專利名稱：：自聚體多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種自聚體多肽及其形成的多肽凝膠纖維在止血和促進創(chuàng)面愈合方面的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)多肽及醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：任何外科操作無一例外地涉及到出血與止血。手術(shù)搡作或創(chuàng)傷，特別是大的創(chuàng)面出血、滲血，有時很難控制，不但會導(dǎo)致失血量增大，而且還會增加手術(shù)難度，甚至危及生命，而良好的止血是手術(shù)安全進行的前提和保障。止血藥可通過收縮小動脈及毛細血管，或增強血小板功能，或加速、加強血液凝固過程，或抑制血塊溶解過程而產(chǎn)生止血作用。止血技術(shù)已由過去單純的器械止血措施發(fā)展為現(xiàn)代外科條件下的紛繁復(fù)雜的技術(shù)體系。目前，外科手術(shù)中常用到的止血方法包括以下幾各方面1、手術(shù)操作性止血措施即在手術(shù)過程中采取的止血措施，如結(jié)扎、縫合、電凝、填壓等方法，這些措施要求手術(shù)實施者對局部流血控制的范圍、時間、結(jié)局等有深刻的理解，處理不當則會誘發(fā)感染、繼發(fā)性出血的等問題。2、介入性止血措施介入性止血治療是指在內(nèi)鏡、超聲、CT或X線監(jiān)視下將治療用的導(dǎo)管、注射針、氣囊或其他相關(guān)器械導(dǎo)入臟器內(nèi)，并給以局部噴灑或注射止血藥物、生物膠、化學(xué)膠等進行栓塞治療，或?qū)敫哳l電流、激光、微波等理化因素，達到治療出血灶的目的。其操作簡單、創(chuàng)傷小、恢復(fù)快。3、理化止血措施如通過電凝、激光、微波、熱量達到止血。4、外用止血藥多為局部止血用途。機理多為止血劑在傷口處形成一層薄膜，膠粘創(chuàng)面而止血。如纖維蛋白凝膠、微絲纖維膠原止血劑、氧化纖維素和氧化再生纖維素、膠原可吸收性止血劑、化學(xué)膠、明膠海綿、凝血酶、施必止、外用中草藥制劑等。5、控制性降壓應(yīng)用麻醉學(xué)方法降低患者血壓，以減少術(shù)中及術(shù)后出血。目前國內(nèi)臨床常用的止血藥約有20多種，根據(jù)其凝血機制的不同環(huán)節(jié)，分為四大類。一是促凝血因子活性藥通過影響某些凝血因子，促進或恢復(fù)凝血過程而止血。代表藥物有血凝酶、去氨加壓素、維生素K1、維生素K3、維生素K4、甘氨酸乙二胺等。二是降低毛細血管通透性藥能增強毛細血管對損傷的抵抗力，降低毛細血管的通透性，促進受損毛細血管端收縮而止血。代表藥物有卡巴克絡(luò)、卡絡(luò)磺鈉。三是纖維蛋白原與抗纖維蛋白溶解藥通過抑制纖維蛋白酶原的激活因子，使纖維蛋白溶酶原不能被激活，從而抑制纖維蛋白的溶解。代表藥物有氨基己酸、氨甲苯酸、氨甲環(huán)酸、抑肽酶等。四是外用止血藥有可吸收創(chuàng)面的止血封固劑、明膠海綿、氧化纖維素、醛基纖維素、小蘗胺、云南白藥、止血粉8號、止血消炎貼等。這些止血方法及藥物等要求較高的搡作技術(shù)，止血時間較長，不同程度的存在不良的反應(yīng)或者并發(fā)癥，如一些粉末制劑藥物，不能夠流到傷口部位發(fā)揮其止血功能；某些液態(tài)的藥物，如氰基丙烯酸鹽粘合劑，在干燥的環(huán)境下才能發(fā)揮藥效；一些藥物可以引起免疫反應(yīng)，造成鄰近的細胞死亡，對肌體造成額外的壓力，延長或阻礙康復(fù)；某些藥物的保存期短，而且需要特殊的保存方法;許多現(xiàn)用止血劑很難作用于人力不可控制的體內(nèi)環(huán)境。傳統(tǒng)人工壓迫止血法，止血所需時間及臥床制動時間較長，同時易出現(xiàn)滲血、血腫及迷走神經(jīng)反射等并發(fā)癥。此外，如果治療使用潤脹劑，就必須釆用額外的護理，確保傷口處的血液供給，避免其他組織的損傷或死亡。在使用膨脹泡沬時這一點尤為重要。由于保存時間短，許多止血劑必須在使用前就準備好。外科器械，如燒灼器、鉗子和夾子，必須由專業(yè)人員在可控的情況下使用，上述很多藥物成分復(fù)雜，或者含有難降解的高分子材料，生物相容性差，具有毒性等?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)部分多肽具有自組裝現(xiàn)象，可以形成納米級纖維的片層結(jié)構(gòu)，如2005年2月17號公布的國際專利WO2005/014615A2，公布該自組裝多肽的創(chuàng)面愈合功能；專利CN200710048975.1公布了RADA16-1肽的燒傷治療作用。在長期的研究過程中，發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)了一種適于規(guī)?；瘧?yīng)用的單一成分多肽自組裝化合物，利用其可以形成納米纖維的性能可提高或改良止血或傷口護理。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一類新型的多肽，該類多肽具有在離子環(huán)境下可以自組裝成為納米級纖維片層，以達到快速止血的目的。本發(fā)明另一目的是提供上述合成多肽在止血藥物及傷口護理方面的應(yīng)用。本
發(fā)明內(nèi)容如下一種合成多肽，其氨基酸序列滿足如下通式(I):Ac-Xo-(X廠X2-X3誦X4)n國NH2(I)其中，Ac為乙?；疦末端；Xo為L-氨基酸，氨基酸類型為:Ala、Val或Gly;Xt、X2、X3和X4全為L型氨基酸或D型氨基酸，其中，X,為帶正電荷氨基酸Arg、Lys或His，X3為帶負電荷氨基酸Asp或Glu,乂2和乂4為不帶電荷氨基酸Ala、Val或Gly;X「X2-X3-X4為重復(fù)序列，n為氨基酸的排列在序列中的重復(fù)次數(shù)，n=2~4。結(jié)合計算機自由能模擬和^-片層的多肽分子設(shè)計替換數(shù)據(jù)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了要達到止血的目的，自組裝成為納米級纖維屏障的多肽序列具有如下特點如圖1所示，氨基酸之間排列由親水-疏水氨基酸重復(fù)序列組成，排列模式為_+-+-+-+，多肽分子之間通過親水端和疏水端的交互作用，形成"-片層，堆疊在一起，重復(fù)序列按2-5次，可以形成穩(wěn)定的自組裝結(jié)構(gòu)，親水和疏水氨基酸之間為不帶電荷的氨基酸間隔，滿足此結(jié)構(gòu)序列的多肽溶液在體內(nèi)濕潤的離子環(huán)境中可以形成孔徑為50-200nm網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(納米纖維屏障)，從而達到止血的目的。本發(fā)明合成多肽可采用固相多肽合成方式合成和生產(chǎn)，包括但不限于Fmoc-SPPS方式，BOC-SPPS方式，片段縮合連接方式。釆用Fmoc-保護或BOC-保護的的固相多肽合成技術(shù)(Solidphagepeptidesynthesis,SPPS)合成上述通式的多肽，樹脂釆用Fmoc-Rink-MBHA-resin,用20。/。的六氫吡P定/二甲基甲酰胺溶液脫除FMOC保護基后，采用多肽合成儀或者手工多肽合成方式，由N端向C端分步偶聯(lián)發(fā)明通式所述的所有序列多肽，依次連接氨基酸Fmoc-氨基酸，催化劑(HBTU，HOBT)對樹脂摩爾比采用1.5-4倍，Kaise測試每步連接是否完全，進行監(jiān)測，直至序列完成，在最后一個氨基酸Fmoc-脫除保護后，加入乙酸酐/DCM的溶液進行乙?；忾]，成為多肽樹脂，用標準TFA切割混合物95%三氟乙酸(TFA):0.4%苯甲硫醚(thioanisole):0.4%1，2-二巰基乙醇(EDT):0.2%水切割2-3小時，切割液過濾，導(dǎo)入冰乙醚中沉析出來，離心3-4次，成為粗品多肽，利用制備級液相色譜，純化后凍干成為98%以上純度級別的多肽粉末。稱取多肽粉末，用雙蒸水或去離子水配成質(zhì)量體積比為0.5%-10%多肽溶液，用于止血或傷口護理，也可以直接用多肽粉末用于止血或傷口護理。多肽粉末或多肽水溶液在遇到血液或在粒子環(huán)境下，自己很快組裝成為凝膠纖維(纖維屏障)，外觀形成透明凝膠，如同致密紗布一樣，發(fā)揮止血功和傷口護理功能。本發(fā)明的多肽其有益的效果是具有自組裝形成納米級纖維屏障的特點，可以在體外或體內(nèi)粒子環(huán)境下，形成多肽組成的凝膠狀纖維屏障，用于止血或者傷口護理。本發(fā)明的多肽也可以和其他藥物及藥物組合物，輔料，賦形劑等組合成為不同的藥物形式，用于止血及傷口護理的廣泛用途，其本身屬于多肽物質(zhì)，很容易被降解，止血機理與以往藥物不同，應(yīng)用前景廣闊。說明書附圖圖l為本發(fā)明合成多肽形成纖維凝膠的示意圖；圖2自組裝多肽合成MS圖譜；圖3自組裝多肽純化HPLC圖譜；圖4多肽P/。溶液自組裝形成凝膠AFM圖片；圖5納米纖維形成原理圖。具體實施例方式7可以形成自組裝的多肽通式可替換氨基酸如下表:通式Ac-X0-(X1-X2-X3-X4)n-NH:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以下通過實施例對發(fā)明做更進一步闡述，實施例是對本發(fā)明的更進一步的解釋，并不限于該實施例，其他未列出的符合氨基酸替換規(guī)則的序列化合物，制備和應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例X0為Val，Xl為Arg，X2為Val,X3為Asp，X4為Val，序列重復(fù)2次(11=2)時，序列如下Ac畫Val-Arg畫Val畫Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2自組裝多肽合成稱取Fmoc-Rink-MBHA-resin樹脂10g(替代度d=0.87),用20%的六氫吡^^/二甲基甲酰胺溶液200ml脫除FMOC保護基后，釆用多肽合成儀或者手工多肽合成方式，由N端向C端分步偶聯(lián)發(fā)明通式所述的序列多肽，連接氨基酸，F(xiàn)moc-氨基酸，催化劑(HBTU，HOBT)對樹脂摩爾比釆用2倍量，用DIEA做催化，在DMF中活化5分鐘，加入多肽反應(yīng)器進行氨基酸偶聯(lián)，Kaise測試每步連接是否完全，進行監(jiān)測，不斷重復(fù)以上步驟，直至序列合成完成，在最后一個氨基酸Fmoc-脫除保護后，加入乙酸酐/DCM的溶液進行乙?；忾]30分鐘，成為多肽樹脂，用標準TFA切割混合物100ml95。/。三氟乙酸(TFA):0.4%苯甲硫醚(thioanisole):0.4%1，2-二巰基乙醇(EDT):0.2%水切割2.5小時，切割液過濾，濾液倒入冰乙醚中沉析出來，離心3-4次，成為粗品多肽，利用制備級液相色譜，純化條件為A相0.1%TFA+H2O,B相0.1。/oTFA+乙腈，用C18制備柱4Ox250mm,采用B相10-60%線型洗脫，收集主峰后，濃縮后凍干成為98%以上純度級別的多肽粉末4.2g。(質(zhì)譜檢測1097.52，理論值MS為1097.5)圖2為自組裝多肽合成MS圖譜；圖3為自組裝多肽純化HPLC圖譜；圖4多肽1。/。溶液自組裝形成凝膠AFM圖片；圖5納米纖維形成原理圖?？梢钥闯觯铣傻玫降亩嚯臑锳c-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2。顯然，通過上述相同程序可以合成以下序列多肽XO為Val，XI為Arg,X2為Val，X3為Asp,X4為Val，序列重復(fù)2次(n=2)時，序列如下Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2XO為Val,XI為Arg，X2為Val,X3為Asp，X4為Val，序列重復(fù)3次(n=3)時，序列如下Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val誦Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2XO為Val,XI為Arg,X2為Val，X3為Asp,X4為Val，序列重復(fù)4次(n=4)時，序列如下Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2XO為Ala,XI為Lys,X2為Ala,X3為Glu,X4為Ala,序列重復(fù)3次(n=3)時，序列如下Ac-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-NH2本行業(yè)的技術(shù)人員也可以很容易合成新的符合本發(fā)明的序列，符合替換列表的氨基酸替換產(chǎn)生的所有序列，都在本發(fā)明保護范圍。多肽合成實驗材料及縮寫表示Fmoc-SPPS:利用FMOC-保護性氨基酸組裝合成的固相多肽合成(Solidphagepeptidesynthesis,SPPS)方法BOC-SPPS:利用BOC-保護性氨基酸組裝合成的固相多肽合成(Solidphagepeptidesynthesis,SPPS)方法Fmoc-:9-芴甲氧羰基BOC-:叔丁氧羰基Fmoc-Rink-MBHA-resin:氨基肽合成樹脂，購自西安創(chuàng)景生物科技公司DCM:二氯甲烷DMF:二甲基甲酰胺TFA:三氟乙酸Thioanisole:苯甲硫醚EDT:1，2-二巰基乙醇HBTU:O-(Benzotriazol-1-yl)畫N，N，N，，N，-tetramethyluroniumhexafluorophosphateHOBT:l-羥基苯駢三唑DIEA:N，N-二異丙基二乙胺Fmoc-氨基酸(純度98.5%以上，購自成都凱泰公司)如下Fmoc-Ala-OH(Fmoc-丙氨酸)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Fmoc-精氨酸)Fmoc-Asp(OtBu)-OH(Fmoc-天冬氨酸)Fmoc-Glu(OtBu)-OH(Fmoc-谷氨酸)Fmoc-Gly-OH(Fmoc-甘氨酸)Fmoc-His(Trt)-OH(Fmoc-組氨酸)Fmoc-Lys(Boc)-OH(Fmoc-賴氨酸)Fmoc-Val-OH(Fmoc-纈氨酸)止血實驗稱取多肽粉末200mg(序列為Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2),或用去離子水配成質(zhì)量體積(wt/V)比為1%-3%多肽溶液，用于止血或傷口護理實驗。多肽粉末大鼠尾部切斷止血實驗實驗釆用大鼠，體重270士30g，購自西安交大實驗動物中心。用大鼠戊巴比妥鈉50mg/kgip麻醉，仰臥固定，將大鼠尾部用消毒液消毒，在尾部尖端5cm處用鋒利的刀片將尾部切斷，立即把殘留的尾部斷面下邊墊一預(yù)先稱重的紗布，并將定量的上述合成多肽凍干粉末迅速灑在尾部斷面上，同時記錄出血時間(完全止住血時間)，用稱重法稱量紗布的重量，計算失血量。實驗方法詳見參考文獻KathyL.Ryan,etal.EfficacyofFDA-approvedhemostaticdrugstoimprovesurvivalandreducebleedinginratmodelsofuncontrolledhemorrhage.Resuscitation2006，70:133-M4(FDA批準的大鼠止血藥物恢復(fù)存活模型)；StephenW.Rothwelletal.Additionofapropylgallate-basedprocoagulanttoafibrinbandageimproveshemostaticperformanceinaseinearterialbleedingmodel.ThromvosisResearch2003,108:335-340(靜脈止血模型)。表l多肽粉末對大鼠尾部切斷出血的止血作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表1可見，多肽止血粉末與普通紗布和止血明膠對照組相比，產(chǎn)生的止血作用起效快、止血效果確切，能顯著減少尾部失血量，明顯縮短出血時間。臨床上可用于微小血管出血的止血，以及某些外傷性出血的止血和傷口護理。多肽1%水凝膠對兔耳皮膚切口止血實驗實驗動物選大白兔，體重2.7土0.3kg,購自西安交大實驗動物中心。用戊巴比妥鈉45mg/kgip麻醉，仰臥固定，氣管插管，將兔右耳剃毛，用碘酒消毒，用手術(shù)刀在兔耳切一條1.5CM的切口，使其出血。立即將配置好的1%的多肽水凝膠涂敷在切口上，并以預(yù)先稱重的紗布覆蓋，記錄止血時間和完全止住血液的時間，用稱重法稱量兔耳切口出血的失血量。表2多肽1%水凝膠對兔耳皮膚切口的止血作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果表明(見表2)，多肽1%水凝膠與對照組普通紗布，云南白藥等相比，止血作用起效更快、止血效果確切，能顯著減少兔耳皮膚切口出血的失血量，明顯縮短出血時間。臨床上可用于皮膚表面創(chuàng)傷出血的止血，尤其是各種皮膚外傷出血的快速止血。止血多肽對兔股靜脈血管出血的止血實驗實驗選用大白兔，體重2.7士0.3kg,購自西安交大實驗動物中心。用戊巴比妥鈉45mg/kgip麻醉，仰臥固定，氣管插管，將兔右側(cè)腹股溝剃毛，用碘酒消毒，剪開皮膚，分離皮下組織，暴露股靜脈，將靜脈完全剪斷，使其流血，立即把定量的殼聚糖多孔微球撒在創(chuàng)面上，并以預(yù)先稱重的紗布覆蓋，下方放置一50g砝碼的天平，記錄止血時間，用稱重法稱量兔股靜脈血管出血的失血量。實驗方法詳見參考文獻同上。表3止血多肽對兔股靜脈血管出血的止血實驗止血材料失血量(g)止血時間(秒)普通紗布35.21±4.01620±50殼聚糖紗布32.35±5.10550±432%多肽凝膠6.35±3.3625±3實驗結(jié)果表明(見表3)，2%自組裝多肽凝膠與對照組(普通紗布和殼聚糖紗布)相比產(chǎn)生的止血作用起效快、止血效果確切，能顯著減少對兔股靜脈血管出血失血量，明顯縮短出血時間。臨床上可用于靜脈血管出血的止血。止血多肽對兔股動脈血管流血的止血13實驗選用大白兔，體重2.7±03kg,購自西安交大實驗動物中心。用戊巴比妥鈉45mg/kgip麻醉，仰臥固定，氣管插管，將兔右側(cè)腹股溝剃毛，用碘酒消毒，剪開皮膚，分離皮下組織，分離一段動脈，長度約3.4cm,兩端分別用動脈夾夾住，用眼科虹膜剪細心在股動脈上剪一個2x3mm的橢圓形孔，取出雙側(cè)動脈夾，使其流血。立即配好的3%多肽凝膠涂敷在創(chuàng)面上，并以預(yù)先稱重的紗布覆蓋，且放置一個100g砝碼，記錄止血時間，用稱重法稱量兔股動脈血管出血的失血量。表4止血多肽對兔股動脈血管流血的止血作用止血材料失血量(g)出血時間(min)普通紗布55.45±7.7633.12士8.56含殼聚糖紗布46.64±7.4328,26±5.233%多肽凝膠4.21±2.240.50±0.25實驗結(jié)果表明(見表4),3%多肽凝膠與對照組相比產(chǎn)生的止血作用起效快、止血效果確切，能顯著減少兔股動脈血管流血的失血量，明顯縮短出血時間。臨床上可用于大血管出血的止血，尤其是戰(zhàn)傷、各種緊急外傷引起的大出血的快速止血。1權(quán)利要求1、一種合成多肽，其氨基酸序列滿足如下通式(I)Ac-X0-(X1-X2-X3-X4)n-NH2(I)其中，Ac為乙?；疦末端；X0為L-氨基酸，氨基酸類型為Ala、Val或Gly；X1、X2、X3和X4全為L型氨基酸或D型氨基酸，其中，X1為帶正電荷氨基酸Arg、Lys或His，X3為帶負電荷氨基酸Asp或Glu，X2和X4為不帶電荷氨基酸Ala、Val或Gly；X1-X2-X3-X4為重復(fù)序列，n為氨基酸的排列在序列中的重復(fù)次數(shù)，n＝2～4。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述合成多肽，其特征在于X。為Ala或Val。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述合成多肽，其特征在于X,，X2，X3,X4為L型氨基酸。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3任意之一所述合成多肽，其特征在于X,為Arg或Lys。5、根據(jù)權(quán)利要求1至3任意之一所述合成多肽，其特征在于n為2或3。6、根據(jù)權(quán)利要求1至3任意之一所述合成多肽，其特征在于Xo與X4為相同氨基酸。7、權(quán)利要求1所述合成多肽在止血及傷口護理方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種合成多肽，其氨基酸序列滿足如下通式Ac-X₀-(X₁-X₂-X₃-X₄)_n-NH₂，其中，Ac為乙?；疦末端；X₀為L-氨基酸，氨基酸類型為Ala、Val或Gly；X₁、X₂、X₃和X₄全為L型氨基酸或D型氨基酸，X₁為帶正電荷氨基酸Arg、Lys或His，X₃為帶負電荷氨基酸Asp或Glu，X₂和X₄為不帶電荷氨基酸Ala、Val或Gly；X₁-X₂-X₃-X₄為重復(fù)序列，n為氨基酸的排列在序列中的重復(fù)次數(shù)，n＝2～4。本發(fā)明的多肽具有自組裝形成納米級纖維屏障的特點，可以在體外或體內(nèi)粒子環(huán)境下，形成多肽組成的凝膠狀纖維屏障，用于止血或者傷口護理。文檔編號C07K1/04GK101514225SQ200810231709公開日2009年8月26日申請日期2008年10月13日優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日發(fā)明者王亞宏申請人:西安藍晶生物科技有限公司