病毒載體顆粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種病毒載體顆粒及其構(gòu)建方法和在治 療人類慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 疼痛是對(duì)于實(shí)際的或潛在的損害產(chǎn)生的一種不愉快的感覺和情感體驗(yàn)，是一個(gè)復(fù) 雜的感性經(jīng)驗(yàn)，包括傳達(dá)感官信息的nociceptors(疼痛感受器)對(duì)于如位置、類型和強(qiáng)度的 刺激產(chǎn)生的反應(yīng)。一直以來(lái)疼痛及其治療被視為重要和有趣的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
[0003] 慢性疼痛是組織所造成的傷害，很多時(shí)候伴有神經(jīng)的長(zhǎng)期損傷。慢性疼痛是由于 激活了nociceptors (疼痛接收器）導(dǎo)致nociception (神經(jīng)處理有害刺激），疼痛的感覺 開始于神經(jīng)傳入。中樞系統(tǒng)也發(fā)揮了作用，從而維持疼痛的持久性。
[0004] 神經(jīng)和免疫系統(tǒng)是鏈接外圍炎癥反應(yīng)之間的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞因子在沒有人身 傷害或損壞的情況下可以觸發(fā)疼痛，促進(jìn)炎癥，細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平升高在大腦和脊髓的 外圍神經(jīng)系統(tǒng)（感官神經(jīng)細(xì)胞）造成損害。在外周神經(jīng)受到傷害后，免疫反應(yīng)在背根 Ganglia (DRGs)由macrophages(巨細(xì)胞）、淋巴細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)生。因痛覺感受神經(jīng) 元釋放痛覺遞質(zhì)（P物質(zhì)、CGRP和激素產(chǎn)生的基因相關(guān)肽）從而刺激免疫細(xì)胞，如 macrophages (巨細(xì)胞）、synoviocytes (滑膜細(xì)胞)導(dǎo)致分泌炎性細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-6 〇另一方面，neurodegeneration(神經(jīng)退行性變)造成痛覺多肽P物質(zhì)和降|丐素 CGRP等刺激 免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子?？傊窠?jīng)系統(tǒng)和外周炎癥細(xì)胞建立了一個(gè)惡性循環(huán)的過程。
[0005] 目前治療急性和慢性疼痛依靠三大類的止痛藥物nonsteroidal抗炎藥物 (NSAIDs )、阿片類藥物和ad juvants (抗抑郁藥、抗痙攣藥、當(dāng)?shù)芈樽須怏w、2-adrenoceptor「 一種促效劑」hNSAIDs和阿片類藥物過度使用會(huì)產(chǎn)生副作用（惡心、嘔吐、胃粘膜潰瘍、腎 功能衰竭、肝功能衰竭、呼吸抑制、咳嗽抑制等），甚至涉及神經(jīng)傷害。所以通常需要進(jìn)行劑 量滴定直到足夠劑量但又不會(huì)產(chǎn)生疼痛或不可容忍的副作用。令人遺憾的是，第二種結(jié)果 常常發(fā)生所以必須終止治療，結(jié)果是只有部分程度的疼痛能被消除。
[0006] 近年來(lái)，由于肉毒素的特異性切割SNARE蛋白并抑制過度的痛覺和炎癥因子分泌， 已成功應(yīng)用到治療疾病。根據(jù)肉毒素的血清型共分為7類，A-G，每一類都擁有獨(dú)一無(wú)二的特 點(diǎn)，它們會(huì)選擇性地切割各自的SNARE蛋白底物，比如SNAP-25(突觸小體相關(guān)蛋白）能被肉 毒素 A/C1/E型所切割、syntaxinl (突觸融合蛋白）被肉毒素 C1型、synaptobrevin(小突觸泡 蛋白）能被肉毒素 B/D/F和/G型所切割(表1)。
[0007] 表1肉毒素的血清型和切割位點(diǎn)
目前，小劑量的肉毒素已被成功用作化妝品和骨關(guān)節(jié)肌肉病治療，其持續(xù)作用時(shí)間較 長(zhǎng)(6個(gè)月以上），副作用小。近年來(lái)臨床上又被用于偏頭痛/張力頭痛和肌肉疼痛綜合癥軟 組織疼痛的綜合癥等，注射3個(gè)月的患者還仍能起到鎮(zhèn)痛作用。
[0008] 肉毒素的經(jīng)典作用機(jī)理是抑制肌肉運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿，acetylcholine) 的分泌從而導(dǎo)致肌肉癱瘓，臨床上用作治療肌肉過度緊張。神經(jīng)遞質(zhì)的釋放是一個(gè)多階段 過程，包括突觸小泡和等離子膜之間的融合，從而建立一個(gè)通道，致使突觸小泡中的分泌物 釋放到細(xì)胞外。在神經(jīng)細(xì)胞分泌中，小突觸泡蛋白的C-端位于突觸小泡泡膜，突觸融合蛋 白和通過幾個(gè)半胱氨酸-鏈接棕櫚酰鏈位于細(xì)胞膜的SNAP-25會(huì)形成蛋白復(fù)合體。這種復(fù) 合體新的形成還需要大量涌入的Ca2+激活鈣傳感器突觸結(jié)合蛋白。這一復(fù)合體介導(dǎo)突觸 小泡和細(xì)胞膜的融合從而小泡內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)或細(xì)胞因子被釋放到細(xì)胞外。
[0009] 最近幾年來(lái)，肉毒素也被用作治療長(zhǎng)期疼痛的制劑。因?yàn)榭茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)它們也能 抑制痛覺神經(jīng)遞質(zhì)的傳導(dǎo)，比如CGRP和SP。風(fēng)濕病專家發(fā)現(xiàn)肉毒素不僅治療緊張頭痛/偏 頭痛，在RA(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)和0A(骨關(guān)節(jié)炎)患者中對(duì)其他藥品效果不佳的病人注射這種 毒素到關(guān)節(jié)也能很有效的去除疼痛和發(fā)炎，但是，由于關(guān)節(jié)內(nèi)膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)毒素不 敏感，不具有毒素作用的細(xì)胞受體，所以不能很好的抑制炎癥因子和炎癥因子對(duì)感官神經(jīng) 細(xì)胞的刺激，所以感覺神經(jīng)元仍能分泌痛覺遞質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供一種病毒載體顆粒，對(duì)治療慢性疼痛更有針對(duì)性，可以 阻止神經(jīng)系統(tǒng)和外周細(xì)胞之間的惡性循環(huán)?？蓮V泛應(yīng)用于治療人類慢性疼痛的藥物，尤其 用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎的藥物。
[0011]為解決以上問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 設(shè)-Η種病毒載體顆粒，包括pspax2、pmd2.G和pwpi質(zhì)粒，所述pwpi質(zhì)粒包含啟動(dòng)子、 肉毒素酶活區(qū)以及內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)序列。
[0012] 優(yōu)選的，所述肉毒素酶活區(qū)為A型、B型、C型或D型。
[0013] 優(yōu)選的，所述病毒為慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒中的一種。
[0014] 優(yōu)選的，所述D型肉毒素酶活區(qū)序列的起始編碼序列之前插入有增強(qiáng)表達(dá)序列 ACCATGGGC〇
[0015] 上述病毒載體顆粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1)將細(xì)胞系lenti-x293T的細(xì)胞密度培養(yǎng)至70%; (2) 洗去培養(yǎng)液中的血清，換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基； (3) 將pspax2、pmd2.G和pwpi質(zhì)粒用磷酸|丐轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到lenti-x293T細(xì)胞中； (4) 四小時(shí)后，洗掉轉(zhuǎn)染液，加入含10wt%小牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)； (5) 回收培養(yǎng)液，將細(xì)胞碎片過濾，再進(jìn)行超速離心，即可獲得高滴度的病毒載體顆粒。 [0016] 優(yōu)選的，步驟⑶所述pwpi、pmd2.G和pspax2的轉(zhuǎn)染用量比例為2:1:10。
[0017] 優(yōu)選的，步驟(3)所述轉(zhuǎn)染方法具體包括以下步驟： ①在10mL的Falcon管A中加入288yL 2mol/L的CaCl2溶液，以及pwpi質(zhì)粒10yg、 pmd2.G質(zhì)粒5yg和pspax2質(zhì)粒100yg，補(bǔ)水到2880yL的總體積； '②在10mL的Falcon管B中加入2880yL的2xHBS buffer，再將Falcon管A中液體滴入 Falcon管B，在2~3秒內(nèi)迅速混合均勾； ⑩將所得混合液在室溫下放置15~20分鐘，再滴入長(zhǎng)有l(wèi)enti-x293T細(xì)胞的直徑為 15cm的培養(yǎng)皿中。
[0018] 優(yōu)選的，將所述所述細(xì)胞碎片通過0.45微米過濾器進(jìn)行過濾;所述超速離心的轉(zhuǎn) 速為30000rpm，時(shí)間為2h。
[0019] 本發(fā)明具有以下積極有益效果： 發(fā)明人以膝關(guān)節(jié)病發(fā)時(shí)起關(guān)鍵作用的人類關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和感官神經(jīng)細(xì)胞為 研究對(duì)象，這些細(xì)胞在痛覺和炎癥發(fā)生時(shí)過多的分泌細(xì)胞因子或神經(jīng)多肽，而這些與痛覺 和炎癥相關(guān)的因子需要SNARE蛋白的介導(dǎo)才能分泌。
[0020] (1)本發(fā)明有針對(duì)性的在神經(jīng)和非神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行基因水平的治療，利用病毒靶 向性介導(dǎo)肉毒素的蛋白酶活力到特異細(xì)胞，從而切割SNARE蛋白，以控制炎癥因子的分泌， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肉毒素蛋白酶成功作用，在巨噬細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中阻斷釋放細(xì)胞因子 (TNF-α和IL6)。這對(duì)于現(xiàn)有的鎮(zhèn)痛和抗炎藥物研究有開創(chuàng)性的作用。
[0021] (2)由于關(guān)節(jié)炎和慢性頭疼的發(fā)生系統(tǒng)涉及到神經(jīng)和其外周非神經(jīng)系統(tǒng)，痛覺和 炎癥因子過度分泌，兩種系統(tǒng)之間的惡性循環(huán)和相互作用，只針對(duì)其中一種系統(tǒng)的肉毒素 的治療已現(xiàn)不足，所以本發(fā)明利用復(fù)制缺陷型的病毒靶向性的將肉毒素的酶活區(qū)導(dǎo)入以上 兩種系統(tǒng)，從而利用穩(wěn)定表達(dá)的酶蛋白區(qū)切割炎癥因子分泌的SNARE蛋白，從而有效的減 少炎癥因子的分泌。
[0022] (3)通過慢病毒介導(dǎo)的基因治療與其他傳統(tǒng)抗炎治療相比是一種非常有用的方 法。本發(fā)明由于克隆的大容量和便于生產(chǎn)的高病毒顆粒滴度，達(dá)到了商業(yè)化的含發(fā)夾RNA的 慢病毒和目標(biāo)生物療法。
[0023] (4)由于產(chǎn)生這種基因治療的病毒顆粒同時(shí)需要三個(gè)不同的質(zhì)粒(pspax2、pmd2.G 和pwpi-肉毒素 D型酶活區(qū)基因），加強(qiáng)了對(duì)制造和使用過程中的有效性和安全性。同時(shí)，我 們使用的是自我滅活的病毒顆粒，U3的區(qū)域的5'LTR改為CMV，野生型的啟動(dòng)子和U3的區(qū)域 的3 'LTR (包含TATA框和轉(zhuǎn)錄因子綁定站點(diǎn)）已被刪除。
[0024] (5)體外經(jīng)化學(xué)方法介導(dǎo)肉毒素酶活區(qū)的DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)也能起到切割 SNARE蛋白的作用，而這一方發(fā)不能用于體內(nèi)作用，只能用作培養(yǎng)的細(xì)胞的體外研究。在體 外研究非神經(jīng)元細(xì)胞關(guān)節(jié)細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放的細(xì)胞因子作用中發(fā)現(xiàn)任何一 種血清型的肉毒素蛋白不能進(jìn)入該細(xì)胞，而經(jīng)過本發(fā)明精心設(shè)計(jì)的有針對(duì)性的慢病毒包裝 的新毒素病毒顆?？梢皂樌M(jìn)入這些細(xì)胞并且切割SNARE蛋白底物，這一作用可以達(dá)到用 慢病毒包裝的發(fā)夾RNA( shRNA)進(jìn)行的基因敲除的功效。
[0025] (6)慢病毒顆粒既能感染神經(jīng)又能感染非神經(jīng)細(xì)胞，而且能經(jīng)過定點(diǎn)注射進(jìn)入體 內(nèi)，從而起到在特異性的組織上表達(dá)肉毒素的酶活區(qū)而切割SNARE蛋白。所介導(dǎo)的肉毒素 DNA能表達(dá)毒素活性酶并有效切割神經(jīng)和非神經(jīng)細(xì)胞的痛覺和炎癥因子分泌。
[0026] (7)研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞使用SNAP-23和VAMP3作為介導(dǎo)細(xì)胞炎癥 因子分泌的關(guān)鍵蛋白，但是這些蛋白并不被神經(jīng)細(xì)胞所使用，所以我們可以使用本發(fā)明能 作用到神經(jīng)和非神經(jīng)細(xì)胞SNARE蛋白的慢病毒顆粒。比如產(chǎn)生能切割SNAP-23和SNAP-25 的突變型E酶(Chen et al，PNAS，2009)。另外，由于神經(jīng)細(xì)胞使用的VAMP1、VAMP2,和非神 經(jīng)細(xì)胞所使用的VAMP3可以被B、D、F、G型肉毒素血清型的酶活區(qū)所切割，我們的包裝有這 些酶活區(qū)的慢病毒顆粒當(dāng)進(jìn)入到神經(jīng)和非神經(jīng)細(xì)胞后就能對(duì)這些底物進(jìn)行切割，達(dá)到同時(shí) 對(duì)神經(jīng)和非神經(jīng)細(xì)胞所分泌的遞質(zhì)進(jìn)行有效抑制。
[0027] (8)以肉毒素的D血清型為例，所用慢病毒顆粒屬于retroviridae(逆轉(zhuǎn)錄病毒 科），因?yàn)樗鼈儾荒茏晕覐?fù)制，且其復(fù)制的基因缺失產(chǎn)生的非復(fù)制的粒子慢病毒已被證明能 將調(diào)解轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的治療基因（transgenes)轉(zhuǎn)到多種細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì) 胞、淋巴細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞（jurgens et al，2012)。此外，使用在活體外細(xì)胞介導(dǎo)，慢病毒顆 ?？捎兄谠诨铙w內(nèi)提供基因表達(dá)。此外，慢病毒顆粒可長(zhǎng)期支持轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)，與其 他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒引導(dǎo)程序不同，慢病毒顆粒為我們提供了一種更長(zhǎng)期的治療和控制慢性疾 病的臨床手段（tiscornia et al,2006; jurgens et al,2012)。
【附圖說(shuō)明】 [0028] 圖1為實(shí)施例1病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功指示信號(hào)熒光蛋白-GFP; 圖2為實(shí)施例1的肉毒素 D型酶切割滑膜細(xì)胞VAMP3、阻礙SW982釋放炎癥細(xì)胞因子對(duì)比 圖； 圖3為實(shí)施例1的肉毒素 D型酶切割巨噬細(xì)胞VAMP3、阻止其釋放細(xì)胞因子對(duì)比圖； 圖4為實(shí)