專(zhuān)利名稱(chēng)：一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
角膜移植是治療因感染、外傷及先天異常等各種病因?qū)е碌慕悄ぜ膊?、缺損、混濁、屈光度異常的重要方法之一，由于供體來(lái)源匱乏使許多病人不能得到及時(shí)有效地治療。合成材料制作的人工角膜由于生物相容性差，移植后難以和眼周組織融合，易產(chǎn)生脫失、漏水及前后膜等并發(fā)癥。
翼狀胬肉是一種常見(jiàn)的眼表疾病，具有術(shù)后容易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，單純的翼狀胬肉切除聯(lián)合角膜緣移植可以降低該疾病的術(shù)后復(fù)發(fā)率。但目前供體材料不足。
眼表包括角膜、結(jié)膜上皮和淚膜三個(gè)部分。針對(duì)不同原因引起的眼表疾病的治療即包括對(duì)這三個(gè)方面健康的有效維持和重建。
角膜屈光力占眼球總屈光力的2/3，以手術(shù)方法改變眼的屈光狀態(tài)可用于矯正不同類(lèi)型的屈光不正。
組織工程的支架材料起著為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)、為細(xì)胞增殖提供場(chǎng)所以及決定所修復(fù)組織的形狀大小的作用。天然高分子材料如膠原、透明質(zhì)酸、甲殼素及其衍生物及多糖類(lèi)高分子物質(zhì)其力學(xué)性能欠佳，疏水性太強(qiáng)，降解過(guò)快，不利于細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向材料內(nèi)擴(kuò)散。人工合成的高分子材料(如聚乳酸、聚乙醇酸)等也用于作為組織工程角膜的載體，其透明性和穩(wěn)定性較差，無(wú)菌性炎性反應(yīng)率較高，不適于臨床試驗(yàn)。羊膜組織雖可提供連續(xù)的基底膜，含有膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白及各種整合蛋白，這些成分利于上皮細(xì)胞的分化移行，但因材料本身太薄并不適于角膜基質(zhì)深層病變的修復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，該脫細(xì)胞角膜基質(zhì)用于修補(bǔ)眼表組織缺損、重建及塑形眼表組織、治療眼表疾病和用作構(gòu)建組織工程化生物角膜的載體，以期為臨床眼表手術(shù)提供充足的材料來(lái)源。
一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，主要由數(shù)百個(gè)相互平行的膠原纖維板層構(gòu)成，膠原纖維板層之間有細(xì)胞被脫去后形成的空隙。
所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，其基本成分包括膠原纖維、角膜基質(zhì)(包括粘多蛋白及糖蛋白等)以及脫細(xì)胞處理后殘留的胞膜和胞漿成分。
所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的厚度優(yōu)選為0.01～5.0mm。
所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)優(yōu)選為直徑是1mm～40mm的圓形。
所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)還可以攜帶藥物和/或細(xì)胞因子。
上述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，采取異種(動(dòng)物類(lèi))或同種異體角膜基質(zhì)為原料，經(jīng)過(guò)去細(xì)胞處理，得到所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。
去細(xì)胞處理可以采用細(xì)胞分離法(如過(guò)濾、離心、沉降等)，也可以采用細(xì)胞破碎法(如機(jī)械破碎之高壓勻漿、珠磨、超聲破碎等、化學(xué)和生物化學(xué)滲透之酸堿處理、化學(xué)試劑處理、酶溶等、物理滲透之滲透壓沖擊、凍結(jié)-融化法等)。
優(yōu)選地，去細(xì)胞處理為化學(xué)滲透法，具體步驟如下以濃度為0.05～5％的陰離子表面活性劑SDS溶液在4～50℃的條件下處理異種角膜基質(zhì)4～24小時(shí)。該方法在完全去除角膜組織細(xì)胞的同時(shí)，未構(gòu)成對(duì)角膜三維立體結(jié)構(gòu)及其基質(zhì)成分的破壞，使角膜最重要的特性-透明性和韌性得以充分保留。
去細(xì)胞處理還可以為另一種化學(xué)滲透法，步驟如下以濃度為0.01～5％的去垢劑TritonX-100溶液在4～50℃的條件下處理異種角膜基質(zhì)24～48小時(shí)，后以胰酶消化2-12小時(shí)。
所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)還可以采取去除異種抗原處理，去除異種抗原處理的方法可以采用初級(jí)的生物分離技術(shù)(如膜分離、萃取、沉淀分級(jí)和泡沫分離等)，也可以采用其他生物分離技術(shù)(如吸附、色譜、電泳以及電色譜等)。
制備本發(fā)明所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)可以采用異種(動(dòng)物類(lèi))或同種異體的部分角膜，也可以是全部角膜，甚至包括部分與之相連的鞏膜、結(jié)膜。可以是新鮮組織，也可以是經(jīng)過(guò)保存的組織。在一定作用條件下(如經(jīng)酶處理、破膜劑處理)，完全脫去材料內(nèi)的細(xì)胞成分，最大限度地去除組織內(nèi)的病原微生物，降低或消除組織的抗原性，但保留其正常的基質(zhì)纖維排列的三維結(jié)構(gòu)。
通過(guò)在本發(fā)明制作的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的表面負(fù)載相應(yīng)細(xì)胞，可以構(gòu)建出組織工程化生物角膜。由于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)具有一定的硬度和韌性，因此具有可加工性，能形成三維立體結(jié)構(gòu)；可以加工成各種形狀，如圓形、月牙形等。可以是具有一定弧度，也可以呈平面狀。也可以制作成與待修復(fù)的受體眼表缺損厚度相一致的厚度，加工為等厚度的，則脫細(xì)胞角膜基質(zhì)不具有屈光度，若加工為不等厚度，就可以具有相應(yīng)的屈光度。
本發(fā)明所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)移植后可以長(zhǎng)期存在或逐步降解，并呈高度透明狀態(tài)，具有受體的神經(jīng)可以長(zhǎng)入、受體細(xì)胞可以在其表面長(zhǎng)期附著生長(zhǎng)、免疫原性低和組織相容性佳的特點(diǎn)；還可以在制作加工或使用復(fù)水時(shí)，使其攜帶相關(guān)藥物和/或細(xì)胞因子，起到抑制新生血管長(zhǎng)入和/或治療原發(fā)疾病的作用；在移植后神經(jīng)可以長(zhǎng)入基質(zhì)內(nèi)，受體的上皮細(xì)胞可以在基質(zhì)表面附著生長(zhǎng)；所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)還具有與受體眼表組織相似的熱穩(wěn)定性。
本發(fā)明所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)制備方法簡(jiǎn)單，易操作，所制備的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)1.源于生物材料，具有良好的支架作用，可作為安全、有效的生物學(xué)材料長(zhǎng)期植入眼內(nèi)。
2.可以用于修復(fù)因病變切除的角膜緣，緩解供體材料不足的矛盾。
3.帶結(jié)膜的脫細(xì)胞角結(jié)膜基質(zhì)，即可作為纖維膠原支架，提供上皮生長(zhǎng)的、健康的基質(zhì)和基底膜，可用于重建眼表。
4.改變眼的屈光狀態(tài)時(shí)，可以通過(guò)改變基質(zhì)的厚度，使其具有不同的屈光度數(shù)，借助角膜鏡片術(shù)等手術(shù)方法用于治療屈光不正。
另外，本發(fā)明涉及的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)通過(guò)體內(nèi)及體外毒性試驗(yàn)、刺激致敏試驗(yàn)及免疫學(xué)等相關(guān)檢測(cè)，符合生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，證實(shí)材料對(duì)受體安全可靠，不會(huì)構(gòu)成對(duì)受體局部及全身的生物學(xué)危害。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述的一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)及其制備方法，通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例1一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，主要由數(shù)百個(gè)(100-250個(gè)左右)相互平行的膠原纖維板層構(gòu)成，膠原纖維板層之間有細(xì)胞被脫去后形成的空隙。膠原纖維板層相互平行，大小一致，間隔相等，在膠原纖維板層之間的空隙中還含有角膜基質(zhì)(包括粘多蛋白及糖蛋白等)以及脫細(xì)胞處理后殘留的胞膜和胞漿成分。所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)形狀規(guī)則，其厚度為0.1-0.5mm左右(具體形狀及規(guī)格視臨床病例之情況而定)。
脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，采取異種動(dòng)物角膜基質(zhì)為原料，經(jīng)過(guò)化學(xué)滲透法去細(xì)胞處理可得到，步驟如下化學(xué)滲透法制作脫細(xì)胞基角膜質(zhì)以濃度為0.1％的陰離子表面活性劑SDS溶液在37℃的條件下處理異種角膜基質(zhì)7小時(shí)，制作石蠟切片行病理組織學(xué)觀察，結(jié)果顯示基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞成分可被脫去。
將上述制備的脫細(xì)胞基角膜質(zhì)用于下述試驗(yàn)1.將所述脫細(xì)胞基角膜質(zhì)用于板層角膜移植角膜混濁、潰瘍或角膜基質(zhì)缺損病人，用環(huán)鉆或角膜切削刀去除病變部分的角膜后，用縫線或生物膠將相應(yīng)規(guī)格的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)植片固定于植床，包眼，待表面上皮化后，按板層角膜移植術(shù)處理。術(shù)后可不同程度恢復(fù)角膜的透明度及其完整性。亦可同時(shí)將此脫細(xì)胞角膜基質(zhì)通過(guò)不同載體(如脂質(zhì)體、乳劑、毫微球等)攜帶不同作用的藥物或細(xì)胞因子，如抗新生血管的VEGF、促進(jìn)上皮黏附的ICAM-1以及抗生素等，以改善板層角移術(shù)后新生血管形成、上皮生長(zhǎng)緩慢以及繼發(fā)感染等并發(fā)癥。
2.將所述脫細(xì)胞基角膜質(zhì)用于翼狀胬肉手術(shù)按常規(guī)翼狀胬肉切除手術(shù)規(guī)定切除翼狀胬肉后，清理創(chuàng)面，取與缺損角膜緣相吻合的含角膜緣帶部分鞏膜的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)(周邊緣菲薄)用縫線或生物膠固定，牽拉切開(kāi)的結(jié)膜，覆蓋脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的鞏膜部分，加壓包扎術(shù)眼。按翼狀胬肉聯(lián)合羊膜移植手術(shù)后常規(guī)處理。
3.將所述脫細(xì)胞基角膜質(zhì)用于修復(fù)鞏膜缺損清理角鞏膜葡萄腫患者的病變表面后，將與缺損鞏膜相吻合的脫細(xì)胞鞏膜基質(zhì)(周邊緣菲薄)用縫線或生物膠固定，縫合結(jié)膜，加壓包扎術(shù)眼。
實(shí)施例2一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，由數(shù)百個(gè)相互平行的膠原纖維板層構(gòu)成，膠原纖維板層之間有細(xì)胞被脫去后形成的空隙。膠原纖維板層相互平行，大小一致，間隔相等，其基本成分包括膠原纖維、角膜基質(zhì)(包括粘多蛋白及糖蛋白等)以及脫細(xì)胞處理后殘留的胞膜和胞漿成分。所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為直徑范圍在1-10mm左右的圓形，其厚度為0.3mm左右。(具體直徑及厚度可根據(jù)患眼之屈光狀態(tài)及病變情況塑形)脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法，采取同種異體角膜基質(zhì)為原料，該角膜包括附帶在角膜上的鞏膜和結(jié)膜，經(jīng)過(guò)化學(xué)滲透法去細(xì)胞處理可得到，步驟如下化學(xué)滲透法制作脫細(xì)胞基角膜質(zhì)以濃度為1％的去垢劑TritonX-100溶液在37℃的條件下處理異種角膜基質(zhì)24小時(shí)，制作石蠟切片行病理組織學(xué)觀察，結(jié)果顯示基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞成分可被脫去。
將上述制備的脫細(xì)胞基角膜質(zhì)用于下述試驗(yàn)1.將所述脫細(xì)胞基角膜質(zhì)用于角膜鏡片術(shù)按角膜表面鏡片術(shù)的要求，在角膜表面制做鑲嵌槽，將具有適宜屈光度的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)片的菲薄周邊緣插入槽內(nèi)，用縫線或生物膠固定，加壓包扎術(shù)眼。按角膜鏡片術(shù)手術(shù)后常規(guī)處理。術(shù)后患者的屈光度可有不同程度的改善。
2.將所述脫細(xì)胞基角膜質(zhì)用于角膜基質(zhì)層間植入術(shù)用于矯正屈光不正與治療圓錐角膜。根據(jù)病人的屈光度選擇具有適宜屈光度的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)片。做板層角膜或角膜基質(zhì)層間囊袋，將選擇的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)片植入角膜層間內(nèi)，固定后，加壓包扎術(shù)眼。按角膜鏡片術(shù)手術(shù)后常規(guī)處理。
3.將所述脫細(xì)胞基角膜質(zhì)用于構(gòu)建出組織工程化生物角膜角膜組織工程構(gòu)建時(shí)，在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的前表面種植上皮細(xì)胞，后表面種植內(nèi)皮細(xì)胞，形成角膜的三維立體結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，其特征是主要由數(shù)百個(gè)相互平行的纖維板層構(gòu)成，纖維板層之間有細(xì)胞被脫去后形成的空隙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，其特征是主要包括膠原纖維、角膜基質(zhì)以及脫細(xì)胞處理后殘留的胞膜和胞漿成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，其特征是所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的厚度為0.01～5.0mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，其特征是所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為直徑是1mm～40mm的圓形。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，其特征是所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)中攜帶有藥物和/或細(xì)胞因子。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的方法，其特征是采用異種動(dòng)物類(lèi)或同種異體角膜基質(zhì)為原料，經(jīng)過(guò)去細(xì)胞處理，得到所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的方法，其特征是去細(xì)胞處理為化學(xué)滲透法，步驟如下以濃度為0.05～5％的陰離子表面活性劑SDS溶液在4～50℃的條件下處理異種角膜基質(zhì)4～24小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的方法，其特征是去細(xì)胞處理為化學(xué)滲透法，步驟如下以濃度為0.01～5％的去垢劑TritonX-100溶液在4～50℃的條件下處理異種角膜基質(zhì)24～48小時(shí)，再以胰酶消化2-12小時(shí)。
9.一種制備權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的方法，其特征是異種動(dòng)物類(lèi)或同種異體角膜基質(zhì)是單獨(dú)的角膜、帶有鞏膜的角膜、帶有結(jié)膜的角膜、或帶有鞏膜和結(jié)膜的角膜。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，該脫細(xì)胞角膜基質(zhì)主要由數(shù)百個(gè)相互平行的膠原纖維板層構(gòu)成，膠原纖維板層之間有細(xì)胞被脫去后形成的空隙。所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)用于修補(bǔ)眼表組織缺損、重建及塑形眼表組織、治療眼表疾病和用作構(gòu)建組織工程化生物角膜的載體，移植后可以長(zhǎng)期存在或逐步降解，并可呈高度透明狀態(tài)，具有受體的神經(jīng)可以長(zhǎng)入、受體細(xì)胞可以在其表面長(zhǎng)期附著生長(zhǎng)、免疫原性低和組織相容性佳的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61F2/14GK101066471SQ200710027698
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月25日
發(fā)明者王智崇 申請(qǐng)人:中山大學(xué)中山眼科中心