本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及靶向藥物分子領(lǐng)域，具體涉及一種具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是威脅全球人類生命的最大殺手之一，癌癥治療是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究所面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。化學(xué)治療與手術(shù)治療、放射治療并列為癌癥治療的三大基本手段，在癌癥治療中占有重要地位。但是，傳統(tǒng)的化療藥物由于其本身的諸多缺點(diǎn)和毒副作用，在殺死腫瘤細(xì)胞時(shí),會(huì)給人體正常細(xì)胞也帶來(lái)嚴(yán)重的損傷,導(dǎo)致不同副作用的產(chǎn)生，比如骨髓抑制、白細(xì)胞減少、患者疲乏無(wú)力、抵抗力下降、易感染、發(fā)熱、出血等，大大降低了患者的生存質(zhì)量，某些時(shí)候甚至由于出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)而被迫停止治療。

因此，減少化療藥物的耐藥，提高癌癥治療療效，并克服化療的毒副作用和提高患者的生活質(zhì)量是化療藥物研發(fā)的重要目標(biāo)。當(dāng)代化療藥物研發(fā)已經(jīng)進(jìn)入“精準(zhǔn)”靶向藥物分子設(shè)計(jì)時(shí)代，針對(duì)已經(jīng)明確的致癌位點(diǎn)，以“靶標(biāo)-配體”的精準(zhǔn)相互作用為基礎(chǔ)來(lái)設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)會(huì)特異地選擇致癌位點(diǎn)來(lái)相結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，而不影響正常細(xì)胞、組織或器官的功能。近些年，不斷有小分子靶向抗腫瘤藥物的新產(chǎn)品上市，如吉非替尼、克唑替尼、?？颂婺岬?，還有數(shù)百個(gè)產(chǎn)品正處于臨床研發(fā)階段。

小分子靶向藥物的種類有多種，目前研究和利用能夠靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞而在正常細(xì)胞位置保持分子結(jié)構(gòu)的完整性和細(xì)胞無(wú)毒性的小分子藥物，相比于其他的靶向藥物將更加具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子及其應(yīng)用，其能夠在正常細(xì)胞位置保持分子結(jié)構(gòu)的完整性和細(xì)胞無(wú)毒性，而在腫瘤細(xì)胞位置釋放出細(xì)胞殺傷性片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷；同時(shí)其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有雙重靶向性。

本發(fā)明一方面提供了一種具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子,所述抗腫瘤多肽分子具有如下序列：ac-arg-gly-asp-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(rr22)，具體結(jié)構(gòu)如下：

其中，arg為精氨酸，gly為甘氨酸，asp為天冬氨酸，pro為脯氨酸，ala為丙氨酸，ile為異亮氨酸；

所述抗腫瘤多肽分子能夠被基質(zhì)金屬蛋白酶酶解，釋放出具有腫瘤細(xì)胞殺傷性的lr15片段，所述lr15片段為

leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述抗腫瘤多肽分子含有：提高與癌細(xì)胞特異性結(jié)合能力的arg-gly-asp片段,具有基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性的gly-pro-leu-gly-leu-ala片段，賦予分子疏水性的ile-ile-ile片段，以及利于分子與細(xì)胞相互作用的arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg片段。

本發(fā)明另一方面提供了由上述具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子制備得到的腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷劑。由于上述技術(shù)方案所提供的抗腫瘤多肽分子具有arg-gly-asp片段，通過(guò)該片段可識(shí)別性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的整合素，同時(shí)，所述抗腫瘤多肽分子能夠被基質(zhì)金屬蛋白酶酶解，釋放出具有腫瘤細(xì)胞殺傷性的lr15片段

leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2，

因此，所述抗腫瘤多肽分子可制備成為腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷劑。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷劑為將上述抗腫瘤多肽分子溶解于ph為7.0的tris緩沖液中。

本發(fā)明再一方面提供了由上述具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子在制備腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷劑中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述抗腫瘤多肽分子的濃度≤100μm時(shí)，對(duì)人體和動(dòng)物正常細(xì)胞不具有毒性；所述抗腫瘤多肽分子的濃度為50-100μm時(shí)，對(duì)人體腫瘤細(xì)胞具有高毒性和殺傷性。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述人體正常細(xì)胞選自人胚腎細(xì)胞293e和猴腎成纖維細(xì)胞cos7中的至少一種，所述腫瘤細(xì)胞選自人宮頸癌細(xì)胞hela、人肺癌細(xì)胞a549、人肝癌細(xì)胞hepg2中的至少一種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于：

1、本發(fā)明提供的抗腫瘤多肽分子結(jié)構(gòu)中具有提高與癌細(xì)胞特異性結(jié)合能力的片段,具有基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性的片段，賦予分子疏水性的片段，以及利于分子與細(xì)胞相互作用的片段，含有ile-ile-ile片段的疏水性區(qū)域與arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg片段連接形成兩親性序列，具有細(xì)胞殺傷功能；不同的功能片段通過(guò)gly殘基連接，能夠保證這些片段的自由構(gòu)象和功能發(fā)揮。

2、本發(fā)明提供的抗腫瘤多肽分子在正常細(xì)胞位置保持分子結(jié)構(gòu)的完整性和細(xì)胞無(wú)毒性，而在腫瘤細(xì)胞位置釋放出細(xì)胞殺傷性片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷，具有“智能性”。

3、本發(fā)明提供的抗腫瘤多肽分子一方面通過(guò)rgd片段即arg-gly-asp片段識(shí)別性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的整合素，另一方面能夠被腫瘤細(xì)胞所過(guò)量表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶酶解從而釋放出細(xì)胞殺傷性片段，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)響應(yīng)，從而使得該多肽分子具有雙重靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。

4、本發(fā)明提供的抗腫瘤多肽分子可用于制備腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷劑，在多肽分子的濃度≤100μm時(shí)，對(duì)人體以及動(dòng)物的正常細(xì)胞不具有毒性，但是濃度為50-100μm時(shí)，對(duì)人體腫瘤細(xì)胞具有高毒性和殺傷性。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例所提供的不同種類的細(xì)胞在抗腫瘤多肽分子rr22存在下培養(yǎng)48h的存活率表征圖；

圖2(a)為本發(fā)明實(shí)施例所提供的多肽分子rr22在基質(zhì)金屬蛋白酶mmp7處理前(上圖)和后(下圖)的質(zhì)譜結(jié)果圖；

圖2(b)為本發(fā)明實(shí)施例所提供的多肽分子rr22被基質(zhì)金屬蛋白酶mmp7酶解的理論片段釋放圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例所提供的正常細(xì)胞和癌細(xì)胞在不同多肽分子(a)gr19,(b)lr15存在下培養(yǎng)48h的存活率表征圖。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子,還提供了上述具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子在制備腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷劑中的應(yīng)用。

為了更清楚詳細(xì)地介紹本發(fā)明實(shí)施例所提供的具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子，以下將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。

實(shí)施例1

具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子的合成(以合成0.25mmol肽分子為例)

1、材料

(1)稱取負(fù)載量為0.318mmol/g的mbha樹(shù)脂0.982g，dcm溶脹一夜；

(2)配制濃度為0.2mol/l的下列氨基酸的dmf(二甲基甲酰胺)溶液：

fmoc-ala-oh(n-芴甲氧羰?；?丙氨酸)：體積11ml，質(zhì)量0.82g；

fmoc-gly-oh(n-芴甲氧羰?；?甘氨酸)：體積56ml，質(zhì)量1.90g；

fmoc-pro-oh(n-芴甲氧羰?；?脯氨酸)：體積11ml，質(zhì)量0.74g；

fmoc-ile-oh(n-芴甲氧羰酰基-異亮氨酸)：體積32ml，質(zhì)量2.26g；

fmoc-lys(boc)-oh(n-芴甲氧羰?；?n’-叔丁氧羰?；?賴氨酸)：體積32ml，質(zhì)量3.00g；

fmoc-arg(pbf)-oh(n-芴甲氧羰?；?2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸)：體積84ml，質(zhì)量10.92g；

fmoc-leu-oh(n-芴甲氧羰?；?亮氨酸)：體積21ml，質(zhì)量1.51g；

fmoc-d-asp-otbu(n-芴甲氧羰基-d-天冬氨酸-1-叔丁酯)：體積1ml，質(zhì)量0.96g；

配置上述溶液后，充分?jǐn)嚢枞芙?，氨基酸用量均?倍計(jì)算，保證充分反應(yīng)。

(3)配制下列合成試劑：

a)活化劑(0.45mhbtu、0.45mhobt的dmf溶液)：稱取11.44ghbtu和4.07ghobt充分溶解于67mldmf溶液；

b)活化堿(2mdiea的dmf溶液)：量取11.84ml二異丙基乙胺(diea)和22.17mldmf充分混合；

c)脫保護(hù)劑(20％(v/v)哌啶/0.1mhobt的dmf溶液)：量取74.8ml哌啶，稱取5.05ghobt充分溶解于300ml的dmf溶液；

d)蓋帽劑(20％(v/v)乙酸酐、0.125mdiea、0.015mhobt的dmf溶液):量取2.2ml乙酸酐、0.24mldiea，稱取0.0223ghobt，充分溶解于8.8mldmf溶液；

e)裂解劑(體積比tfa:tis:water＝95:2.5:2.5)：量取14.25mltfa，0.375mltis，0.375mlwater充分混合。

(4)利用cem公司的liberty微波多肽合成儀、應(yīng)用fmoc固相合成法合成多肽，得到尚未裂解的連接有樹(shù)脂的多肽粗產(chǎn)品。

(5)反應(yīng)完成后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到旋蒸瓶?jī)?nèi)，在35℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去dcm(二氯甲烷)、tfa等殘余液體。用滴管將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的液體逐滴加入7-8倍殘液體積的冰乙醚內(nèi)，靜置產(chǎn)生沉淀后，用高速冷凍離心機(jī)在9000rpm、4℃條件下離心10min，反復(fù)乙醚沉淀，離心5-6次。除去上層清液，保留沉淀，通風(fēng)櫥內(nèi)待乙醚揮發(fā)完之后，向沉淀中加超純水，超聲搖勻，放入冰箱中預(yù)凍1h，再使用凍干機(jī)-60℃冷凍干燥24h左右，得到純化產(chǎn)品，即兩親性多肽，于-20℃密封保存。

實(shí)施例2

具有雙重靶向性和選擇性的抗腫瘤多肽分子的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

首先在無(wú)菌的96孔板中接種100μl密度為1×10⁵細(xì)胞/ml的細(xì)胞，置于37℃培養(yǎng)箱中24h，待其貼壁后將孔板中的培養(yǎng)液吸出，向每個(gè)孔中加入100μl新鮮培養(yǎng)液和100μl經(jīng)過(guò)過(guò)濾的不同濃度的多肽溶液，每個(gè)濃度設(shè)立4個(gè)平行abspeptide，另外用只加tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液、不加多肽的孔作為對(duì)照組abstris，之后將孔板重新置于37℃培養(yǎng)箱中48h，作用完成后，向每個(gè)孔中加入20μl濃度為5mg/ml的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，之后將孔板中的液體吸出，在每個(gè)孔中加入150μl的二甲基亞砜，并向空白孔中加入等量的二甲基亞砜作為調(diào)零孔absblank，然后將孔板置于搖床上震蕩10min使之充分混勻，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光值。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為：

細(xì)胞存活率＝1-(abstris-abspeptide)/(abstris-absblank)

由圖1可以看出，多肽分子的濃度在100μm以下與細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)，人胚腎細(xì)胞293e、猴腎成纖維細(xì)胞cos7的存活率都在90％以上，也就是說(shuō)該多肽分子在濃度100μm以下時(shí)對(duì)所研究的人體和動(dòng)物的正常細(xì)胞基本沒(méi)有毒性；而50μm濃度以上細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞hela、人肺癌細(xì)胞a549、人肝癌細(xì)胞hepg2有明顯殺傷，存活率降至50％以下，因此，由圖1可知，該肽分子100μm濃度以下對(duì)人體癌細(xì)胞具有選擇性殺傷能力。

實(shí)施例3

酶解試驗(yàn)

用ph7.0的tris緩沖液配制多肽分子：

ac-arg-gly-asp-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(rr22)的溶液，其濃度為100μm，取出部分溶液加入基質(zhì)金屬蛋白酶mmp7作用，對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)譜表征。

結(jié)果如圖2所示，圖2(a)的質(zhì)譜圖和圖2(b)均表明基質(zhì)金屬蛋白酶mmp7可以成功酶解多肽分子，釋放出兩親性的

leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(lr15)片段。

實(shí)施例4

不同多肽分子的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

作為對(duì)比控制實(shí)驗(yàn)，合成如下分子：

(a)

ac-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(gr19)；

(b)實(shí)施例3的lr15；

測(cè)試上述三種多肽分子gr19和lr15的細(xì)胞毒性，具體實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例2相同，與實(shí)施例2的多肽分子

ac-arg-gly-asp-gly-pro-leu-gly-leu-ala-gly-ile-ile-ile-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-nh2(rr22)進(jìn)行細(xì)胞毒性對(duì)比。

結(jié)果如圖3所示。上述3個(gè)分子對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都有明顯毒性，而沒(méi)有選擇性。其中，gr19不具有細(xì)胞選擇性殺傷能力與rr22的細(xì)胞選擇性殺傷能力對(duì)比，說(shuō)明rgd片段即arg-gly-asp片段對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合提高了分子的細(xì)胞選擇性殺傷能力；lr15的細(xì)胞殺傷能力來(lái)源于其兩親性結(jié)構(gòu)，與rr22在100μm濃度以下不具有對(duì)正常細(xì)胞的殺傷能力對(duì)比，說(shuō)明只有在腫瘤細(xì)胞環(huán)境中，過(guò)量表達(dá)的mmp7酶酶解rr22分子釋放出lr15片段之后，才激活了分子的細(xì)胞殺傷能力，因此，本發(fā)明的抗腫瘤多肽分子具有“智能性”和雙重靶向性。