專利名稱：：一種afp重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及載體及其應(yīng)用，特別是涉及一種重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法與其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景腺相關(guān)病毒(AAV)的基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)被鑒定。1983年，Saraulski等人描述了AAV的末端重復(fù)片段(上游5，端片段，下游3，端片段)(SamulskiRJ，SrivastavaA，BernsKI，MuzyczkaN.Rescueofadeno—associatedvirusfromrecombinantplasmids:genecorrectionwithintheterminalrepeatsofAAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染顆粒(lip)基因和包膜(cap)基因(HermonatPL,LabowMA，WrightR,BernsKI，MuzyczkaN.Geneticsofadeno-associatedvirus:isolationandpreliminarycharacterizationofadeno-associatedvirustype2mutants.JVirol.51:329-339.Hermonat,P丄，andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianD織cloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鑒定了位于上游5'端片段和r印基因之間的p5啟動子(LabowMA，HermonatPL，BernsKI.Positiveandnegativeautoregulationoftheadeno—associatedvirustype2genome.JVirol.160:251-258.)。1984年，美國博沃基因國際有限公司的主要技術(shù)技術(shù)負(fù)責(zé)人之一PaulL.Hermonat教授率先證明AAV載體可用于人類疾病的基因治療(Hermonat,P丄.，andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。目前，主要是歐美國家在進(jìn)行以AAV為基礎(chǔ)的基因治療人類疾病的臨床試驗。據(jù)美國糧食和藥品管理局統(tǒng)計，現(xiàn)有十余項以AAV為基礎(chǔ)的基因治療臨床試驗正在進(jìn)行，主要是將攜帶治療基因的AAV病毒注入患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)治療基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。主要針對治療的疾病有帕金森氏綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血友病、心力衰竭、進(jìn)行性肌萎縮和奧茲海默綜合癥等非腫瘤性疾病。但是，應(yīng)用于臨床治療的AAV病毒仍存在一些問題，例如攜帶治療基因大小受到明顯限制，病毒本身不穩(wěn)定，導(dǎo)致治療基因表達(dá)不穩(wěn)定，以及造成療效不一致。雖然AAV病毒本身的免疫原性很弱，但所表達(dá)的治療基因容易在患者體內(nèi)誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用。AAV是一種非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因產(chǎn)物輔助，才能裝配成為具有感染性的病毒顆粒。AAV基因組全長約4700堿基對(bp)，兩端為重復(fù)末端片段(TR)，中間為病毒的結(jié)構(gòu)基因，包括與病毒復(fù)制有關(guān)的iep基因和病毒衣殼Csp基因。由于存在AAV病毒自身的不穩(wěn)定性及其攜帶外源性基因(治療基因)長度有限等方面缺陷，因此有必要對其進(jìn)行基因重組形成重組腺相關(guān)病毒(recombinantadeno-associatedvirus,rAAV)?，F(xiàn)有大量研究表明，將AAV基因組中的結(jié)構(gòu)基因刪除，可明顯增加外源性基因的容量。此外，將具有治療作用的外源性基因插入rAAV中，制備成具有感染性的rAAV病毒顆粒，注射入患者體內(nèi)，使其感染體內(nèi)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)治療基因，從而達(dá)到治療疾病的作用。目前，主要是將rAAV應(yīng)用于帕金森氏綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血友病、心力衰竭、進(jìn)行性肌萎縮和奧茲海默綜合癥等非腫瘤性疾病的治療。但rAAV仍然存在一些不足，如重組病毒不穩(wěn)定，病毒滴度低，接納治療基因的容量仍然有限(一般僅能插入的外源性基因片段最大約2000堿基對(bp)，否則rAAV的穩(wěn)定性將被破壞)。因此，需要設(shè)計更為合理的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體，以滿足實際應(yīng)用的需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定性高、攜帶外源性基因(AFP)的容量大的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體。本發(fā)明所提供的AFP重組腺相關(guān)病毒載體，是將腺相關(guān)病毒(AAV)載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因替換為甲胎蛋白AFP(alphafetalprotein)基因或其突變型基因得到的重組腺相關(guān)病毒載體。本發(fā)明的AFP重組腺相關(guān)病毒載體是在已知的腺相關(guān)病毒載體的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造得到的，所述腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因為vfe/7和6Ho/^》基因，AFP基因為一種腫瘤相關(guān)抗原基因，其突變型基因是具有相同功能的AFP基因片段。已知的腺相關(guān)病毒載體具有p5啟動子，為提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，還可進(jìn)一步將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的p5啟動子替換為巨噬細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子、beta肌動蛋白啟動子和SV40病毒啟動子中的一個或幾個啟動子。本發(fā)明的第二個目的是提供上述AFP重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的構(gòu)建方法，是使用常規(guī)的基因重組的方法，先將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因剔除，再用甲胎蛋白AFP基因或其突變型基因取代該剔除基因，得到重組腺相關(guān)病毒載體。在上述AFP重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法中，為提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，還可進(jìn)一步將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的p5啟動子替換為巨噬細(xì)胞病毒啟動子、beta肌動蛋白啟動子和SV40病毒啟動子中的一個或幾個啟動子。與本發(fā)明AFP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品，包括重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒、重組腺相關(guān)病毒顆粒和被本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，如單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系、T淋巴細(xì)胞系等(所述重組腺相關(guān)病毒載體中的相關(guān)基因一AFP基因或其突變型基因可在單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系或T淋巴細(xì)胞系等細(xì)胞系中在轉(zhuǎn)錄啟動子的作用下獲得表達(dá))等均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。醫(yī)藥用途方面，本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗腫瘤藥物。本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物的活性成分為上述AFP重組腺相關(guān)病毒載體或與本發(fā)明AFP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品。如以本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒為載體，將腫瘤相關(guān)抗原-野生型和/或突變型AFP導(dǎo)入單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系，并誘導(dǎo)產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞，以達(dá)到患者體外和體內(nèi)免疫刺激的目的，用以治療某些腫瘤，或以該樹突狀細(xì)胞刺激產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(例如但不僅局限于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)治療某些腫瘤。所述抗腫瘤藥物可用于治療肝癌等AFP陽性的惡性腫瘤。本發(fā)明所提供的藥物可采用溶劑或粉劑等劑型。所述溶劑的選擇是多種多樣的，如細(xì)胞培養(yǎng)液(基)、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等均可。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑和表面活性劑等。用藥方式可為先分離出腫瘤患者體內(nèi)的單核細(xì)胞，再將此藥感染或轉(zhuǎn)染患者的單核細(xì)胞?；?qū)⑥D(zhuǎn)化有野生型和/或突變型甲胎蛋白AFP基因的成熟的樹突狀細(xì)胞所刺激產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞回輸腫瘤患者。上述藥物的用量一般為100ul/5X10V每次，每月2次，療程通常為6個月。劑量和療程都可根據(jù)實際情況調(diào)整。為提高療效，本發(fā)明的藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑和腫瘤靶向藥物等進(jìn)行組合治療。本發(fā)明還提供了一種體外殺滅腫瘤的方法。本發(fā)明所提供的殺滅腫瘤的方法，可包括以下步驟l)將腫瘤所在體系(該體系可通過人工模擬的方式產(chǎn)生)中自然產(chǎn)生的單核細(xì)5胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞被本發(fā)明攜帶野生型甲胎蛋白AFP基因的重組腺相關(guān)病毒載體和/或攜帶突變型甲胎蛋白AFP基因的重組腺相關(guān)病毒載體感染或轉(zhuǎn)染，或被與本發(fā)明AFP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理，各自得到處理后的細(xì)胞；2)將步驟l)中處理后的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或?qū)⑽幢惶幚淼腡淋巴細(xì)胞與所述處理后的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)形成抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，再將該抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或?qū)⒈惶幚淼腡淋巴細(xì)胞和未被處理的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤。本發(fā)明所述殺滅腫瘤的方法可具體應(yīng)用到腫瘤治療中，包括給予一個腫瘤患者回輸抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞由來源于患者的自然產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞與來源于該患者的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)產(chǎn)生的。在混合培養(yǎng)之前，這些在單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞已經(jīng)被本發(fā)明攜帶野生型AFP基因的重組腺相關(guān)病毒和/或攜帶突變型AFP基因的重組腺相關(guān)病毒載體感染或者轉(zhuǎn)染，或被與本發(fā)明AFP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理；或者，給予一個腫瘤患者回輸來源于患者的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞。在回輸之前，這些在單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞已經(jīng)被本發(fā)明攜帶野生型AFP基因的重組腺相關(guān)病毒和/或攜帶突變型AFP基因的重組腺相關(guān)病毒載體感染或者轉(zhuǎn)染，或被與本發(fā)明AFP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理；再或者，給予一個腫瘤患者回輸上述來源于患者的T淋巴細(xì)胞和來源于該患者的自然產(chǎn)生的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞。在回輸之前，這些T淋巴細(xì)胞已經(jīng)被本發(fā)明攜帶野生型AFP基因的重組腺相關(guān)病毒和/或攜帶突變型AFP基因的重組腺相關(guān)病毒載體感染或者轉(zhuǎn)染，或被與本發(fā)明AFP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理。本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定性較高、外源性基因(AFP)容量大的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體。在本發(fā)明的rAAV載體中，AAV的結(jié)構(gòu)基因7fep和Csp/h'p基因被野生型或突變型的AFP基因取代。本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒載體可將其攜帶的野生型或突變型的甲胎蛋白AFP基因輸送入單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系中，攜帶有這些特異性抗原基因的細(xì)胞被用于刺激免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞(不局限于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)。實驗證明，被本發(fā)明的rAAV感染的樹突狀細(xì)胞和所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在患者體內(nèi)可有效地抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長或者殺滅腫瘤細(xì)胞，因而，本發(fā)明的AFP重組腺相關(guān)病毒載體或與本發(fā)明AFP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品可被用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明在肝癌等惡性腫瘤的臨床應(yīng)用中具有重要的理論和實際意義，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1為重組腺相關(guān)病毒載體的結(jié)構(gòu)示意2A為重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/AFP的酶切檢測結(jié)果圖2B為重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/AFP的PCR檢測結(jié)果圖3為重組腺相關(guān)病毒rAAV的制備流程圖圖4為重組腺相關(guān)病毒rAAV/AFP的病毒滴度檢測結(jié)果圖5為一種或多種攜帶腫瘤相關(guān)抗原基因的rAAV病毒感染腫瘤患者單核細(xì)胞為基礎(chǔ)的殺滅腫瘤實驗流程圖6為重組腺相關(guān)病毒rAAV/AFP感染外周血單個核細(xì)胞的效率檢測結(jié)果圖7為被重組腺相關(guān)病毒rAAV/AFP感染的DC表達(dá)CD80、CD83以及CD86水平的檢測結(jié)果圖8為被rAAV/AFP感染的DC所誘導(dǎo)的CTL的IFN-y表達(dá)水平檢測結(jié)果圖9為被rAAV/AFP感染的DC所誘導(dǎo)的CTL殺傷腫瘤細(xì)胞試驗殺傷特異性檢測結(jié)果圖10為四例肝癌患者經(jīng)VrAAV/AFP感染的DC所誘導(dǎo)的CTL治療前后患者血清中AFP腫瘤相關(guān)抗原水平的變化情況具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY，ColdSpringHarbor)。所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/體積(w/v)百分比濃度或體積/體積(v/v)百分比濃度。所用引物、DNA序列合成及DNA序列測定均由美國Invitrogen公司完成。實施例1、重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/AFP和rAAV/mAFP的構(gòu)建及檢測材料及其來源A.攜帶AAV2型全基因組DNA的pBR322質(zhì)粒(命名為pBR-AAV2):由美國博沃基因國際有限公司的主要技術(shù)技術(shù)負(fù)責(zé)人之一PaulL.Hermonat教授制備(Hermonat，P.L,andMuzyczka，N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466—6470.)。B.人H印G2細(xì)胞株來源于美國細(xì)胞及組織收集中心，表達(dá)甲胎蛋白抗原(AFP);也可商業(yè)渠道獲得。C.攜帶CMV啟動子的pCI-neo質(zhì)粒購于美國Promega公司，攜帶SV40早期啟動子的質(zhì)粒pSG424購于美國Clonitic公司。D.基因擴增核苷酸引物根據(jù)美國基因庫中公開發(fā)表的甲胎蛋白抗原(AFP)基因序列(美國NCI基因庫:NM—001134)設(shè)計。用下述方法構(gòu)建本發(fā)明攜帶AFP基因或其突變型基因的重組腺相關(guān)病毒載體(如圖l所示)，具體過程包括以下步驟一、重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建A.pBR-AAV2質(zhì)粒的改建，具體方法為先用限制性內(nèi)切酶^sz^《I和處al(購自美國Promega公司)將pBR-AAV2質(zhì)粒中的腺相關(guān)病毒AAV基因組的結(jié)構(gòu)基因W印和"p/Cap基因完全切除，反應(yīng)體系為lugpBR-AAV2，10U^W《I，10U^aI，2.5p110X緩沖液D以及19.5ul去離子水；反應(yīng)條件為在37-C下水浴4小時。然后，將含有限制性內(nèi)切酶I和V酶切位點的核苷酸序列(CGAATTCATGCGATATCGTT)插入質(zhì)粒中，反應(yīng)體系為500ng質(zhì)粒，300ngI和fco/V的核苷酸序列，10IUT4DNA連接酶(購自美國Promega公司)，1.5ul10XT4DNA連接緩沖液以及11.5ul去離子水；反應(yīng)條件為在4'C下水浴8小時。然后，保留兩端完整的TR序列或?qū)AV基因組的兩端TR的第75位核苷酸序列處均插入由9個核苷酸組成的片段CTGCGCTGG，目的是提高rAAV病毒的穩(wěn)定性以及提高病毒的復(fù)制效率，方法為首先用限制性內(nèi)切酶5朋I(購自美國Promega公司)切割兩端的TR，反應(yīng)體系為lug上述制備的質(zhì)粒，10U5朋I，1.5ulIOX緩沖液G以及11.5ul去離子水；反應(yīng)條件為在37'C下水浴4小時，再將9個核苷酸片段插入質(zhì)粒中，反應(yīng)體系為500ng質(zhì)粒，300ng9個核苷酸序列，10IUT4DNA連接酶(購自美國Promega公司)，1.5ul10XT4DNA連接緩沖液以及11.5u1去離子水；反應(yīng)條件為在4"C下水浴8小時。B.采用基因擴增技術(shù)(多聚酶鏈反應(yīng)，PCR)擴增CMV啟動子，SV40早期啟動子。具體方法為先以pCI-neo質(zhì)粒(購自美國Promega公司)為模板，在引物1:AGATCTTCAATATTGGCCAT和引物2:TGTCAGAAGCACTGACTGC的引導(dǎo)下PCR擴增CMV啟動子，PCR擴增條件為先94匸4分鐘；再94。C30秒，60°C35秒，72°C1分鐘，共30個循環(huán)；最后72"C8分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在740bp處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到CMV啟動子。再以pSG424質(zhì)粒(購自美國Clonitic公司)為模板，在引物3:GAACCAGCTGTGGAATGTGTC和引物4:TCAGGAAGCTTAGATCTAGC的引導(dǎo)下PCR擴增SV40早期啟動子，PCR擴增條件為先94"C4分鐘；再94t:30秒，60°C35秒，72°C40，秒，共30個循環(huán)；最后72"C8分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在359bp處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到SV40早期啟動子。C.PCR擴增beta肌動蛋白啟動子、全長AFPcDNA和部分AFPcDNA片段(分別命名為A(自5，端第12-1277位堿基)、B(自5，端第653-1277位堿基)、C(自5，端第653-1902位堿基))，本實施例以上述片段為例但不限于上述片段，其它與AFPcDNA具有相同功能的AFPcDNA片段均可用于構(gòu)建本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒載體)，具體方法為采用核酸分離技術(shù)，從人H印G2細(xì)胞中分離總DNA和mRNA(也可人工合成或商業(yè)渠道獲取)，然后以總DNA為模板，在引物CCCGGGCCCAGCACCCCAAG和引物6:CATCCATGGTGAGCTGCG的引導(dǎo)下PCR擴增beta肌動蛋白啟動子，PCR擴增條件為先94°C4分鐘；再94°C30秒，58°C35秒，72°C1分鐘20秒，共30個循環(huán)；最后72°C8分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1176bp處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到beta肌動蛋白啟動子。再將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA并以此為模板，在引物7:CTTCCACCACTGCCAATAAC和引物8:TTGTCTTCTCTTCCCCTG的引導(dǎo)下PCR擴增全長AFPcDNA，PCR擴增條件為.-先94。C4分鐘；再94。Cl分鐘，60°C1分鐘，72。C2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°CIO分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2X瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1890bp處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將該目的條帶回收并純化后得到全長AFPcDNA，用上述相同方法得到AFPcDNA片段A(弓i物7禾口弓l物9:TGCTTGGCTCTCCTGGATGT)、AFPd)NA片段B(引物10:CCAMCAAAGGCAGCAAC和引物9)、AFPcDNA片段C(引物10和引物8)。D.采用DNA連接技術(shù)，將上述擴增的CMV啟動子、SV40早期啟動子、beta肌動蛋白啟動子、全長AFPcDNA或部分AFPcDNA片段依次插入步驟A經(jīng)改建的pBR-AAV2載體中，為插入啟動子，首先進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后進(jìn)行連接反應(yīng)，其中，酶切反應(yīng)體系為1yg質(zhì)粒；10U限制性內(nèi)切酶"柳#I和I(購自美國Promega公司)，2.5nl10X緩沖液C以及19.5wl去離子水；反應(yīng)條件為在37'C下水浴4小時，連接反應(yīng)體系為500ng酶切后的質(zhì)粒，300ng啟動子DNA，10IUT4DNA連接酶(購自美國Promega公司)，1.5ul10XT4DNA連接緩沖液以及11.5u1去離子水；反應(yīng)條件為在4。C下水浴8小時。然后，將攜帶有啟動子的質(zhì)粒和全長的AFPcDNA分9別用限制性內(nèi)切酶^COVV和7\fefI酶切。酶切反應(yīng)以及進(jìn)行連接反應(yīng)的體系和條件與上述相同。最后分別得到攜帶有CMV啟動子、SV40早期啟動子、beta肌動蛋白啟動子和全長AFPcDNA的重組腺相關(guān)病毒載體(命名為rAAV/AFP)，以及攜帶有CMV啟動子、SV40早期啟動子、beta肌動蛋白啟動子和A或B或C不同AFPcDNA片段(突變型)的重組腺相關(guān)病毒載體(分別命名為rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP和rAAV/CmAFP統(tǒng)一命名為rAAV/mAFP)。E.將連接后的DNA—rAAV/AFP和rAAV/mAFP分別導(dǎo)入基因工程大腸桿菌(AcoA')DH5a感受態(tài)細(xì)胞(美國Invitrogen公司)，用含lOOl^g/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行抗性篩選，挑取白色單菌落，提取質(zhì)粒并純化，得到rAAV/AFP質(zhì)粒和rAAV/raAFP質(zhì)粒。二、重組腺相關(guān)病毒載體的檢測先對步驟一獲得的經(jīng)純化的rAAV/AFP質(zhì)粒和rAAV/mAFP質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(依次為AbfI&^Sa^I、I&;VotI、V&順eI、AcotV&#otI、尸"I)進(jìn)行酶切，所用限制性內(nèi)切酶均購自美國Promega公司。反應(yīng)結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中rAAV/AFP質(zhì)粒的檢測結(jié)果如圖2A所示(l.rAAV/AFP(W"I和fe/z^I內(nèi)切酶)。2.rAAV/AFPI和I內(nèi)切酶)。3.rAAV/AFP(&o7V和順eI內(nèi)切酶)。4.rAAV/AFP(fco/V和I內(nèi)切酶)。5.rAAV/AFP(尸WI內(nèi)切酶)。6.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。)，經(jīng)I和^s感I酶切獲得了1305bp的特異性條帶，經(jīng)I和船tI酶切獲得了1295bp的特異性條帶，經(jīng)fco7V和順eI酶切獲得了3568bp的特異性條帶，經(jīng)V和#WI酶切獲得了1896bp的特異性條帶，經(jīng)尸"I酶切獲得了251bp、382bp、509bp、983bp和1613bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。rAAV/mAFP質(zhì)粒的酶切檢測結(jié)果也與預(yù)期結(jié)果相符。再對rAAV/AFP質(zhì)粒和rAAV/mAFP質(zhì)粒用基因擴增(PCR)的方法做進(jìn)一步的檢測，其中rAAV/AFP質(zhì)粒的檢測結(jié)果如圖2B所示(l.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。2.AFPcDNA。3.陰性對照。)，經(jīng)擴增獲得了1890bp的預(yù)期的特異性條帶。rAAV/mAFP質(zhì)粒的PCR檢測結(jié)果也與預(yù)期結(jié)果相符(擴增產(chǎn)物的大小依次為rMV/AmAFP:1266bp、rAAV/BmAFP:625bp、rAAV/CmAFP:1250bp)。上述檢測結(jié)果表明獲得了插入位置及序列均正確的攜帶AFP基因的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/AFP和以及攜帶AFP突變型基因的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/mAFP。實施例2、重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的制備及病毒滴度測定材料及其來源A.實施例1構(gòu)建的攜帶AFP基因的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/AFP和以及攜帶AFP突變型基因的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV/mAFP(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP和rAAV/CmAFP)。B.含AAV的yep基因和Z^vTsp基因的輔助質(zhì)粒pHelper:由美國阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院基因治療中心劉勇教授構(gòu)建(Liu,Y.，Chiriva-Internati，M.，Grizzi，F(xiàn).Salati，E.，Roman,J.J.，LimS.，andHermonat,P丄RapidinductionofcytotoxicTcellresponseagainstcervicalcancercellsbyhumanpapillomavirustype16E6antigengenedeliveryintohumandendriticcellsbyanadeno-associatedvirusvector.CancerGeneTherapy8:948-957.)。C.含有整合于細(xì)胞染色體并表達(dá)的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAV-服K293細(xì)胞由美國阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院基因治療中心建立(Liu，Y.，Chiriva-Internati，M.，Grizzi，F(xiàn).Salati，E.，Roman,J".J".,LimS.，andHermonat，P.LRapidinductionofcytotoxicTcellresponseagainstcervicalcancercellsbyhumanpapillomavirustype16E6antigengenedeliveryintohumandendriticcellsbyanadeno-associatedvirusvector.CancerGeneTherapy8:948-957.)。D.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin:購自美國Invotrogen公司。E.DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(或小牛血清)購自美國Cellgro公司。F.PCRDIG標(biāo)記試劑盒和DIG雜交檢測試劑盒購自瑞士Roche公司。G.DNA拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn):分別為1012拷貝數(shù)(c叩ies)/iil至106(copies)1，購自美國Promega公司。一、重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的制備參照圖3，用下述方法制備重組腺相關(guān)病毒(rAAV)，以制備一盤10.0cm細(xì)胞培養(yǎng)皿的病毒為例，當(dāng)AAV-HEK293細(xì)胞在二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長至約占培養(yǎng)皿面積70%時，進(jìn)行如下操作A.按照Lipofectin的使用說明進(jìn)行操作將l.OugrAAV載體(rAAV/AFP或rAAV/mAFP)，1.gpHelper質(zhì)粒，4.0Lipofectin和50.On1含5%胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培養(yǎng)基混勻，室溫靜置20分鐘。B.將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。C.72小時后，收獲培養(yǎng)皿中的所有細(xì)胞和培養(yǎng)液。D.劇烈振蕩l分鐘后，離心，保留上清，即rAAV病毒液。E.將收集的rAAV病毒液過濾除菌。將獲得的攜帶腫瘤相關(guān)抗原基因AFP基因全長AFPcDNA或部分AFPcDNA片段(A、B、C突變型基因)的rAAV病毒分別命名為rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP。二、重組腺相關(guān)病毒(rAAV)的病毒滴度測定采用常規(guī)的斑點雜交法，對步驟一獲得的各種rAAV病毒(rAAV/AFP、rMV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)進(jìn)行病毒滴度測定，具體方法包括以下步驟僅所用的DNA探針為針對腫瘤相關(guān)抗原基因的特異性探針。A.采用常規(guī)的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒顆粒DNA。B.將尼龍膜置于斑點印跡儀中，加入經(jīng)堿變性的rAAV病毒顆粒DNA，并加入DNA拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，抽真空。C.取出尼龍膜干燥后，紫外線固定。D.用PCRDIG標(biāo)記試劑盒并參照試劑盒說明書制備DIG標(biāo)記的特異性探針，探針為"實施例1步驟C中所獲得的AFPcDNA。PCR擴增結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下檢測PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果出現(xiàn)陽性條帶，表明探針標(biāo)記成功。E.用DIG雜交檢測試劑盒并參照試劑盒說明書，在雜交爐中對各種rAAV病毒顆粒DNA進(jìn)行DNA雜交。其中，rAAV/AFP的檢測結(jié)果如圖4所示，rAAV/AFP的病毒滴度為1(T-1()U拷貝/mL，三種rAAV/mAFP的病毒滴度均為101。-K)H拷貝/mL。實施例3、腫瘤相關(guān)抗原導(dǎo)入單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系的殺滅腫瘤實驗材料及其來源A.rAAV病毒rAAV/AFP和rAAV/mAFP(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)。B.AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。C.細(xì)胞因子集落細(xì)胞刺激因子(GM-CSF),白細(xì)胞介素2，4，7(IL-2,4，7)以及腫瘤壞死因子(TNF-a)購自美國R&D公司。一、殺滅腫瘤實驗如圖5所示，將本發(fā)明一種或多種攜帶腫瘤相關(guān)抗原基因(AFP基因及其突變型基因)的rAAV病毒感染腫瘤患者單核細(xì)胞為基礎(chǔ)的殺滅腫瘤實驗的整個過程包括以下步驟A.取腫瘤患者50-150毫升外周血，用血細(xì)胞分離儀(或淋巴細(xì)胞分離液)按常規(guī)方法獲取外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，與AIM-V培養(yǎng)基混勻后，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。B.除去懸浮細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞(單核細(xì)胞，monocyte,Mo)。懸浮細(xì)胞即外周血淋巴細(xì)胞，將其與AIM-V培養(yǎng)基混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)備用。C.加入一種(或多種，效果更佳)本發(fā)明實施例2獲得的rAAV病毒，加入量約為100-1000M0I,同時再加入GM-CSF(800IU/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。D.除去舊培養(yǎng)基，補充含GM-CSF，IL-4(800IU/mL)以及TNF-a(20IU/mL)的AIM-V培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。E.培養(yǎng)5天后，收獲成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)，并與所培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞混合，在AIM-V培養(yǎng)基中加入IL-2(20IU/mL)以及IL-7(500IU/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)。F.培養(yǎng)至7-9天后，收獲激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)進(jìn)行檢測。二、樹突狀細(xì)胞(DC)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的檢測A.rAAV感染外周血單個核細(xì)胞的效率檢測采用常規(guī)的熒光抗體標(biāo)記染色法，用針對腫瘤相關(guān)抗原AFP的特異性熒光抗體(購自美國BD公司)標(biāo)記步驟一獲得的被本發(fā)明rAAV感染的單核細(xì)胞或未成熟的DC，再進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞的數(shù)量。其中，重組腺相關(guān)病毒rAAV/AFP感染外周血單個核細(xì)胞的效率檢測結(jié)果如圖6所示，rAAV/AFP感染外周血單個核細(xì)胞的效率為89%，所構(gòu)建和制備的各種攜帶腫瘤相關(guān)抗原基因的rAAV(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)感染外周血單核細(xì)胞的效率均約為90%，即約百分之九十的外周血單個核細(xì)胞可被rAAV病毒感染，證明本發(fā)明的rAAV具有較高的感染效率。B.樹突狀細(xì)胞(DC)的CD分子水平的檢測DC表達(dá)CD80、CD83以及CD86的水平與DC的功能呈正相關(guān)。用與步驟A相同的檢測方法，即分別采用熒光標(biāo)記的針對這三種CD分子的抗體(購自美國BD公司)對步驟一獲得的DC表達(dá)CD80、CD83以及CD86的水平進(jìn)行檢測，以AFP蛋白刺激的DC以及無刺激的DC為對照。其中，重組腺相關(guān)病毒rAAV/AFP感染的DC表達(dá)CD80、CD83以及CD86水平的檢測結(jié)果如圖7所示。rAAV/AFP及其它攜帶腫瘤相關(guān)抗原基因的rAAV(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)感染的DC所表達(dá)的CD分子水平明顯高于對照，證明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤相關(guān)抗原AFP及其突變型基因的rAAV感染外周血單個核細(xì)胞后，所誘導(dǎo)的DC的功能強大。C.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表達(dá)的y干擾素(IFN-y)水平的檢測CTL的功能及其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力與IFN-y的表達(dá)水平呈正相關(guān)。用與步驟A類似的方法檢測被本發(fā)明rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL表達(dá)IFN-y的水平(以無刺激的DC所誘導(dǎo)的CTL為對照。)，DC與外周血淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)結(jié)束后，收獲細(xì)胞，采用傳統(tǒng)的胞內(nèi)染色法進(jìn)行細(xì)胞熒光染色標(biāo)記，所用抗體為針對IFN-y的熒光標(biāo)記抗體(購自美國BD公司)，最后利用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。其中，被rAAV/AFP感染的DC所誘導(dǎo)的CTL的IFN-y表達(dá)水平如圖8所示，rAAV/AFP及其它攜帶腫瘤相關(guān)抗原基因的rAAV(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)感染的DC所誘導(dǎo)的CTL表達(dá)IFN-y的水平明顯高于對照，證明被本發(fā)明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤相關(guān)抗原AFP及其突變型基因的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL功能強大。D.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)殺傷腫瘤細(xì)胞試驗混合培養(yǎng)結(jié)束后，將步驟一中被rAAV(rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CraAFP)感染的DC所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞按20:1(淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞)與肝癌細(xì)胞混合后，采用傳統(tǒng)的MTT法和"Cr(鉻-51)殺傷試驗，檢測CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。其中rAAV/AFP感染的DC所誘導(dǎo)的CTL的腫瘤細(xì)胞殺傷率統(tǒng)計結(jié)果如圖9所示，本發(fā)明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤相關(guān)抗原AFP及其突變型基因的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL能夠更有效地裂解(殺傷)腫瘤細(xì)胞，殺傷率可達(dá)50%以上。以AFP抗原陰性的宮頸癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和肺腺癌為對照，再用上述相同的方法檢測步驟一中被rAAV(rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)感染的DC所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性。其中，被rAAV/AFP感染的DC所誘導(dǎo)的CTL的腫瘤細(xì)胞殺傷特異性檢測結(jié)果如圖9所示，被本發(fā)明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤相關(guān)抗原-AFP及其突變型的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL對AFP抗原陰性癌細(xì)胞無殺傷作用，證明本發(fā)明構(gòu)建和制備的攜帶腫瘤相關(guān)抗原-AFP及其突變型基因的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL具有抗原特異性，即對抗原陰性的細(xì)胞無殺傷作用。上述檢測結(jié)果表明，被本發(fā)明攜帶腫瘤相關(guān)抗原AFP及其突變型基因的rAAV感染的DC(統(tǒng)稱為rAAV-DC)所誘導(dǎo)的CTL對肝癌等AFP抗原陽性的惡性腫瘤具有較好的療效，可用于制備抗腫瘤藥物。實施例4、腫瘤治療的臨床實驗一、療效及存活時間檢測應(yīng)用重組腺相關(guān)病毒-樹突狀細(xì)胞技術(shù)，即將實施例3中被本發(fā)明rAAV(rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP和rAAV/CmAFP)中的一種或兩種感染的DC(rAAV-DC)所誘導(dǎo)的CTL回輸8例肝癌患者，輸注量為1X109-5X109。治療療程通常為6個月，每月2-3次，病情改善后可減為每月1-2次，進(jìn)一步可減為每l-3月治療一次。治療效果(rAAV-DC治療后的反應(yīng))統(tǒng)計結(jié)果如表l所示(B:血清腫瘤標(biāo)志物減少或消失。Q:病人生活質(zhì)量改善。如疼痛減輕或消失，食欲增加等等。C:CTorPET-CT顯示癌癥病灶或轉(zhuǎn)移病灶明顯減小或消失。)，不良反應(yīng)多數(shù)病例治療后短時間內(nèi)會出現(xiàn)輕度流感樣反應(yīng)，但病人均能承受，且癥狀短期內(nèi)消失，沒有觀察到嚴(yán)重不良反應(yīng)及毒性反應(yīng)。療程及生存時間統(tǒng)計結(jié)果如表2所示(治療后已存活時間病人開始接受rAAV-DC治療后的存活時間(已經(jīng)死亡病例計算至死亡時)。)，死亡病例均非因rAAV-DC治療引起，本組病人大多數(shù)處于癌癥終末期，部分病人已經(jīng)因過度放化療造成免疫功能、肝腎功能衰竭。上述統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)一步證明，被本發(fā)明的rAAV感染的DC(統(tǒng)稱為rAAV-DC)所誘導(dǎo)的CTL在患者體內(nèi)能夠發(fā)揮一定的療效，可有效地抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長或者殺滅腫瘤細(xì)胞，且安全性較高，可用于制備抗腫瘤藥物。表l用重組腺相關(guān)病毒-樹突狀細(xì)胞技術(shù)(rAAV-DC)治療8例肝癌患者的療效的統(tǒng)計結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>二、腫瘤患者治療前后影像學(xué)方面和血清腫瘤標(biāo)志物方面的變化情況A、腫瘤患者治療前后影像學(xué)方面的變化情況對步驟一中的8例肝癌患者治療前后轉(zhuǎn)移病灶變化情況進(jìn)行影像學(xué)觀測，結(jié)果經(jīng)本發(fā)明rAAV(rAAV/LMP-1、rAAV/AmLMP-1、rAAV/BmLMP-l和rAAV/CmLMP-1)中的一種或兩種感染的DC(rAAV-DC)所誘導(dǎo)的CTL治療后，患者的轉(zhuǎn)移病灶明顯消失，進(jìn)一步證明，被本發(fā)明的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL在患者體內(nèi)可有效地抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長或者殺滅腫瘤細(xì)胞，可用于制備抗腫瘤藥物。B、治療前后患者血清中腫瘤相關(guān)抗原水平的變化情況檢測步驟一中的8例肝癌患者治療前后血清中腫瘤相關(guān)抗原AFP的水平(數(shù)據(jù)來源于實驗醫(yī)院的檢測結(jié)果)。其中，四例經(jīng)rAAV/AFP感染的DC所誘導(dǎo)的CTL治療前后肝癌患者血清中AFP腫瘤相關(guān)抗原水平的變化情況如圖10所示，結(jié)果經(jīng)本發(fā)明rAAV(rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP和rAAV/CmAFP)中的一種或兩種感染的DC(rAAV-DC)所誘導(dǎo)的CTL治療后，其血清中腫瘤相關(guān)抗原AFP水平均明顯下降，表明患者體內(nèi)瘤負(fù)荷量明顯降低(腫瘤細(xì)胞明顯減少)，進(jìn)一步證明，被本發(fā)明的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL在患者體內(nèi)可有效地抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長或者殺滅腫瘤細(xì)胞，可用于制備抗腫瘤藥物。權(quán)利要求1、一種AFP重組腺相關(guān)病毒載體，是將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因替換為甲胎蛋白AFP基因或其突變型基因得到的重組腺相關(guān)病毒載體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的AFP重組腺相關(guān)病毒載體，其特征在于將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的p5啟動子替換為巨噬細(xì)胞病毒啟動子、beta肌動蛋白啟動子和SV40病毒啟動子中的一個或幾個啟動子。3、一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述AFP重組腺相關(guān)病毒載體的方法，是先將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因剔除，再用甲胎蛋白AFP基因或其突變型基因取代該剔除基因，得到重組腺相關(guān)病毒載體。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法還包括將所述重組腺相關(guān)病毒載體中的p5啟動子替換為巨噬細(xì)胞病毒啟動子、beta肌動蛋白啟動子和SV40病毒啟動子中的一個或幾個啟動子的步驟。5、與權(quán)利要求1所述AFP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品，包括重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒、重組腺相關(guān)病毒顆粒和被重組腺相關(guān)病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于所述細(xì)胞系包括單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系和T淋巴細(xì)胞系。7、權(quán)利要求1或2所述的AFP重組腺相關(guān)病毒載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。9、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為肝癌。10、一種體外殺滅腫瘤的方法，包括以下步驟1)將腫瘤所在體系中自然產(chǎn)生的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞被權(quán)利要求1或2所述的攜帶野生型甲胎蛋白AFP基因的重組腺相關(guān)病毒載體和/或攜帶突變型甲胎蛋白AFP基因的重組腺相關(guān)病毒載體感染或轉(zhuǎn)染，或被權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品處理，各自得到處理后的細(xì)胞；2)將步驟1)中處理后的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或?qū)⑽幢惶幚淼腡淋巴細(xì)胞與所述處理后的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)形成抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，再將該抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤；或?qū)⒈惶幚淼腡淋巴細(xì)胞和未被處理的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤。全文摘要本發(fā)明公開了一種AFP重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法與其應(yīng)用。該AFP重組腺相關(guān)病毒載體是將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)基因替換為AFP基因或其突變型基因得到的重組腺相關(guān)病毒載體。本發(fā)明的AFP重組腺相關(guān)病毒載體可將其攜帶的野生型或突變型的AFP基因輸送入單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系中，攜帶有這些特異性抗原基因的細(xì)胞被用于刺激免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞。實驗證明，被本發(fā)明的rAAV感染的DC所誘導(dǎo)的CTL在患者體內(nèi)可有效地抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長或者殺滅腫瘤細(xì)胞，因而，本發(fā)明的AFP重組腺相關(guān)病毒載體或與本發(fā)明AFP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品可被用于制備治療肝癌藥物。文檔編號A61K48/00GK101255441SQ20081009322公開日2008年9月3日申請日期2008年4月23日優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日發(fā)明者保羅·L·赫蒙納特,勇劉申請人:廣州博沃津生物技術(shù)有限公司