一種復制缺陷型人55型腺病毒載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復制缺陷型人55型腺病毒載體及其制 備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺病毒（Adenovirus，Ad)是雙鏈DNA病毒，其基因組長度約35-40kb。已知人腺病 毒分為7個亞群（A~G)，包括60多個血清型，其中B亞群中的3、4、7、14型腺病毒感染后 可引起急性呼吸道疾病甚至致死性肺炎。近年來，出現(xiàn)了由11、14型腺病毒重組產(chǎn)生的55 型腺病毒（以下簡稱Ad55)，已導致一系列社區(qū)獲得性肺炎疫情甚至死亡病例。但是，尚無 抗Ad55感染的特效藥物及疫苗，臨床上只能采取支持性治療。因此，研發(fā)抗Ad55的疫苗及 藥物，對于控制Ad55在廣大人群尤其是入伍新兵、青少年學生等人群中的傳播至關(guān)重要。
[0003]目前，抗腺病毒感染的疫苗僅在美國軍隊獲得使用。該疫苗為野生型Ad4、Ad7在 人胚腎二倍體成纖維細胞上傳代，經(jīng)冷凍脫水、混和纖維素乳糖等制成的腸溶型膠囊，為口 服活病毒疫苗。該疫苗的使用有效遏制了美軍腺病毒感染疫情的爆發(fā)。但是，美軍使用的 腺病毒疫苗尚存在極大的缺陷，一方面，該疫苗主要預防Ad4、Ad7的感染，而對致病力極強 的Adl4、Ad55等無確切的預防效果；另一方面，該疫苗主要成分為野生型腺病毒，安全性較 差，殘余活病毒從腸道排出后極易污染水源，造成病毒的擴散，因而不能應(yīng)用于普通人群。 因此，研制安全性高并能預防Ad55等強毒株的復制缺陷型腺病毒疫苗是迫在眉睫的需求。
[0004] 已有研宄顯示，腺病毒E1基因是其復制增殖的必需基因，E3基因則可以對抗宿主 的免疫系統(tǒng)。敲除El、E3基因后，腺病毒在正常人體內(nèi)喪失復制能力，具有減毒表型，而其 主要的表面抗原如Hexon、Fibre等則不受影響。因此，采用復制缺陷的腺病毒作為疫苗可 有效提升其安全性，擴大其使用范圍。復制缺陷型腺病毒可在互補細胞株，如表達Ad5El基 因的293細胞、PerC6細胞中生產(chǎn)。但是，很多腺病毒尤其是B亞群腺病毒，敲除El、E3基 因后在這些生產(chǎn)細胞株中難以獲得有效產(chǎn)量，主要原因是Ad5ElB 55K不能與B亞型腺病毒 E40rf6相互作用，不能有效抑制宿主細胞mRNA的出核并提升病毒晚期蛋白的表達。
[0005] 復制缺陷型Ad55還可作為基因載體在基因治療、疫苗等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。腺病 毒載體在這些領(lǐng)域具有一系列優(yōu)勢，如良好的安全性、基因轉(zhuǎn)導的有效性以及方便的大規(guī) 模生產(chǎn)能力等?；谶@些優(yōu)勢，全球范圍內(nèi)已有數(shù)百項臨床試驗以腺病毒作為基因載體，居 各類載體之首（24.8%)。這些研宄大部分采用Ad5或Ad2作為載體。然而，多數(shù)人體內(nèi) 由于既往腺病毒感染而產(chǎn)生的抗腺病毒免疫反應(yīng)限制了傳統(tǒng)腺病毒載體的應(yīng)用。研宄表 明非洲、南美及我國等發(fā)展中國家和地區(qū)的人群中Ad2、Ad5中和抗體陽性率很高，甚至超 過90%。這些中和抗體會抑制腺病毒載體進入機體細胞，使其難以行使免疫或治療功能。 為克服預存抗腺病毒免疫反應(yīng)，研宄者已開發(fā)一系列技術(shù)如：1)采用免疫抑制劑如環(huán)孢霉 素、環(huán)磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反應(yīng)；2)修飾或改造腺病毒載體表面蛋白，繞開 預存中和抗體；3)我們此前開發(fā)的以腺病毒體外感染PBMC然后自體回輸?shù)腁VIP技術(shù)；等 等。但是這些策略或者具有相當高的毒副作用（如免疫抑制劑），或者僅能使用一次即因產(chǎn) 生針對新載體的免疫反應(yīng)而不能繼續(xù)重復使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，提供一種復制缺 陷型人55型腺病毒載體。
[0007] 本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以解決：
[0008] -種復制缺陷型人55型腺病毒載體，由如下方法制備得到：通過敲除Ad55的E1、 E3基因，再將Ad55基因組中的E4基因開放閱讀框6或開放閱讀框2、3、4、6、6/7改換為Ad5 基因組的相應(yīng)閱讀框。
[0009] 優(yōu)選地，所述的復制缺陷型人55型腺病毒載體，還在Ad55的E1基因區(qū)域整合外 源基因表達框。
[0010] 一種復制缺陷型人55型腺病毒載體的制備方法，包含如下步驟：
[0011] S1.PCR擴增Ad55El區(qū)同源重組臂并反向連接至卡那霉素抗性載體，線性化后與 經(jīng)部分酶切線性化的pAd55 A E3同源重組，得到基因組質(zhì)粒pAd55 A El A E3-Kana ;
[0012] S2.PCR擴增Ad55El區(qū)同源重組臂并同向連接至卡那霉素抗性載體，線性化后與 線性化的pAd55 A El A E3_Kana同源重組，得到基因組質(zhì)粒pAd55 A El A E3;
[0013] S3. PCR 擴增 Ad5E40rf2-6、Ad55E4 基因，以 Ad5E40rf2-6 取代 Ad55E4 基因中相 應(yīng)區(qū)域得到P55E4 (5E4)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3同源重組，得到基因組質(zhì)粒 pAd55 AE1 AE3(5E4)；
[0014]S4. PCR擴增Ad5E40rf6，以其取代步驟S3.所述Ad55E4基因的相應(yīng)區(qū)域得 到p55E4 (50rf6)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3同源重組，得到基因組質(zhì)粒 pAd55 AE1 AE3(50rf6)。
[0015] 優(yōu)選地，步驟S1.的具體方法為：
[0016] 以Ad55基因組為模板，PCR擴增得到E1基因同源重組臂L-delEl及R-delEl，酶 切后連接至pVax載體得到pVax-delEl (L+R)，線性化后，與經(jīng)部分酶切線性化的pAd55 A E3 同源重組，經(jīng)氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性篩選得到敲除E1、E3基因并引入唯一酶切位點 Pmel 的基因組質(zhì)粒 pAd55 A El A E3_Kana〇
[0017] 最優(yōu)選地，在其中一個實施例中，步驟SI.的具體方法為：
[0018] 以Ad55基因組為模板，PCR得到E1基因上下游重組臂L-delEl及R-delEl， L-delEl以Spel+EcoRI雙酶切后連接至同樣酶切的pVax載體得到pVax-L-delEl ;R-delEl 以EcoRI+Xbal雙酶切后連接至同樣酶切的pVax-L-delEl得到敲除El基因的穿梭質(zhì)粒 pVax-delEl(L+R)；
[0019] pVax-delEl (L+R)以EcoRI線性化，pAd55 AE3以PacI部分酶切線性化，兩者同源 重組并經(jīng)雙抗性篩選得到基因組質(zhì)粒pAd55 A El A E3_Kana。
[0020] 優(yōu)選地，步驟S2.的具體方法為：
[0021] 以Ad55基因組為模板，PCR擴增得到E1基因同源重組臂L-delK (E1)及 R-delK (E1)，酶切后連接至pVax載體得到pVax-delK (E1)，線性化后與線性化的 pAd55 AE1 AE3-Kana同源重組，得到去除El、E3、卡那霉素基因并引入唯一酶切位點Pmel 的基因組質(zhì)粒pAd55 A El A E3。
[0022] 最優(yōu)選地，在其中一個實施例中，步驟S2.的具體方法為：
[0023] 以Ad55基因組為模板，PCR得到E1基因上下游重組臂L-delK及R-delK，L-delK 以Spel+EcoRI雙酶切后連接至同樣酶切的pVax載體得到pVax-L-delK(El) ;R-delK以 EcoRI+Xbal雙酶切后連接至同樣酶切的pVax-L-delK(El)得到敲除卡那霉素抗性基因的 穿梭質(zhì)粒 pVax-delK(El);
[0024] pVax-delK(El)以 Spel+Xbal 雙酶切線性化，pAd55 AE1 AE3_Kana 以 Pmel 線性 化，兩者同源重組得到去除卡那霉素抗性基因并在原El區(qū)引入唯一酶切位點Pmel的基因 組質(zhì)粒 pAd55AEl AE3。
[0025] 優(yōu)選地，步驟S3.的具體方法為：
[0026] 分別以Ad5、Ad55基因組為模板，PCR擴增得到Ad5E40rf2-6以及Ad55E4,將 Ad55E4連接至T載體得到p55E4,進一步以p55E4為模板PCR去除Ad55E40rf2-6,然后與 Ad5E40rf2-6連接得到p55E4 (5E4)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3同源重組，得到 pAd55 AE1 AE3(5E4) 〇
[0027] 最優(yōu)選地，在其中一個實施例中，步驟S3.的具體方法為：
[0028] 以Ad5、Ad55基因組為模板，PCR擴增得到Ad5E40rf2-6、Ad55E4基因，分別連接至 T載體得到p50rf2-6、p55E4 ;以p55E4為模板，PCR去除Ad55的E40rf2-6并引入SapI位 點，兩者經(jīng)SapI酶切、連接得到p55E4(5E4);
[0029] p55E4(5E4)以 Pmel+Mlul 雙酶切，pAd55 AE1 AE3 以 Psil 酶切，重組得到已將 Ad55E40rf2-6 置換為 Ad5E40rf2-6 的基因組質(zhì)粒 pAd55 A El A E3 (5E4)。
[0030] 優(yōu)選地，步驟S4.的具體方法為：
[0031] 以Ad5基因組為模板，PCR擴增得到Ad5E40rf6,將p55E4經(jīng)PCR去除Ad55E40rf6， 兩者連接得到P55E4 (50rf6)，線性化后與線性化pAd55 A El A E3同源重組，得到 pAd55 AE1 AE3(50rf6)。
[0032] 最優(yōu)選地，在其中一個實施例中，步驟S4.的具體方法為：
[0033]以 p50rf2-6、p55E4 為模板，PCR得到 Ad5E40rf6 并引入 SapI 位點，并在 p55E4 中 去除Ad55E40rf6,兩者經(jīng)SapI酶切連接得到p55E4(50rf6);
[0034] p55E4(50rf6)以 Pmel+Mlul 雙酶切，pAd55 AE1 AE3 以 Psil 雙酶切，重組得到已 將 Ad55E40rf6 置換為 Ad5E40rf6 的基因組質(zhì)粒 pAd55 A El A E3 (50rf6)。
[0035] 一種復制缺陷型人55型腺病毒載體的制備方法，還包含如下步驟：
[0036] S5.以Ad55基因組為模板PCR得到E1區(qū)同源重組臂SE1L、SE1R，酶切 并連接至pVax載體得到pSElLR ;以pGAl-EGFP為模板PCR得到外源基因表達框 CMV-EGFP-BGH，與pSElLR經(jīng)酶切、連接得