本發(fā)明涉及動物病毒基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒2型重組腺病毒的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

腺病毒具有易感性強、致病力低、宿主范圍廣、穩(wěn)定性好、病毒滴度高、易于濃縮和貯存、介導基因轉(zhuǎn)移效率高和能容納較大基因片段等優(yōu)點，而且其生物學背景已研究得相當清楚，因而腺病毒載體在疫苗制備中被廣泛研究和應用，是最有前途的載體之一，但是腺病毒本身也有一些缺點限制了它的應用。

腺病毒載體作為一種疫苗載體，其最大的問題是機體針對載體的免疫反應過強，現(xiàn)在有幾種策略來解決這個問題,這些策略包括：1.化學法，即用聚乙二醇等化學試劑包裹腺病毒，屏蔽其抗原表位，從而逃逸宿主的免疫作用，但此類方法難以獲得高滴度的病毒，在實際應用過程中有較大難度；2.采用基因工程的方法對腺病毒進行修飾，包括構(gòu)建嵌合體修飾的腺病毒衣殼、構(gòu)建嵌合型的腺病毒和將基于5型人腺病毒的疫苗完全替換為其他稀有的(來自人類或非人類的)腺病毒血清型；3.利用一些細胞因子(IL-2、IFN-γ和IL-18等)與目的基因一起表達，發(fā)揮細胞因子分子佐劑的功能，從而提高重組腺病毒載體的免疫原性。

通過提高抗原基因的表達，降低腺病毒疫苗免疫劑量，達到降低 載體自身免疫反應，增強疫苗免疫效果的目的。提高抗原基因的表達策略之一是對載體骨架調(diào)控元件的優(yōu)化。人巨細胞病毒(human cytomegalovirus,hCMV)第一內(nèi)含子(human cytomegalovirus first intron,Intron A)作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，與hCMV啟動子/增強子(Promoter/Enhancer)一同提高缺失內(nèi)含子的目的基因的表達。內(nèi)含子可能通過幾種不同機制來提高基因表達效率，這些機制通常分為兩類：一類是保護機制；另一類是增強機制。保護機制強調(diào)內(nèi)含子的保護能力，認為內(nèi)含子的某些序列能夠通過自身的折疊或者結(jié)合其他蛋白形成一種二級結(jié)構(gòu)從而達到穩(wěn)定初級轉(zhuǎn)錄本的作用。另外內(nèi)含子序列還可以作為RNA保護因子的靶序列來穩(wěn)定初級轉(zhuǎn)錄本，間接增加mRNA核內(nèi)穩(wěn)定性，導致細胞質(zhì)中積累更多的成熟mRNA，從而增強目的基因的表達效率。而增強機制則強調(diào)內(nèi)含子的促進轉(zhuǎn)錄能力，某些內(nèi)含子有這樣一些序列，能夠起到類似增強子或其他順式調(diào)控元件的功能，它們同某些蛋白質(zhì)結(jié)合，影響其轉(zhuǎn)錄的起始和延伸，從而開放染色體的功能域。

另外文獻報道，土撥鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)能通過提高mRNA穩(wěn)定性、3’端加工、促進mRNA出細胞核和細胞質(zhì)中mRNA的積累來增強未經(jīng)剪接的基因表達。

豬圓環(huán)病毒可引起豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus disease,PCVD)或豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾病(porcine circovirus-associated disease, PCVAD)，如引起仔豬的傳染性先天性震顫和斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)等多種疾病。1991年加拿大首次暴發(fā)該病，隨后許多國家和地區(qū)都報道了該病，其已給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。1978年德國學者Tischer首次從豬腎傳代細胞系PK-15細胞中分離到該病毒，并于1982將其命名為圓環(huán)病毒，隨后經(jīng)血清學調(diào)查發(fā)現(xiàn)在德國、加拿大、新西蘭、英國、北愛爾蘭和美國等國家的豬群中抗體陽性率很高，其中1997年Clark從加拿大西部患有PMWS的豬群中分離到一種新的病毒，該病毒與PK-15細胞中圓環(huán)病毒相似，并命名為豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)。

PCV2重組腺病毒載體疫苗已經(jīng)有學者進行相關(guān)研究，但是還沒有相應的商品化疫苗，分析其原因是腺病毒載體本身蛋白引起的免疫反應會嚴重影響機體針對PCV2Cap的免疫應答。

本發(fā)明將Intron A和WPRE引入到重組腺病毒載體中，提高PCV2Cap表達量，以降低重組腺病毒免疫劑量，減弱腺病毒自身的免疫反應。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對腺病毒表達系統(tǒng)的不足，提供一種優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒2型重組腺病毒的構(gòu)建方法，以提高Cap表達量，從而降低腺病毒使用劑量，減弱腺病毒自身的免疫反應。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下技術(shù)方案：

一種優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒2型重組腺病毒的構(gòu)建方法，將Intron A和WPRE加入到腺病毒穿梭載體中，完成重組腺病毒的構(gòu)建。

作為一種改進方案，所述重組腺病毒的構(gòu)建具體包括如下步驟：

S1依次將Intron A、Cap和WPRE編碼基因連接到載體pUC57，測序鑒定，命名為pUC-Intron A-Cap-WPRE；

S2將IntronA、Cap和WPRE連接到pShuttle-CMV。用Xho I和EcoR V雙酶切pUC-Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，然后連接Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，轉(zhuǎn)化DH5a，挑菌、搖菌、提質(zhì)粒，PCR鑒定和單雙酶切鑒定正確后，送測序，測序正確后，命名為PS-Intron A-Cap-WPRE；

S3將構(gòu)建好的PS-Intron A-Cap-WPRE用限制性內(nèi)切酶Pme I線性化后電轉(zhuǎn)BJ5183與其中的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進行重組，挑菌、搖菌、提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Pac I單酶切鑒定；

S4鑒定正確后用試劑盒提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Pac I線性化后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細胞，當細胞病變出現(xiàn)時，收集細胞，離心后將沉淀重懸于PBS；

S5反復凍融3次后，離心取上清，此病毒即為原種腺病毒，命名為rAd-Intron A-Cap-WPRE。

進一步的改進方案

作為一種進一步的改進方案，所述步驟S3中，電轉(zhuǎn)條件為200Ω,2.5kV,25μF。

作為一種進一步的改進方案，所述步驟S3中，用限制性內(nèi)切酶 Pac I線性化的條件為37℃，2h。

作為一種進一步的改進方案，所述步驟S3中，挑取單克隆的方法是：電轉(zhuǎn)化后，涂瓊脂板時，同時設(shè)立5個梯度的涂菌量，分別為20μL、40μL、60μL、80μL和100μL菌量，在37℃細菌培養(yǎng)箱中放置18h，挑取單克隆菌落，單克隆菌落大小約為中等的菌落，太大或太小均不能挑取，每個梯度挑取10個單克隆重復，共計50個單克隆。

作為一種進一步的改進方案，所述步驟S4中，轉(zhuǎn)染HEK293A細胞方法按照優(yōu)化后的Lipofectamine^TM2000轉(zhuǎn)染程序進行轉(zhuǎn)染。具體轉(zhuǎn)染方法如下：(1)將DNA質(zhì)粒溶于50μL無血清無抗生素的Medium培養(yǎng)液中，輕輕混勻，并在室溫下孵育5min；(2)將適量Lipofectamine^TM 2000溶于50μL無血清無抗生素的Medium培養(yǎng)液中，混勻并在室溫下孵育5min；(3)將上述兩種混合物混合(總體積100μL)，輕輕混勻，在室溫下孵育20min(不能出現(xiàn)霧狀沉淀)；(4)上述操作同時，將待轉(zhuǎn)染細胞用PBS清洗兩次，在每孔(24孔板)中加入100μL無血清無抗生素的Medium培養(yǎng)液，待DNA質(zhì)粒/Lipofectamine復合物混合20min后，立即加入待轉(zhuǎn)染細胞孔中，并混勻，然后將細胞于37℃，5％CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約4h后更換為含2％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，并定期用顯微鏡觀察細胞生長情況。

作為一種進一步的改進方案，所述步驟S4中，細胞病變指細胞 腫脹、變圓、脫落，但形態(tài)完整。

作為一種進一步的改進方案，所述步驟S5中，離心的條件為3000g，10min。

本發(fā)明公開的一種優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒2型重組腺病毒的構(gòu)建方法，具有以下有益效果：

1.hCMV Intron A作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，與hCMV啟動子/增強子(Promoter/Enhancer)一起提高缺失內(nèi)含子的目的基因表達。

2.WPRE能通過提高mRNA穩(wěn)定性、3’端加工、促進mRNA出細胞核和細胞質(zhì)中mRNA的積累來增強未經(jīng)剪接的目的基因的表達。

3.Intron A和WPRE克隆到腺病毒穿梭載體中，可以提高PCV2Cap表達量，降低腺病毒免疫劑量和腺病毒自身載體免疫反應。

附圖說明

圖1是重組腺病毒穿梭載體改造示意圖；

圖2是PS-Intron A-Cap-WPRE PCR鑒定圖，其中：1：Intron-Cap-WPRE；2：陰性對照；3：2K Plus Marker

圖3是重組腺病毒rAd-Intron A-Cap-WPRE感染HEK293A細胞48h對比照片，其中：A為rAd-Intron A-Cap-WPRE感染HEK293A細胞；B為正常細胞對照；

圖4重組腺病毒rAd-Intron A-Cap-WPRE感染豬PK-15細胞后Cap表達顯著升高，其中：1為rAd-Cap；2為rAd-Intron A-Cap-WPRE；β-actin為內(nèi)參蛋白；

圖5低劑量的rAd-Intron A-Cap-WPRE感染豬PK-15細胞可達到 高劑量的rAd-Cap感染豬PK-15細胞后Cap的表達水平，并顯著降低載體蛋白的表達，其中：1為rAd-Cap(感染劑量為20MOI)；2為rAd-Intron A-Cap-WPRE(感染劑量為2MOI)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例并參照附圖對本發(fā)明作進一步描述。

一種優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒2型重組腺病毒的構(gòu)建方法，將Intron A和WPRE加入到腺病毒穿梭載體中，完成重組腺病毒的構(gòu)建。

具體來說，所述重組腺病毒的構(gòu)建具體包括如下步驟：

S1依次將Intron A、Cap和WPRE編碼基因連接到載體pUC57，測序鑒定，命名為pUC-Intron A-Cap-WPRE；

S2將IntronA、Cap和WPRE連接到pShuttle-CMV。用Xho I和EcoR V雙酶切pUC-Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，然后連接Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，轉(zhuǎn)化DH5a，挑菌、搖菌、提質(zhì)粒，PCR鑒定和單雙酶切鑒定正確后，送測序，測序正確后，命名為PS-Intron A-Cap-WPRE；

S3將構(gòu)建好的PS-Intron A-Cap-WPRE用限制性內(nèi)切酶Pme I線性化后電轉(zhuǎn)BJ5183與其中的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進行重組，挑菌、搖菌、提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Pac I單酶切鑒定；

S4鑒定正確后用試劑盒提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Pac I線性化后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細胞，當細胞病變出現(xiàn)時，收集細胞，離心后將沉淀重懸于PBS；

S5反復凍融3次后，離心取上清，此病毒即為原種腺病毒，命名為rAd-Intron A-Cap-WPRE。

本發(fā)明中，所述步驟S4中，轉(zhuǎn)染HEK293A細胞方法按照優(yōu)化后的Lipofectamine^TM2000轉(zhuǎn)染程序進行轉(zhuǎn)染。具體轉(zhuǎn)染方法如下：(1)將DNA質(zhì)粒溶于50μL無血清無抗生素的Medium培養(yǎng)液中，輕輕混勻，并在室溫下孵育5min；(2)將適量Lipofectamine^TM 2000溶于50μL無血清無抗生素的Medium培養(yǎng)液中，混勻并在室溫下孵育5min；(3)將上述兩種混合物混合(總體積100μL)，輕輕混勻，在室溫下孵育20min(不能出現(xiàn)霧狀沉淀)；(4)上述操作同時，將待轉(zhuǎn)染細胞用PBS清洗兩次，在每孔(24孔板)中加入100μL無血清無抗生素的Medium培養(yǎng)液，待DNA質(zhì)粒/Lipofectamine復合物混合20min后，立即加入待轉(zhuǎn)染細胞孔中，并混勻，然后將細胞于37℃，5％CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約4h后更換為含2％FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，并定期用顯微鏡觀察細胞生長情況。

請參見圖1。圖1是腺病毒穿梭載體PS-Intron A-Cap-WPRE構(gòu)建示意圖。Intron A基因插入到Cap基因的上游，WPRE基因插入到Cap基因的下游。啟動子為CMV啟動子，多聚腺苷酸信號為SV40poly。

請參見圖2。圖2是PS-Intron A-Cap-WPRE PCR鑒定圖。將Intron A-Cap-WPRE連接到pShuttle-CMV穿梭載體上，轉(zhuǎn)化入DH5α，挑菌、搖菌和提質(zhì)粒，用提取的質(zhì)粒為模板，進行PCR，鑒定重組質(zhì)粒 是否構(gòu)建成功。

請參見圖3。圖中A：rAd-Intron A-Cap-WPRE；B：正常細胞對照。將在BJ5183中重組成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入HEK293A細胞中進行包裝，約7～10d出現(xiàn)細胞病變效應，兩圖分別是重組腺病毒和對照感染細胞后的細胞病變圖。

請參見圖4。重組腺病毒rAd-Intron A-Cap-WPRE感染豬PK-15細胞后，Cap表達顯著升高；

請參見圖5。低劑量的rAd-Intron A-Cap-WPRE感染豬PK-15細胞可達到高劑量的rAd-Cap感染豬PK-15細胞后Cap的表達水平，并顯著降低載體蛋白的表達。

綜上所述，本發(fā)明提供了提高了Cap的表達量，從而降低腺病毒使用劑量，減少腺病毒自身蛋白表達量。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的前提下，還可以對本發(fā)明做出的若干改進和補充，這些改進和補充，也應視為本發(fā)明的保護范圍。