% )處理四次，該溶液相對(duì)于樹脂結(jié)合肽含有10當(dāng)量三乙基硅烷(triethylsilane),在5°C攪拌5min并過濾。合并的濾液然后在15°C另外攪拌兩小時(shí)。然后加入吡啶(1.3當(dāng)量，相對(duì)于TFA)以中和TFA。然后將DCM切割溶液與相對(duì)于DCM與等體積的水合并。制得的混合物然后在減壓條件下蒸餾以除去DCM(350Torr在28°C)。當(dāng)除去DCM時(shí)，在S-Mmt殘基處部分脫保護(hù)的肽或肽片段從水中析出。片段用水清洗，然后在15Torr真空下在30_35°C干燥。重復(fù)該過程以產(chǎn)生RLX2A。A2.從游離半胱氨酸至單環(huán)的DMSO氧化從以上所描述的Al操作獲得的肽類(0. 005mmol)，各自溶解于5mlDMS0中并在25°C攪拌24小時(shí)。然后加入5ml水并另外攪拌30min。析出的單環(huán)受保護(hù)肽用水清洗五次，然后在真空中干燥至恒重(30°C，15Torr)。按在實(shí)施例2、3和4中所描述的進(jìn)行脫保護(hù)和純化?？偖a(chǎn)率在50-70%之間變化。該操作針對(duì)RLXlA和RLX2A的生產(chǎn)進(jìn)行說明，并也可被用于選擇性地去除在RLXlB和RLX2B半胱氨酸殘基上的保護(hù)基團(tuán)。實(shí)施例7雙環(huán)人RLXlA和RLX2A以及它們的衍生物的合成。一般過程
Al.通過碘氧化受保護(hù)的單環(huán)RLX1A、RLX2A，其中兩個(gè)Cys殘基為側(cè)鏈Trt-保護(hù)的(圖9化合物22至23和圖10化合物26至27)。具有兩個(gè)用Trt保護(hù)的Cys殘基的受保護(hù)的單環(huán)RLXlA(0. 005mmol)，溶解于5mlDCM/TFE(7 : 3)中。溶液在5°C冷卻，然后加入5ml DCM中10當(dāng)量的碘，并將混合物攪拌I小時(shí)。然后DCM溶液與相對(duì)于DCM其5倍體積的3% -硫代硫酸鈉或抗壞血酸水溶液合并以消除過量的碘。通過混合物的脫色對(duì)其進(jìn)行指示。制得的混合物在減壓條件下蒸餾以除去DCM(350Torr在28°C )。當(dāng)DCM除去時(shí)，受保護(hù)的肽或肽片段從水中析出。析出的受保護(hù)的肽隨后用水清洗，并在15Torr真空下在30_35°C干燥。按在實(shí)施例2、3和4中所描述的進(jìn)行脫保護(hù)和純化。用RLX2A重復(fù)該過程。總產(chǎn)率在50-80%之間變化。A2.通過碘氧化受保護(hù)的單環(huán)RLX1A、RLX2A，其中兩個(gè)Cys殘基為Acm保護(hù)的(圖11化合物30-23和圖12化合物32至27)。具有兩個(gè)用Acm保護(hù)的Cys殘基的受保護(hù)的單環(huán)RLXlA(0. 005mmol),溶解于5mlAcOH/三氟乙醇(TFE) (5 5)中。溶液在5°C冷卻，然后加入5ml TFE中的20當(dāng)量的碘， 并將混合物攪拌I小時(shí)。然后溶液與其5倍體積的3%-硫代硫酸鈉或抗壞血酸水溶液合并以消除過量的碘。通過混合物的脫色對(duì)其進(jìn)行指示。然后析出的受保護(hù)的肽用水清洗，并在15Torr真空下在30_35°C干燥。按在實(shí)施例2、3和4中所描述的進(jìn)行脫保護(hù)和純化。用RLX2A重復(fù)該過程?？偖a(chǎn)率在50-60%之間變化。A3.通過DMSO氧化脫保護(hù)的單環(huán)人RLXlA和RLX2A，一般過程單環(huán)脫保護(hù)的RLXlA或RLX2A(0. 005mmol)溶解于4ml pH = 4的醋酸銨緩沖液中。然后，加入Iml DMS0，并將混合物在15°C攪拌24h。從制得的溶液中，純化后按實(shí)施例4中所描述的分離雙環(huán)肽?？偖a(chǎn)率在65-85%之間變化。A4.通過DMSO氧化線性脫保護(hù)的RLXAl和RLXA2，一般過程(圖13化合物34至24,35和36以及圖14化合物38至28、39和40)。脫保護(hù)的線性RLXlA(0. 005mmol)溶解于4ml pH = 4的醋酸銨緩沖液中。然后，加入Iml DMSO,并將混合物在15°C攪拌24h。從制得的溶液中，純化后按實(shí)施例4中所描述的分離雙環(huán)肽。用RLX2A重復(fù)該過程?？偖a(chǎn)率在65-80%之間變化。實(shí)施例8單環(huán)人Met (0) 24-RLXlB和Met (0) 25-RLX2B的合成，一般過程(圖5化合物9至10和圖6化合物13至14)脫保護(hù)的線性人Met(O) 24_RLX1B(0. 005mmol)溶解于4ml pH = 10. 5的甘氨酸鈉緩沖液中。然后，加入Iml DMS0，并將混合物在15°C攪拌24h。純化后從制得的溶液中按實(shí)施例4中所描述的方法分離環(huán)狀肽。用Met25(0)-RLX2B重復(fù)操作。三次純化的產(chǎn)率平均為45%。實(shí)施例9由線性RLXlA 和線性 Met(O) 24_RLX1B 的結(jié)合合成人 B-Met24 (0)-RLXlMet (0)24，以及由線性RLX2A和線性Met (0)25-RLX2B的結(jié)合合成人B-Met (0)25-RLX2 ;一般過程脫保護(hù)的線性人RLXlA (0. 006mmol)和 Met (0) 24_RLX1B Met(O)25 (0. 005mmol)溶解于4ml pH = 10. 5的甘氨酸鈉緩沖液/6-N鹽酸胍(4 I)中。然后，在12小時(shí)期間加入Iml DMS0，并將混合物在15°C另外攪拌4h。純化后利用實(shí)施例4中所描述的方法從制得的溶液中分離Met (O) 24-RLX IMet (0)25。由線性RLX2A和Met (0) 25-RLX2B開始利用相同操作制備 B-Met(0)25-RLX2。三輪的產(chǎn)率平均為B_Met (0)25-RLXl 37%和 B-Met (0)24-RLX2 35%。實(shí)施例10由線性RLXlA和環(huán)狀Met(O) 24_RLX1B的結(jié)合合成人B-Met24 (0)-RLXl，以及由線性RLX2A 和環(huán)狀 Met (0) 25-RLX2B 的結(jié)合合成人 B-Met (0) 25-RLXl ;一般過程脫保護(hù)的線性人RLXlA(0. 005mmol)和環(huán)狀 Met (0)24-RLXlBMet (0)25(0. 005mmol)溶解于4ml pH 10. 5的甘氨酸鈉緩沖液/6-N鹽酸胍(4 I)中，并在15°C攪拌五小時(shí)。然后，在12小時(shí)期間加入Iml DMS0，并將混合物在15°C另外攪拌4h。純化后從制得的溶液中利用實(shí)施例4中所描述的方法分離Met(0)24-RLX1。重復(fù)操作以由線性RLX2A和環(huán)狀Met(0)25-RLX2B的結(jié)合制備人B-Met (0) 25-RLX2。三次純化的產(chǎn)率平均為基于應(yīng)用的鏈B，B-Met(O) 25-RLXl 32%和 B-Met (0)24-RLX2 67%。
實(shí)施例U由單環(huán)RLNlA或RLN2A和線性Met(O) 24_RLN1B以及Met25 (0)-RLN2B的結(jié)合合成人B-Met24 (0) -RLNl 和 B-Met25 (0)-RLN2 般過程脫保護(hù)的單環(huán)人線性RLNlA 或 RLN2A(0. 006mmol)和 Met24(O)-RLNlB 或Met25 (0) -RLN2B (0. 005mmol)溶解于 4ml pH = 10. 5 的甘氨酸鈉緩沖液/6-N 鹽酸胍(4 I)中。然后，在12小時(shí)期間加入lmlDMSO，并將混合物在15°C另外攪拌4h。純化后從制得的溶液中利用實(shí)施例4中所描述的方法分離Met24 (0) -RLNlB或Met25 (0) -RLN2B。三輪的平均產(chǎn)率為B-Met24(O)-RLNl32%和 B-Met25(O)-RLN2 36%。實(shí)施例12由單環(huán)RLNlA或RLN2A和環(huán)狀Met24 (O)-RLNlB以及Met25 (0)-RLN2B的結(jié)合合成人B-Met24 (0) -RLNl 和 B-Met25 (0)-RLN2 般過程脫保護(hù)的單環(huán)人RLNlA 或 RLN2A(0. 006mmol)和環(huán)狀 Met24(O)-RLNlB 或Met25 (0) -RLN2B (0. 005mmol)溶解于 4ml pH = 10. 5 的甘氨酸鈉緩沖液/6-N 鹽酸胍(4 I)中。然后，在12小時(shí)期間加入lmlDMSO，并將混合物在15°C另外攪拌4h。純化后從制得的溶液中利用實(shí)施例4中所描述的方法分離Met24 (0) -RLNlB或Met25 (0) -RLN2B。三輪的平均產(chǎn)率為B-Met24(O)-RLNl35%和 B-Met25(O)-RLN2 38%。實(shí)施例13由雙環(huán)RLXl 和線性 Met(O) 24_RLX1B 的結(jié)合合成人 Met (0) 24-RLXlMet (0) 25-RLX2，以及由雙環(huán)RLX2和線性Met(O) 25-RLX2B的結(jié)合合成人Met (0) 25-RLX2 般過程(圖16):脫保護(hù)的雙環(huán)RLXlA (0. 005mmol)和線性 Met (0)24_RLX1B Met(O)25 (0. ImmoI)溶解于4ml pH 10. 5的甘氨酸鈉緩沖液/6-N鹽酸胍(4 I)中，并在15°C攪拌I小時(shí)。然后，在12小時(shí)期間加入Iml DMSO,并將混合物在24°C另外攪拌4h。純化后從制得的溶液中利用實(shí)施例4中所描述的方法分離Met (0) 25-RLXl。重復(fù)操作以由雙環(huán)RLX2和線性Met (0) 25-RLX2B的結(jié)合制備人Met(O) 25-RLX2。三次純化的產(chǎn)率平均為基于應(yīng)用的鏈B，B-Met (0) 25-RLXl64% 和 B-Met(0)24-RLX2 76%。實(shí)施例14由雙環(huán)RLXlA和環(huán)狀Met(O) 24_RLX1B的結(jié)合合成人B-Met (O)24RLXl,以及由雙環(huán)RLX2A和環(huán)狀Met (0) 25RLX2B的結(jié)合合成人B-Met (0) 25RLX2 般過程(圖17):
脫保護(hù)的雙環(huán)RLX1A(0. Ollmmol)和環(huán)狀 Met (0) 24_RLX1B 或Met (0)25-RLX2B(0. Olmmol)溶解于 15ml pH 10. 5 的甘氨酸鈉/6_N 鹽酸胍緩沖液(4 I)中。然后加入0. OOlmmol在3ml THF中的苯硫酚，并在15°C攪拌24小時(shí)。純化后從制得的溶液中利用實(shí)施例4中所描述的方法分離Met (0)24_RLX1或Met(O) 25-RLX2。重復(fù)操作以由雙環(huán)RLX2A和環(huán)狀Met (0) 25RLX2B制備Met (0) 25-RLX2B。三次純化的產(chǎn)率平均為基于應(yīng)用的鏈 B，B-Met (0) 24RLXl 68 %，B-Met (0) 25RLX2 72 %。實(shí)施例15
通過用碘化銨分別還原B-Met (0) 24RLXl、B-Met (0) 25RLX2、Met (0) 24RLXlB'Met (0) 25RLX2B、環(huán)狀 Met (0) 24RLXlB 和環(huán)狀 Met (0) 25RLX2B 合成人 RLX1、RLX2、RLX1B、RLX2B、環(huán)狀RLXlB和環(huán)狀RLX2B，一般過程該過程利用每種含Met (0)的 RLX1、RLX2、RLX1B、RLX2B、環(huán)狀 RLXlB 和環(huán)狀 RLX2B的肽或蛋白類似物進(jìn)行。0. Olmmol Met(O)類似物溶解于25ml水中的90%-TFA。然后，加入Immol的碘化銨，且混合物在24°C攪拌15min。純化后從制得的溶液中通過HPLC利用實(shí)施例4中所描述的方法分離期望的產(chǎn)物(RLX1、RLX2、RLX1B、RLX2B、環(huán)狀RLX1B、環(huán)狀RLX2B) o 三次純化的產(chǎn)率平均為RLXl 91%, RLX2 89%, RLXlB 62%, RLX2B 64%、環(huán)狀RLXlB 88%和環(huán)狀 RLX2B 81%。雖然本文中提供了多種示例性實(shí)施方式、方面和變體，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員能夠識(shí)別這些實(shí)施方式、方面和變體的某些改變、變換、添加、和組合以及某些亞-組合。所附權(quán)利要求應(yīng)當(dāng)被理解為包括實(shí)施方式、方面和變體的所有這樣的改變、變換、添加、和組合以及某些亞-組合，它們落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。貫穿本申請(qǐng)所引用的所有文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容以其整體并入本文中供參考。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)具有至少兩條肽鏈，A和B，的胰島素型肽的方法， 鏈A和鏈B通過至少一個(gè)二硫鍵連接，所述方法包括 提供肽鏈A和鏈B，其中，每條鏈包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基且每條鏈可選地具有分子內(nèi)二硫鍵，并且鏈B包含氧化的甲硫氨酸殘基； 在使得形成至少一個(gè)分子間二硫鍵的條件下，使鏈A和鏈B結(jié)合，以使鏈A和鏈B連接在一起；以及 使所述氧化的甲硫氨酸殘基還原以產(chǎn)生所述胰島素型肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述胰島素型肽為松弛素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述松弛素為松弛素I或松弛素2，并且鏈A為松弛素A鏈且鏈B為松弛素B鏈,并且其中,在與鏈A結(jié)合后 鏈B的至少一部分不具有分子內(nèi)二硫鍵；或 存在還原劑，以還原鏈B的分子內(nèi)二硫鍵。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，存在還原劑且所述還原劑選自具有游離半胱氨酸殘基的鏈A和具有游離半胱氨酸殘基的鏈B。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述還原劑包含具有游離半胱氨酸殘基的鏈B。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，鏈B具有游離半胱氨酸基團(tuán)且鏈A具有分子內(nèi)二硫鍵。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述肽為選自松弛素I和松弛素2的松弛素，并且鏈A具有兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，且鏈B的至少一部分不具有分子內(nèi)二硫鍵。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述松弛素為人松弛素1，且所述B鏈為Met (O) 24RLXlB或人松弛素2，且所述B鏈為Met (0) 25RLX2B。
9.一種用于生產(chǎn)松弛素的方法，包括 提供具有至少一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的松弛素A鏈，以及松弛素B鏈，其中所述B鏈的至少一個(gè)甲硫氨酸殘基被氧化，所述B鏈可選地包含分子內(nèi)二硫鍵； 在使得所述A鏈和所述B鏈之間形成至少一個(gè)分子間二硫鍵的條件下，使所述A鏈和所述B鏈結(jié)合，以將所述鏈連接在一起；以及 使所述氧化的甲硫氨酸殘基還原，以產(chǎn)生所述松弛素。
10.一種合成生產(chǎn)的、分離的人松弛素1，和其藥用鹽、衍生物或前藥。
11.一種用于生產(chǎn)具有至少兩條肽鏈，A和B，的胰島素型肽的方法，鏈A和鏈B通過至少一個(gè)二硫鍵連接并且鏈B具有至少一個(gè)氧化的甲硫氨酸殘基，所述方法包括 提供肽鏈A和鏈B，每條鏈包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基并且鏈B包含氧化的甲硫氨酸殘基; 在使得鏈A中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基和鏈B中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合的條件下，使鏈A和鏈B結(jié)合，以使所述鏈連接在一起，從而產(chǎn)生具有氧化的甲硫氨酸殘基的所述胰島素型肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述包含甲硫氨酸氧化物的松弛素，通過使以下鏈結(jié)合 線性松弛素A鏈和線性松弛素B鏈； 線性松弛素A鏈和環(huán)狀松弛素B鏈；或單環(huán)或雙環(huán)松弛素A鏈和線性松弛素B鏈；以及 氧化得到的產(chǎn)物而產(chǎn)生。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述氧化利用DMSO、空氣或過氧化氫進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述包含甲硫氨酸氧化物的松弛素通過在還原劑的存在下使單環(huán)或雙環(huán)松弛素A鏈和環(huán)狀松弛素B鏈結(jié)合而產(chǎn)生。
15.一種包含一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸亞砜殘基的生物活性的、合成松弛素，以及其藥用鹽、衍生物、或前藥。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的合成人松弛素，其選自 i)具有在圖3中圖示說明的序列的人Met(O)24-松弛素I; ii)具有在圖4中圖示說明的序列的人Met(O)25-松弛素2 ;以及 或ii)的藥用鹽、衍生物或前藥。
17.一種合成的嵌合多肽，包括 i)合成松弛素I、合成松弛素2，在權(quán)利要求15或16中限定的、或通過權(quán)利要求I至9和11至14中任一項(xiàng)中限定的方法而生產(chǎn)的合成松弛素的全部或部分多肽序列；以及 ii)源自不同松弛素或并非源自松弛素的多肽序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的合成的嵌合多肽，包含i)RLXlA和RLX2B或Met(O) RLX2B或 ii)RLX2A 和 RLX IB 或 Met(0)RLX2B。
19.一種用于生產(chǎn)松弛素A鏈的方法，包括將半胱氨酸衍生物酯化到三苯甲基或二苯甲基類型的樹脂或連接物上并在固相合成中依序使松弛素A的可選保護(hù)的殘基反應(yīng)。
20.根據(jù)權(quán)利要求I至9、11至14和19中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述A鏈或B鏈中的所述甲硫氨酸氧化物殘基利用N-保護(hù)的甲硫氨酸氧化物衍生物引入，或?qū)⒓琢虬彼釟埢尤氲剿鲭逆溨?，然后氧化成甲硫氨酸氧化物殘基?br> 21.一種分離的合成多肽、以及其藥用鹽、衍生物或前藥，所述分離的合成多肽包含合成松弛素A鏈、合成松弛素B鏈、合成松弛素A鏈的甲硫氨酸氧化物類似物、合成松弛素B鏈的甲硫氨酸氧化物類似物的全部或部分多肽序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的分離的合成多肽，選自RLX1A、RLX2A、RLX1B、RLX2B、Met (0) 24-RLXlB 和 Met (0) 25-RLX2B。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的分離的合成多肽，其中，所述A鏈具有I或2個(gè)分子內(nèi)硫鍵并且所述B鏈具有I個(gè)分子內(nèi)硫鍵。
24.在權(quán)利要求10、權(quán)利要求15-18以及權(quán)利要求21中任一項(xiàng)中限定的或通過權(quán)利要求I至9和11至14以及權(quán)利要求19和20中任一項(xiàng)中限定的方法而生產(chǎn)的合成胰島素型多肽，以及其藥用鹽、衍生物或前藥，其用于通過治療來處理人或動(dòng)物體的方法中。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多肽，用于以下中的一種或多種中提供心臟保護(hù)、治療心臟疾病、纖維變性、過敏反應(yīng)、癌癥，以及用于傷口愈合中，和用于要求控制膠原更新的病癥治療中。
26.—種藥物組合物，包含在權(quán)利要求10、權(quán)利要求15至18和權(quán)利要求21至24中任一項(xiàng)中限定的或通過權(quán)利要求I至9和11至14以及權(quán)利要求19和20中任一項(xiàng)中限定的方法而生產(chǎn)的合成多肽，以及藥用載體。
全文摘要
一種用于生產(chǎn)胰島素型肽如松弛素的方法，包括氧化具有半胱氨酸殘基的B鏈上的甲硫氨酸殘基，以及使B鏈與具有半胱氨酸殘基的A鏈結(jié)合以形成具有分子間二硫鍵和生物活性的肽。公開了新的合成松弛素1和甲硫氨酸氧化的松弛素以及溶解性提高的Met(O)B鏈。
文檔編號(hào)C07K14/64GK102647996SQ201080034142
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日
發(fā)明者科爾奧梅尼斯·K·巴洛斯 申請(qǐng)人:帕特拉斯化學(xué)與生物制藥實(shí)驗(yàn)室