專利名稱:貽貝酶解多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種貽貝酶解多肽,本發(fā)明還涉及該貽貝酶解多肽的制備方法及其在抗前列腺癌上的應(yīng)用。
背景技術(shù):
多肽在生物體內(nèi)可作為神經(jīng)遞質(zhì)、白細(xì)胞介素和細(xì)胞生長因子等活性物質(zhì),具有維持生物體生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和新陳代謝等活性功能。現(xiàn)有研究表明,來源于生物體的多肽具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗衰老、抗高血壓等活性功能,尤其是抗腫瘤活性已受到各國研究人員的關(guān)注。目前,有關(guān)天然肽和合成肽的抗腫瘤活性已有大量報道,并有部分多肽作為抗腫瘤藥物已應(yīng)用于臨床;食物蛋白來源的多肽對于其抗菌、抗氧化、抗高血壓活性研究頗多,而對其抗腫瘤活性的相關(guān)報道較少。海洋生物蛋白種類繁多,來源廣泛,作為活性肽的一個重要來源,已受到越來越多的關(guān)注。貽貝作為海洋生物的一個重要組成部分,隸屬于海洋軟體動物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)貽貝目(Mytiloida),在我國北方稱海紅,江浙稱為淡菜,富產(chǎn)于浙江嵊泗周圍海域。貽貝富含粗蛋白、脂肪和碳水化合物,此外還含有鈣、磷、鐵、維生素等多種微量元素。已有研究表明,貽貝提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝、降血壓、降血脂、提高免疫力等活性功能,可參考專利號為ZL200510110096.8的中國發(fā)明專利《厚殼貽貝的提取物、制造方法及其用途》(授權(quán)公告號CN100467030C),該專利公開了厚殼貽貝的提取物在流感上的應(yīng)用。類似的還可以參考專利號為ZL200510024391. 1的中國發(fā)明專利《一種可提高免疫力功能的厚殼貽貝提取物》(授權(quán)公告號為CN100486593C);申請?zhí)枮?00910101136. O的中國發(fā)明專利申請公開《厚殼貽貝脂溶性提取物及其制備方法和用途》(公開號CN101606951A)。 但至今未見有關(guān)貽貝酶解產(chǎn)物對前列腺癌細(xì)胞作用的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種貽貝酶解多肽。本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是提供一種貽貝酶解多肽的制備方法。本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是提供一種貽貝酶解多肽的應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種貽貝酶解多肽,其特征在于包含如下氨基酸序列Asp Leu Tyr。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種貽貝酶解多肽,其特征在于采用如下步驟制備①取貽貝肉,制成均漿,調(diào)節(jié)PH值9. 5 10,料液比為1 2 1 3,添加堿性蛋白酶,加酶量為1500 2000U/g,酶解時間為6 8小時,酶解溫度為45 50°C,滅酶后離心,取上層清液;②將上述的清液經(jīng)過超過濾,收集分子量I以下的水解液,濃縮并冷凍干燥;
③DEAE-kpharoseFF離子柱交換柱色譜分離,將步驟②中的冷凍干燥后產(chǎn)物通過DEAE-kpharoseFF離子柱交換柱,0. 1 Imol/LNaCL梯度洗脫,洗脫速度1 1. 5mL/ min,蛋白檢測儀280nm進(jìn)行檢測,對各洗脫峰分別進(jìn)行收集,濃縮后冷凍干燥,將干燥后得到的各個峰組分采用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實驗,進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰,并對該峰大量收集,濃縮并冷凍干燥;④采用kphadex G_25凝膠柱色譜分離,將步驟③所得的具有最高抗腫瘤活性的冷凍干燥后產(chǎn)物過kphadex G-25凝膠柱,流動相為蒸餾水,流速為1. 5 2mL/min,蛋白檢測儀^Onm進(jìn)行檢測,對各洗脫峰分別進(jìn)行收集,濃縮后冷凍干燥并用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實驗;⑤高效液相色譜純化,將步驟④中得到的具有最高抗腫瘤活性冷凍干燥后產(chǎn)后過反相高效液相柱,色譜柱為hrbax SB C18(250mmX9. 4mm, 5 μ m);柱溫為室溫;流動相為乙腈和水,梯度洗脫0 20min,乙腈濃從0%變化到95%,洗脫速度2. 5 3. OmL/min,紫外檢測波長280nm。所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌上的應(yīng)用。進(jìn)一步,所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用;所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌PC-3細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的優(yōu)點在于采用最佳的蛋白酶和優(yōu)選的工藝對貽貝進(jìn)行酶解純化,將所得的目標(biāo)肽應(yīng)用于抗前列腺癌細(xì)胞上產(chǎn)生了很強的細(xì)胞抑制增殖作用, 為抗前列腺癌提供了一條可行性研究途徑;整體工藝簡單,投入較少,易于推廣應(yīng)用。
圖1為各種蛋白酶的酶解物對DU-145細(xì)胞增殖抑制率的柱狀圖。圖2為堿性蛋白酶不同分子量酶解物對DU-145細(xì)胞增殖抑制率的柱狀圖。圖3為堿性蛋白酶分子量I以下組分的DEAE Sepharose FF層析圖譜。圖4為圖3中峰2的kphadex G-25凝膠層析圖譜。
圖5為圖4中峰2-2的RT-HPLC圖譜。圖6為圖5中目標(biāo)肽的RT-HPLC圖譜。圖7為正常DU-145細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖8為貽貝多肽作用24h后DU-145細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖9為貽貝多肽作用4 后DU-145細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖10為正常PC-3細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖11為貽貝多肽作用24h后PC-3細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖12為貽貝多肽作用4 后PC-3細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。1 材料1. 1動物貽貝(Mytilus edulis)購自舟山市場(經(jīng)浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授鑒定),去殼后,-20°C冷藏備用。
1. 2細(xì)胞株人前列腺癌細(xì)胞DU-145和PC-3均購自中科院上海細(xì)胞庫。1.3主要試劑胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、萄聚糖凝膠 SephadexG-25和DEAE SepharoseFF陰離子交換柱均購自于北京亞太恒信生物科技有限公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司;F12粉末培養(yǎng)基和MTT均購自美國SIGMA 公司;二甲基亞砜購自美國AMRESC0公司;乙腈購自寧波海曙恒隆實驗器材有限公司;其余試劑均為分析純。1. 4主要儀器BSA124S型電子天平(德國,Sartorius AG公司);DS-1型高速組織搗碎機(jī)(上海標(biāo)本模型廠);CF16RXII高速冷凍離心機(jī)(日立HITACHI公司);自動部分收集器(BSZ-40-LCD)、蛋白檢測儀(HD-21-88)(上海琪特分析儀器有限公司);SSW型微電腦電熱恒溫槽(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);依利特P1201型高效液相色譜儀 (大連依利特分析儀器有限公司);MSC300超濾杯(超濾膜3KDa和5KDa)(上海摩速科學(xué)器材有限公司)。ZHJH-C1209C型超凈工作臺(上海智誠分析儀器制造有限公司)forma 3111型(X)2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。2 方法2. 1酶解工藝流程選用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶4種蛋白酶分別對貽貝肉進(jìn)行酶解,各種蛋白酶的酶解條件見表1,酶解過程依次如下貽貝洗凈;去殼取肉;勻漿;0. 5mol/LNa0H和0. lmol/LHCl溶液調(diào)PH值;加酶水解;滅酶(90°C,加熱15min);離心(5000r/min,20min);取上清液;冷凍干燥;MTT法抗腫瘤活性初步測定。表1幾種蛋白酶的酶解條件
酵種類料液比(W/V)PH溫度(°C)加酶量(U/g)酶解時間(h)
Trypsin1:295020008Alcalase1:2105015008 Papain1:36.55520008
Pepsin_L3_4^_45_2000_8_2. 2細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌DU-145和PC-3細(xì)胞(原購自中科院上海細(xì)胞庫,由本實驗室傳代保存),用含10%小牛血清的F12完全培養(yǎng)基于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。2. 3細(xì)胞增殖抑制率的測定采用MTT法進(jìn)行檢測。配制PBS溶液(pH值為7. 2) 和一定濃度的酶解多肽溶液。取對數(shù)生長期的前列腺癌細(xì)胞制成懸液,接種至96孔板,每孔200 μ L,于5% CO2, 37°C貼壁4h,然后分別加入酶解多肽溶液,每個濃度設(shè)3個平行孔,同時設(shè)不加藥對照組,置5% CO2, 37°C培養(yǎng)箱中孵育,培養(yǎng)結(jié)束加入180 μ LMTT和20 μ L PBS 繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄96孔板的液體,加入150 μ L的DMS0,充分混合。置酶聯(lián)免疫檢測儀在 490nm測吸光度,計算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)(IR),按下列公式計算。IR=[(對照組A值-藥物組A值)/對照組A值]X 100 %2. 4抗腫瘤活性肽的初步分離取蛋白酶水解貽貝肉得到的上清液,分別用截留分子量為IOKjK和;3K的超濾膜進(jìn)行超濾,得到分子量為IOK以上、5K-10KJK-5K和I以下的水解液。冷凍干燥后采用MTT法分別測定各組分對前列腺癌細(xì)胞的增殖抑制率,初步確定具有較強抗腫瘤活性多肽的分子量范圍。對該分子量范圍的水解液經(jīng)超濾進(jìn)行大量收集,濃縮并冷凍干燥,作進(jìn)一步的分離純化。2. 5 DEAE-SepharoseFF離子交換柱色譜分離將上述步驟得到的活性最強部分過 DEAE-S印haroseFF 離子交換柱,分別用 PBS (PH 為 7. 4)、0. lmol/LNaCL、0. 3mol/LNaCL、 0. 5mol/LNaCL和Imol/LNaCL溶液進(jìn)行階段洗脫,洗脫速度為lml/min,蛋白檢測儀280nm 進(jìn)行檢測,分別收集各洗脫峰,并冷凍干燥。將干燥后得到的各個峰組分采用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實驗,進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰,并對該峰大量收集,濃縮并冷凍干燥,作為進(jìn)一步純化所用樣品。2.6 Sephadex G_25凝膠柱色譜分離由上述步驟得到的活性最強組分過 Sephadex G-25凝膠柱(80cmX 2. 6cm),流動相為蒸餾水,流速為2mL/min,蛋白檢測儀 280nm進(jìn)行檢測,對各洗脫峰分別進(jìn)行收集,濃縮后冷凍干燥。將干燥后得到的各個峰組分采用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實驗,確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰,并對該峰大量收集,濃縮并冷凍干燥,作為高效液相所用樣品。2. 7高效液相色譜(HPLC)純化及純度檢測純化色譜條件色譜柱為hrbax SB C18(250mmX9. 4mm, 5 μ m);柱溫為室溫;流動相為乙腈和水,梯度洗脫0 20min,乙腈濃度同0%變化到95% ;洗脫速度3. OmL/m in ;紫外檢測波長220nm。純度檢測色譜條件色譜柱為Hypersil BDS C18(250mmX4. 6mm, 5 μ m);柱溫為室溫;梯度洗脫0 20min,乙腈濃度由0%變化到95% ;洗脫速度0. 8mL/m in ;紫外檢測波長220nm。2. 8目標(biāo)肽的氨基酸序列檢測。通過檢測得到該貽貝酶解多肽,包含如下氨基酸序列:Asp Leu Tyr02. 9細(xì)胞形態(tài)觀察采用HE染色方法。將DU-145和PC_3細(xì)胞接種在帶有蓋玻片的六孔板上,細(xì)胞爬片24h后,加入20mg/ml的目標(biāo)肽,分別培養(yǎng)24h和4 后,將蓋玻片取出,95%酒精固定15min。PBS洗2次,蘇木素進(jìn)行染色,自來水充分水洗,伊紅復(fù)染,自來水浸洗,酒精梯度脫水,二甲苯透明,中性樹封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。3 結(jié)果3.1蛋白酶種類的確定4種蛋白酶對貽貝肉酶解所得到的酶解物對DU-145細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用,其中堿性蛋白酶酶解物對DU-145細(xì)胞的增殖抑制活性最強,濃度為20mg/ml,作用4 后,抑制率為觀.4% (見圖1)。堿性蛋白酶水解液經(jīng)超濾膜超濾后得到的4個組分在濃度為20mg/ml,作用4 后,3K以下組分對DU-145細(xì)胞的增殖抑制率最大,為30. 3% (見圖 2)。3. 2抗PCa活性肽的分離3K以下組分經(jīng)DEAE-kpharose FF離子交換柱洗脫后,共得到4個峰組分(見圖3),其中峰2抗腫瘤活性最強,當(dāng)濃度為20mg/ml,對DU-145細(xì)胞作用4 后,抑制率為 41.2%。峰2經(jīng)kphadex G_25凝膠柱洗脫后得到3個峰組分(見圖4),其中峰2_2的抗腫瘤活性最強,在濃度為20mg/ml,對DU-145細(xì)胞作用4 后,抑制率為46. 5% 3. 3抗PCa 活性肽的純化及純度測定峰2-2經(jīng)化計狀SB Cw純化后,最終得到1個多肽,即為本實驗所純化的目標(biāo)肽,見圖5。將該肽過Hypersil BDS C18色譜柱檢測其純度,在保留時間約為15min時出現(xiàn)單一峰,見圖6,說明本實驗所得到的目標(biāo)肽純度較高,為單一組分。3. 4目標(biāo)肽對DU-145和PC-3細(xì)胞增殖抑制作用將目標(biāo)肽設(shè)置5mg/ml、10mg/ml、 15mg/ml、20mg/ml和25mg/ml五個濃度組,分別測定作用24h、48h和72h后,對DU-145和 PC-3細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,目標(biāo)肽對DU-145細(xì)胞的增殖抑制活性比PC-3細(xì)胞強,對兩種細(xì)胞的增殖抑制活性均呈現(xiàn)時效和量效關(guān)系(表2)。表2貽貝酶解多肽對人前列腺癌DU-145和PC-3細(xì)胞增殖的影響(χ士s,η = 3)
權(quán)利要求
1.一種貽貝酶解多肽,其特征在于包含如下氨基酸序列Asp Leu Tyr0
2.一種如權(quán)利要求1所述貽貝酶解多肽的制備方法,其特征在于包括如下步驟①取貽貝肉,制成均漿,調(diào)節(jié)PH值9.5 10,料液比為1 2 1 3,添加堿性蛋白酶,加酶量為1500 2000U/g,酶解時間為6 8小時,酶解溫度為45 50°C,滅酶后離心, 取上層清液;②將上述的清液經(jīng)過超濾,收集分子量3K以下的水解液,濃縮并冷凍干燥;③DEAE-kpharoseFF離子柱交換柱色譜分離,將步驟②中的冷凍干燥后產(chǎn)物通過 DEAE-SepharoseFF離子柱交換柱,0. 1 Imol/LNaCL梯度洗脫,洗脫速度1 1. 5mL/min, 蛋白檢測儀280nm進(jìn)行檢測,對各洗脫峰分別進(jìn)行收集,濃縮后冷凍干燥,將干燥后得到的各個峰組分采用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實驗,進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰,并對該峰大量收集,濃縮并冷凍干燥;④采用kphadexG-25凝膠柱色譜分離,將步驟③所得的具有最高抗腫瘤活性的冷凍干燥后產(chǎn)物過kphadex G_25凝膠柱,流動相為蒸餾水,流速為1. 5 2mL/min,蛋白檢測儀 280nm進(jìn)行檢測,對各洗脫峰分別進(jìn)行收集,濃縮后冷凍干燥并用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實驗;⑤高效液相色譜純化,將步驟④中得到的具有最高抗腫瘤活性冷凍干燥后產(chǎn)后過反相高效液相柱,色譜柱為hrbax SB C18 (250mmX 9. 4mm, 5 μ m);柱溫為室溫;流動相為乙腈和水,梯度洗脫0 20min,乙腈濃從0%變化到95%,洗脫速度2. 5 3. OmL/min,紫外檢測波長220nm。
3.權(quán)利要求2或3所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌上的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2或3所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2或3所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌PC-3細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用。
全文摘要
一種貽貝酶解多肽,其特作在于包含如下氨基酸序列Asp Leu Tyr。采用如下步驟制備①取貽貝肉,制成均漿,添加堿性蛋白酶,滅酶后離心,取上層清液;②將上述的清液經(jīng)過超過濾,收集分子量3K以下的水解液,濃縮并冷凍干燥;③DEAE-SepharoseFF離子柱交換柱色譜分離;④采用Sephadex G-25凝膠柱色譜分離;⑤高效液相色譜純化。本發(fā)明還公開了通過上述步驟制備所得的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌上的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的優(yōu)點在于采用最佳的蛋白酶和優(yōu)選的工藝對貽貝進(jìn)行酶解純化,將所得的目標(biāo)肽應(yīng)用于抗前列腺癌細(xì)胞上產(chǎn)生了很強的細(xì)胞抑制增殖作用,為抗前列腺癌提供了一條可行性研究途徑。
文檔編號C07K2/00GK102558296SQ20101061094
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者丁國芳, 莊黛娜, 徐銀峰, 李 榮, 楊最素, 楊永芳, 許丹, 郁迪, 鄭玉寅, 閆海強, 黃芳芳 申請人:浙江海洋學(xué)院