一種攜帶kal基因重組腺相關(guān)病毒載體的基因治療藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種利用重組腺相關(guān)病毒載體的基因治療藥物。
【背景技術(shù)】
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[0002]目前在我國，肺癌是危害人民健康的惡性腫瘤之一，標準化放、化療治療的肺癌患者，平均生存期為28.7個月，是威脅病人生命的頭號殺手！隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，基因藥物逐漸成為人們關(guān)注的一種新治療手段。所說基因藥物，是指利用基因序列數(shù)據(jù)，經(jīng)生物信息學(xué)分析、高通量基因表達、高通量功能篩選和體內(nèi)外藥效學(xué)研究開發(fā)得到新藥候選物。Kallistatin(KAL)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,能特異性與血衆(zhòng)型激肽釋放酶結(jié)合而不與組織型激肽釋放酶結(jié)合的蛋白，存在于多種組織和體液中，是人體內(nèi)源性血管生長抑制因子，具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤等作用。目前，多個實驗室開展了 KAL的抗腫瘤實驗研究，涉及的腫瘤包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌和肺癌等。雖然已有報道稱，利用kallistatin蛋白或者含有kallistatin基因的質(zhì)粒針對肺部腫瘤的治療,不過,存在半衰期較短、需要短期內(nèi)高劑量持續(xù)給藥等問題困惑，因此迫切需要尋找一種肺癌靶向的、能長效表達的載體，用于攜帶kallistatin基因，更好地發(fā)揮治療肺癌的作用。
[0003]為了更好地解決上述問題，本實驗室選用了具有廣泛宿主范圍、能夠介導(dǎo)外源基因長期表達、安全性能好、在人類沒有致病性、可以轉(zhuǎn)染分裂或者非分裂的哺乳動物細胞并有肺部靶向的9型重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV9) [Michelfelder, S.等，PLoS One,2011,6(8):e23101 ；Zincarelli, C.等，Mol Ther, 2009, 16(6):1073-1080 ；Bell, C.L.等，JClin Invest, 2011，121(6):2427-2435 ；ffalia, J.S.Mol Ther.2015,, 2(3):414-422]。本發(fā)明所述將rAAV9載體攜帶kallistatin的cDNA，腹腔注射到人肺癌荷瘤鼠體內(nèi)，以PBS為陰性對照，以順鉬為陽性對照，觀察49天，發(fā)現(xiàn)rAAV9-KAL能明顯抑制腫瘤的增殖。本發(fā)明提供的治療肺癌基因藥物rAAV9-KAL，迄今尚未見有國內(nèi)外的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明提供的肺癌治療基因藥物(rAAV9_KAL)，包括以下步驟:
[0005](I)基因重組質(zhì)粒是含kallistatin的cDNA基因，基因表達框兩端為AAV2血清型的末端反向重復(fù)序列(inverted ter min al repeat, ITR)、牛生長激素poly A兀件(bovine growth hormone polyadenylat1n signal, BGH poly A),其中還含有氨節(jié)青霉素選擇元件AMP, 土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元素WPRE(Woodchuck hepatitisPost-transcript1nal Regulatory Element)增強子，CAG chicken β-actin promoter 啟動子。載體質(zhì)粒是血清型AAV2的基因，AAV9的cap基因。
[0006](2)三質(zhì)粒磷酸鈣轉(zhuǎn)染法生產(chǎn)rAAV9-KAL，采用CHT色譜聯(lián)合ANX色譜進行純化。
[0007](3)建立肺癌荷瘤鼠模型，采用腹腔注射形式進行給藥，每周觀察記錄腫瘤大小，7周后通過腫瘤體積,重量以及kallistatin蛋白表達情況，評價rAAV9_KAL的抗腫瘤效果。
[0008]其中:所述肺癌治療用rAAV9-KAL劑量，選自I X 102VG/mL到I X 1016VG/mL的任意一個；給藥途徑適用腹腔注射、靜脈注射、瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、口服等。
[0009]本發(fā)明所述的rAAV基因藥物，不僅可以治療移植性肺癌，也可以用于原位肺癌。
[0010]本發(fā)明所述的rAAV基因藥物，可以用于肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤。
[0011]本發(fā)明所述的rAAV基因藥物，不僅適用于rAAV9型載體，也適用于其他血清型載體 rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12
坐寸ο
[0012]本發(fā)明所述的rAAV基因藥物，不僅適用于單鏈rAAV載體，也適用于雙鏈rAAV載體。
【附圖說明】
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[0013]圖1.不同血清型rAAV-KAL的體外抗腫瘤作用
[0014]圖2.不同給藥途徑的kallistatin蛋白表達量
[0015]圖3.不同血清型rAAV-KAL對皮下移植腫瘤作用
[0016]圖4.單雙鏈rAAV-KAL抗腫瘤作用
[0017]圖5.不同劑量rAAV9_KAL的抗腫瘤作用
[0018]圖6.KAL蛋白在各個器官的表達分布情況
[0019]圖7.肺和腫瘤組織KAL的免疫組化染色
[0020]圖8.組織HE染色
[0021]圖9.小鼠血清生化分析
[0022]實施方案:
[0023]以下實施例僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0024]《實施例1》體外抗腫瘤試驗
[0025]胰酶消化匯合度為60%-70%的細胞，每孔加入10yL 5X 14個/mL細胞于96孔板，同時以10yL的空白培養(yǎng)基做為空白對照；12h后，細胞貼壁，按照MOI = 10000加入 rAAVl-KAL、rAAV2_KAL、rAAV5_KAL、rAAV6_KAL、rAAV8_KAL 和 rAAV9_KAL 進行感染，48h后測定；每孔加入1ul的CCK-8溶液；在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育Ih后在450n m測定吸光度值。按照細胞增殖率(％) = (1-試驗組0D450/對照組0D450)X100%，計算腫瘤細胞增殖抑制率。從數(shù)據(jù)分析可知，幾種rAAV載體均能有效轉(zhuǎn)染H446細胞，其中2，5,9型抑制作用較好(見圖1A)。
[0026]《實施例2》KAL蛋白的體外表達試驗
[0027]胰酶消化匯合度為60%-70%的細胞，每孔加入10yL I X 15個/mL細胞于96孔板，同時以10yL的空白培養(yǎng)基做為空白對照；12h后，細胞貼壁，按照MOI = 10000加入 rAAVl-KAL、rAAV2_KAL、rAAV5_KAL、rAAV6_KAL、rAAV8_KAL 和 rAAV9_KAL 進行感染，3 個復(fù)孔，培養(yǎng)72h，收集細胞培養(yǎng)上清，采用ELISA方法，測定細胞上清液中的KAL蛋白表達情況。所有的血清型載體均能轉(zhuǎn)染H446細胞，但是，從KAL蛋白表達量看，rAAV2和rAAV9的效果最好(見圖1B)。
[0028]《實施例3》體內(nèi)給藥途徑試驗
[0029]7-8周的清潔級Km小鼠，適應(yīng)性生長7天后，隨機分成5組，每組3只，分別為:正常組(Normal),靜脈注射組(intravenous inject1n, 1.V.),腹腔注射組(intraperitoneal inject1n, 1.P.),肌肉注身寸組(intramuscular inject1n, 1.Μ.)和皮下注射組(Intracutaneous inject1n, 1.C.)。按照 5 X 111VG/ 只給藥，每只 100 μ L,分別在當(dāng)天、ld、3d之后，每周尾靜脈取血，7周后眼眶取血脫臼處死，測定血清中KAL蛋白表達情況。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，不同給藥途徑，KAL蛋白的表達量不同，在1-1Sd的蛋白表達量上比較，1.V.>1.P.>1.Μ>1.H.(圖2A)。其中，腹腔注射給藥的載體蛋白表達效率是靜脈給藥的80%左右，蛋白表達趨勢是一致的(圖2B)。
[0030]《實施例4》人肺癌裸鼠移植瘤模型的體內(nèi)抗腫瘤試驗
[0031](I)培養(yǎng)的H446人肺癌細胞