專利名稱：用于調(diào)節(jié)bcl－2的寡聚化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供改進(jìn)的寡聚化合物及在人中調(diào)節(jié)BCL-2基因表達(dá)的方法。具體而言，本發(fā)明涉及10-30個(gè)核苷堿基(nucleobase)長(zhǎng)度的寡聚化合物，其包含與人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基之間的區(qū)域可特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，所述靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸。
因此，本發(fā)明涉及針對(duì)人Bcl-2mRNA并能夠調(diào)節(jié)人Bcl-2蛋白生物合成的反義寡聚化合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含這種寡聚化合物的藥物組合物、其用途及使用這種寡聚化合物的治療和診斷方法。
背景技術(shù)：
人Bcl-2蛋白是與程序性細(xì)胞死亡(凋亡)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。凋亡是參與發(fā)育、正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化及激素誘導(dǎo)的組織萎縮的活躍的、高度受調(diào)節(jié)的生理過(guò)程。程序性細(xì)胞死亡在癌癥和其他增生性疾病，例如再狹窄、纖維化、銀屑病或其他類型的變應(yīng)性疾病中起重要作用，特別是在腫瘤進(jìn)展中，并且重要的是它可能會(huì)促進(jìn)對(duì)抗腫瘤方案、特別是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療化合物的抗性這一臨床問(wèn)題。和大多數(shù)正常的組織相反，在惡性腫瘤，例如小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中，Bcl-2常常共表達(dá)。
WO95/08350公開(kāi)了反密碼子寡聚物(anticode oligomer)及使用它們來(lái)控制表達(dá)Bc1-2基因之癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法。
Klasa等人，Antisense & Nucleic Acid Drug Development021993-213(2002)(綜述)討論了化合物奧利默森鈉(oblimersensodium)(G3139)的生物學(xué)作用及其作為反義藥物的可能性。該化合物具有5’-d(P-硫代)-TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT-3’的結(jié)構(gòu)。Genta有限公司以?shī)W利默森鈉(G3139)加達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)的方式向FDA遞交了一個(gè)NDA(新藥申請(qǐng))。它基于的是奧利默森鈉(G3139)加達(dá)卡巴嗪(DTIC)相對(duì)于單獨(dú)DTIC作為對(duì)轉(zhuǎn)移性黑素瘤的一線化療法(每三周)的國(guó)際性多中心隨機(jī)化3期研究。在2004年5月有報(bào)道說(shuō)該研究未顯示G3139和DTIC的聯(lián)合具有生存益處。該聯(lián)合組與增加的毒性及由于不良事件(AE)的終止相關(guān)，所述終止包括G3139組由于不良事件而終止治療的69位(18.6％)患者，與此相對(duì)的是單獨(dú)DTIC組的39位(10.8％)患者終止。嚴(yán)重不良事件(SAE)率在G3139組中是40％，與此相對(duì)的是單獨(dú)DTIC組是27％。因?yàn)樵趦山M中DTIC的施用是相同的，毒性的增加可能是由于G3139的加入。存活率沒(méi)有提高而毒性增加。隨后該NDA被撤銷了。然而，該申辦者的二級(jí)終點(diǎn)分析的確顯示了DTIC的無(wú)進(jìn)展存活中值為49天，而聯(lián)合用藥時(shí)為74天有統(tǒng)計(jì)上顯著的益處，差別為25天(p＝0.0003，HR＝0.73)。該申辦者還報(bào)道了單獨(dú)DTIC的響應(yīng)率為6.8％，而聯(lián)合用藥為11.7％，有顯著差異(p＝0.019)。奧利默森鈉達(dá)到二級(jí)終點(diǎn)的事實(shí)表明它可以作為治療轉(zhuǎn)移性黑素瘤的有效化合物。增加的毒性、一級(jí)終點(diǎn)的選擇及總體臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)是導(dǎo)致失敗的所有因素。
Jan Stenvang Jepsen(2003年5月，Copenhagen大學(xué))答辯的博士論文中研究了針對(duì)人Bcl-2mRNA中前6個(gè)密碼子的含LNA的寡聚脫氧核苷酸的LNA。分析了完全修飾的LNA磷酸二酯(PO)序列、磷酸二酯(phosporodiester)頭聚物(headmer)(LNA/PO在5’末端且DNA/PS硫代磷酸酯在3’末端)、完全磷酸二酯gapmer(缺口大小為8、10、12、14)和缺口中完全硫醇化(缺口大小為8、10、12、14)的gapmer連同不同轉(zhuǎn)染劑的體外攝取及其對(duì)Bcl-2蛋白的下調(diào)。該攝取研究在MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行，結(jié)果通過(guò)顯微術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)分析。針對(duì)含有不同PO和PO/PS的所有構(gòu)建物得到同樣有效的投遞?？赡芤?yàn)橐阎虼姿狨セ瘜?dǎo)致親和力下降并且因?yàn)闆](méi)有穩(wěn)定性問(wèn)題，Stenvang Jepsen雖然研究了多種含有LNA的寡核苷酸和構(gòu)建物，但是他并沒(méi)有公開(kāi)或預(yù)見(jiàn)含有LNA的寡核苷酸gapmer，其中靶結(jié)合域內(nèi)大量的核苷酸連鍵(包括LNA側(cè)翼)是硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)。
基于體外試驗(yàn)，F(xiàn)rieden等人，Nucleic Acid Research，2003，第31卷，No.21，6365-6373和WO2004/046160 A2公開(kāi)了有關(guān)反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)的多種意見(jiàn)。
Fluiter等人，Nucleic Acid Research，2003，第3卷，953-962公開(kāi)了LNA反義寡核苷酸的腫瘤生長(zhǎng)抑制及其生物分布研究。

發(fā)明內(nèi)容
基于上面的描述，具體地是奧利默森鈉化合物相關(guān)的潛在性問(wèn)題，仍然需要下調(diào)Bcl-2的改進(jìn)型寡聚化合物。這種化合物優(yōu)選應(yīng)當(dāng)在分布和下調(diào)Bcl-2方面具有合適的體內(nèi)模式，從而對(duì)各種Bcl-2相關(guān)疾病、特別是癌癥具有治療相關(guān)性。
這就是說(shuō)，本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了某種新的gapmer型LNA寡聚化合物，相對(duì)奧利默森鈉而言，其表現(xiàn)相當(dāng)?shù)幕蛱岣叩纳飳W(xué)作用，而在藥理相關(guān)劑量下沒(méi)有監(jiān)測(cè)到不利后果。
更具體地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)10-30個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度的如下寡聚化合物具有有趣的生物學(xué)性質(zhì)該化合物包含與人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的區(qū)域可特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，其中所述靶結(jié)合區(qū)具有下式5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA類似物核苷酸；且在靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示通過(guò)western印跡分析LNA寡聚化合物轉(zhuǎn)染的15PC3細(xì)胞中Bcl-2的下調(diào)。相對(duì)于奧利默森鈉即SEQ ID NO56(參比)而言，SEQ ID NO2、4、15、21和24(見(jiàn)表1)是在蛋白質(zhì)水平上測(cè)定的更有效的Bcl-2抑制劑。survivin蛋白作為對(duì)照。
圖2A顯示通過(guò)western印跡及使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)顯色分析的LNA寡聚化合物轉(zhuǎn)染的15PC3細(xì)胞中Bcl-2的下調(diào)。相對(duì)于SEQ ID NO56(參比)而言，SEQ ID NO2明顯更加有效。survivin蛋白作為對(duì)照。
圖2B顯示了western印跡。518A2細(xì)胞分別用5nM SEQ ID NO56(參比)、SEQ ID NO8和SEQ ID NO15進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后測(cè)定蛋白質(zhì)。在時(shí)間段內(nèi)SEQ ID NO15仍具有活性。該圖顯示以微管蛋白歸一化的數(shù)據(jù)。
圖2C顯示western印跡。518A2細(xì)胞分別用5nM SEQ ID NO56(參比)、SEQ ID NO8、SEQ ID NO15和SEQ ID NO35進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，其中SEQ ID NO35是SEQ ID NO15的n-1個(gè)15-mer形式。在48小時(shí)時(shí)分析蛋白質(zhì)。SEQ ID NO35和SEQ ID NO15一樣有效。數(shù)據(jù)以微管蛋白歸一化。
圖3A顯示通過(guò)胱冬酶3/7的活性測(cè)定的含有LNA之化合物在518A2細(xì)胞中24、48和72小時(shí)后的凋亡誘導(dǎo)。LNA寡聚SEQ ID NO2、4、12、15、21、24和27誘導(dǎo)凋亡比SEQ ID NO56(參比)及其對(duì)應(yīng)的胞嘧啶甲基化化合物(稱為SEQ ID NO59)更有效。在稍晚的時(shí)間點(diǎn)(例如在72小時(shí))胱冬酶3/7的較低值是由于通過(guò)在胱冬酶3/7的早期活化時(shí)經(jīng)凋亡引起的細(xì)胞死亡所致。因此，在監(jiān)視的時(shí)間前已達(dá)到最大活化。
圖3B顯示通過(guò)胱冬酶3/7活性測(cè)定的含有LNA之化合物在518A2細(xì)胞中13、24、48和72小時(shí)后的凋亡誘導(dǎo)。相對(duì)于SEQ ID NO58(即也含有LNA的相反極性對(duì)照寡核苷酸)而言，LNA寡聚化合物SEQID NO8、9、15和16更有效地誘導(dǎo)凋亡。
圖3C顯示通過(guò)Annexin V-FITC流式細(xì)胞儀分析法測(cè)定的后凋亡性細(xì)胞階段的誘導(dǎo)。相對(duì)于模擬物(mock)和SEQ ID NO56(參比)處理的細(xì)胞而言，以LNA寡聚化合物SEQ ID NO15處理的Hela細(xì)胞歸類為更加“晚凋亡”或“損傷(damaged)的”。
圖3D顯示相對(duì)于模擬物(mock)處理的細(xì)胞，通過(guò)Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)分析法測(cè)定的用5nM和12.5nM SEQ ID NO8和SEQ IDNO15處理細(xì)胞導(dǎo)致的早期凋亡和晚凋亡的誘導(dǎo)。
圖4顯示用Bcl-2LNA寡聚化合物處理后48小時(shí)測(cè)量的增殖癌細(xì)胞(MTS測(cè)定法)、518A2細(xì)胞中Bcl-2的抑制。相對(duì)于SEQ ID NO56(參比)及其對(duì)應(yīng)的胞嘧啶甲基化化合物SEQ ID NO59(參比)，SEQ ID NO2、4、12、15、21、24和57的是更有效的增殖抑制劑。針對(duì)經(jīng)模擬物處理的對(duì)照調(diào)整數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2代表了兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。
圖5顯示用Bcl-2LNA寡聚化合物處理后0-48小時(shí)時(shí)程內(nèi)測(cè)量的增殖癌細(xì)胞518A2細(xì)胞中的Bcl-2抑制。相對(duì)于SEQ ID NO56(參比)及其對(duì)應(yīng)的胞嘧啶甲基化化合物SEQ ID NO59(參比)而言，SEQ ID NO2、4、12、15、21、24和57均是更有效的增殖抑制劑。針對(duì)經(jīng)模擬物處理的對(duì)照調(diào)整(校正)數(shù)據(jù)。
圖6顯示了western印跡。518A2細(xì)胞分別用10nM SEQ ID NO56(參比)和SEQ ID NO15進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)分析蛋白質(zhì)。在整個(gè)時(shí)間段內(nèi)SEQ ID NO15均具有活性。在24小時(shí)時(shí)(已和蛋白質(zhì)的半壽期一樣長(zhǎng))Bcl-2蛋白仍然可見(jiàn)。
圖7顯示相對(duì)于SEQ ID NO56(參比)而言，在前列腺PC3無(wú)胸腺(atymic)裸鼠異種移植物模型中使用SEQ ID NO15的體內(nèi)腫瘤體積的有效減小。該化合物以10mg/kg腹膜內(nèi)注射14天。絲裂霉素C以2mg/kg腹膜內(nèi)注射14天作為陽(yáng)性對(duì)照。處理后觀察腫瘤生長(zhǎng)8天。
圖7B顯示在前列腺PC3無(wú)胸腺裸鼠異種移植物模型中施用SEQ IDNO15時(shí)體重沒(méi)有明顯的下降。10mg/kg的SEQ ID NO56(參比)和2mg/kg的絲裂霉素C陽(yáng)性對(duì)照顯示類似的模式。
圖7C顯示相對(duì)于鹽水對(duì)照而言，在前列腺PC3無(wú)胸腺裸鼠異種移植物模型中使用SEQ ID NO8時(shí)體內(nèi)腫瘤體積的有效減小。該化合物以10mg/kg腹膜內(nèi)注射14天(第5-19天)。
圖7D顯示相對(duì)于鹽水對(duì)照而言，在前列腺PC3無(wú)胸腺裸鼠異種移植物模型中第7-15天中的每天或第8、11、13、15、18、20天施用SEQ ID NO15時(shí)體內(nèi)腫瘤體積的有效減小。該化合物以10mg/kg腹膜內(nèi)施用14天。處理后再觀察腫瘤生長(zhǎng)8天。
圖8A顯示在黑素瘤518A2 scid小鼠異種移植物模型中腹膜內(nèi)施用1.75mg/kg的SEQ ID NO15計(jì)14天后體內(nèi)腫瘤重量(克數(shù))相比于施用4倍高劑量的SEQ ID NO56(參比)而言有相當(dāng)?shù)臏p小。
圖8B顯示來(lái)自和圖8A中相同試驗(yàn)的結(jié)果，但是該結(jié)果是以腫瘤減?。ケ硎?，而不是以克數(shù)表示。
圖9顯示在黑素瘤518A2 scid小鼠異種移植物模型中腹膜內(nèi)施用1.75mg/kg的SEQ ID NO15計(jì)14天后體內(nèi)腫瘤體積相比于施用4倍高劑量的SEQ ID NO56(參比)而言有相當(dāng)?shù)臏p小。
圖10A顯示相對(duì)于鹽水對(duì)照，在黑素瘤518A2 scid小鼠異種移植物模型中腹膜內(nèi)施用1.75mg/kg的SEQ ID NO15計(jì)14天時(shí)，肝臟的大小沒(méi)有增加。以7mg/kg施用SEQ ID NO56(參比)引起肝臟大小增加。
圖10B顯示，相對(duì)于鹽水對(duì)照，在黑素瘤518A2 scid小鼠異種移植物模型中腹膜內(nèi)施用1.75mg/kg的SEQ ID NO15計(jì)14天時(shí)，脾臟的大小沒(méi)有增加。以7mg/kg施用SEQ ID NO56(參比)顯示脾臟大小有增加。這表明相對(duì)于SEQ ID NO56(參比)而言，在活性劑量下SEQ ID NO15具有更低的毒性水平。
圖10C顯示相對(duì)于鹽水對(duì)照和7mg/kg的SEQ ID NO56(參比)而言，在黑素瘤518A2 scid小鼠異種移植物模型中腹膜內(nèi)施用1.75mg/kg的SEQ ID NO15計(jì)14天時(shí)，該處理沒(méi)有導(dǎo)致小鼠體重的減少。這表明相比于SEQ ID NO56(參比)，活性劑量下SEQ ID NO15具有更低的毒性水平。
圖11顯示相比于同樣劑量的SEQ ID NO56(參比)，當(dāng)腹膜內(nèi)施用7mg/kg的SEQ ID NO8計(jì)14天時(shí)，在黑素瘤518A2 scid小鼠異種移植物模型中體內(nèi)腫瘤重量的進(jìn)一步減少。當(dāng)SEQ ID NO8以比SEQ ID NO56(參比)低7倍的劑量施用時(shí)，其顯示相同的抗腫瘤活性。
圖12A顯示相對(duì)于SEQ ID NO56(參比)而言，在大鼠血漿(NtacSD雄性，Li-肝素化(Taconic，M&B))中SEQ ID NO15、16和20有增加的穩(wěn)定性。將該寡核苷酸在37℃下以20μM的濃度分別孵育0、4、24和48小時(shí)。樣品中存在的唯一降解片段是n-1個(gè)對(duì)應(yīng)的寡核苷酸(15mer)，其缺乏3’末端的DNA殘基。甚至在48小時(shí)的消化后仍然沒(méi)有觀察到其他的降解片段。
圖12B顯示相對(duì)于SEQ ID NO56(參比)而言，在大鼠血漿中SEQ ID NO8和9顯示高穩(wěn)定性。將該寡核苷酸在37℃下以20μM的濃度分別孵育0、4、24和48小時(shí)。樣品中存在的唯一的降解片段是n-1個(gè)對(duì)應(yīng)的寡核苷酸(15mer)，其缺乏3’末端的DNA殘基。甚至在48小時(shí)的消化后仍然沒(méi)有觀察到其他的降解片段。
圖13顯示在單劑量靜脈內(nèi)施用SEQ ID NO15(25mg/kg)后，其在來(lái)自NMRI小鼠的肝臟和腎臟中的水平。發(fā)現(xiàn)活性化合物SEQ IDNO15在肝臟和腎臟中的半壽期(T1/2)均是大約3天。這表明，SEQ IDNO15的最佳生物劑量的劑量方案可以比連續(xù)輸注和每日給藥(dailydosing)的頻率少。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)10-30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度的如下寡聚化合物具有有趣的生物學(xué)特性該化合物包含可與人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的區(qū)域特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，其中所述靶結(jié)合區(qū)具有下式5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA類似物核苷酸；其在靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸。
一般而言，相信相對(duì)于已知的寡聚化合物，本文定義的寡聚化合物具有改進(jìn)的性質(zhì)。“改進(jìn)的性質(zhì)”應(yīng)理解為寡聚化合物相比于它們的硫代磷酸酯對(duì)應(yīng)物表現(xiàn)出更好或相當(dāng)?shù)娜嫘再|(zhì)的一或多個(gè)參數(shù)。
這類改進(jìn)的參數(shù)的實(shí)例是更長(zhǎng)的藥物保存期、與靶(寡聚化合物或mRNA靶中的interim互補(bǔ)物)更高的結(jié)合常數(shù)、對(duì)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)核酸酶的優(yōu)異抗性、作用模式中的更大潛能、更好的表型反應(yīng)性、更持久的作用、更好的化學(xué)敏感性(chemosensitization)及改進(jìn)的患者便利性。相當(dāng)參數(shù)的實(shí)例是生產(chǎn)方便、制藥上配制方便、組織分布、良好的安全特性。
總的來(lái)說(shuō)，在下調(diào)Bcl-2mRNA方面、在蛋白質(zhì)的下調(diào)(Bcl2/Bax的比率從1nM開(kāi)始改變)和細(xì)胞增殖的抑制方面本文定義的寡聚化合物表現(xiàn)出IC50值在極低的納摩爾濃度范圍(5nM)內(nèi)。比奧利默森和Jepsen化合物觀察到的水平(在400nM處可見(jiàn)顯著下調(diào)水平)高很多的水平。此外，細(xì)胞死亡和凋亡誘導(dǎo)強(qiáng)烈相關(guān)，并且凋亡誘導(dǎo)的水平遠(yuǎn)比奧利默森更強(qiáng)。進(jìn)一步，與奧利默森相比，本文定義的寡聚化合物在大鼠血漿中表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的穩(wěn)定性及組織中更長(zhǎng)的半壽期。在前列腺和黑素瘤模型中觀察到多次抗腫瘤反應(yīng)，甚至在1mg/Kg/天下觀察到反應(yīng)。另外，與文獻(xiàn)中記載的奧利默森的常規(guī)劑量相比，觀察到該化合物以更低頻率使用時(shí)的抗腫瘤反應(yīng)。沒(méi)有監(jiān)測(cè)到藥理學(xué)相關(guān)劑量下的不良反應(yīng)，例如ASAT、ALAT的升高。我們的發(fā)明超越了Jepsen的構(gòu)建物，針對(duì)后者沒(méi)有檢測(cè)功能性反應(yīng)、穩(wěn)定性、組織中的半壽期、體內(nèi)反應(yīng)、臨床化學(xué)或生物分布。
本文引用的人Bcl-2mRNA序列可在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中以HUMBcl-2，登錄號(hào)M13994得到。在本申請(qǐng)的上下文中，核酸的編號(hào)，特別是mRNA或?qū)?yīng)的cDNA序列的編號(hào)，與以該登錄號(hào)在該數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的人Bcl-2 mRNA的相應(yīng)編號(hào)相關(guān)。對(duì)應(yīng)的cDNA序列可以從mRNA序列推導(dǎo)出，具體是用mRNA序列中的堿基U替換cDNA序列中的任何堿基T，反之亦然。
寡聚化合物寡聚化合物的特征在于它在靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸。
本文中使用的表述“靶結(jié)合區(qū)”指結(jié)合特定靶序列、本文中是指人Bcl-2 mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的區(qū)域的寡聚化合物區(qū)域(或甚至是這類寡聚化合物本身)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)連接的LNA核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)連接的LNA類似物核苷酸。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“寡聚化合物”指LNA寡核苷酸，即通過(guò)用LNA核苷酸或LNA核苷酸、特別是至少兩個(gè)LNA核苷酸取代其中的一個(gè)或多個(gè)(或全部)核苷酸修飾的核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)，并且可能有用LNA類似物核苷酸及核苷酸衍生物/類似物對(duì)核苷酸進(jìn)一步取代。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”包括含有天然產(chǎn)生的核苷堿基、糖和核苷間(主鏈)鍵的寡核苷酸及具有相似功能或具有特別改進(jìn)的功能的非天然產(chǎn)生部分的寡核苷酸。
本發(fā)明上下文中使用的寡聚化合物為10-30個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度，即10-25個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度，例如10-20個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度，如10-18個(gè)或10-16個(gè)或15-17個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度。
術(shù)語(yǔ)“核苷酸堿基長(zhǎng)度”指以與直鏈互補(bǔ)核酸分子雜交的核苷酸堿基數(shù)目計(jì)的長(zhǎng)度，即寡聚化合物與之雜交的互補(bǔ)核酸區(qū)域的核苷酸堿基總數(shù)。因此，寡聚化合物的長(zhǎng)度包括缺少核苷酸堿基的任何中間核苷酸。
在一個(gè)主要實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物(LNA寡核苷酸)包含至少兩個(gè)LNA核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物(LNA寡核苷酸)包含至少兩個(gè)LNA類似物核苷酸和可能的一個(gè)或多個(gè)LNA核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“至少兩個(gè)”包含大于或等于2的整數(shù)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17等。
術(shù)語(yǔ)“至少一個(gè)”包含大于或等于1的整數(shù)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17等。
針對(duì)核苷、核苷類似物、SEQ ID NO等使用的術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(一種)”意指一個(gè)(種)或多個(gè)(種)。具體而言，表述“一種(個(gè))組分(例如核苷、核苷類似物、SEQ ID NO等)選自…”意指可選擇一個(gè)或多個(gè)所引用的組分。因此，像“一種組分，選自A、B和C”這樣的表述意指包括A、B和C的所有組合，即A、B、C；A+B；A+C；B+C和A+B+C。
術(shù)語(yǔ)“LNA”(被鎖核酸(Locked Nucleic Acid))(或“LNA寡核苷酸”)指含有一個(gè)或多個(gè)二環(huán)核苷類似物的寡核苷酸，也指LNA核苷酸和LNA核苷酸類似物。
LNA寡核苷酸、LNA核苷酸和LNA類似物核苷酸概述于WO 99/14226以及后續(xù)申請(qǐng)WO 00/56746、WO00/56748、WO 00/66604、WO 00/125248、WO02/28875、WO2002/094250和PCT/DK02/00488之中，在此將它們?nèi)恳胱鳛閰⒖肌?br> 在本申請(qǐng)的上下文和權(quán)利要求中，發(fā)明人區(qū)分了“LNA核苷酸”和“LNA類似物核苷酸”。“LNA核苷酸”是式1的核苷酸 式1(LNA核苷酸)
這類LNA核苷酸通常是指“β-D-氧基-LNA”。
式1中的B構(gòu)成核苷堿基。核苷堿基包括天然產(chǎn)生的核苷堿基和非天然產(chǎn)生的核苷堿基。這類核苷堿基的示例性實(shí)例選自腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑基尿嘧啶(5-methylthiazoleuracil)、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、7-丙炔-7-脫氮腺嘌呤(deazaadenine)、7-丙炔-7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤(deazaguanine)和2-氯-6-氨基嘌呤。B的優(yōu)選實(shí)例是自腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
式1中的Z*選自核苷間連鍵合和端基，式1中的Z選自與前一核苷酸/核苷的核苷間連鍵的鍵和端基，當(dāng)然前提條件是Z和Z*中只有一個(gè)可以是端基。
作為Z*的可能含義的核苷間連鍵是指與隨后的核酸/核苷的核苷間連鍵。核苷間連鍵的實(shí)例是-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH選自氫和C1-4-烷基。優(yōu)選的核苷間連鍵是-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-。本發(fā)明的特別特征是兩個(gè)LNA核苷酸通過(guò)-O-P(O，S)-O-(硫代磷酸酯)基團(tuán)連接，即該核苷間連鍵優(yōu)選是硫代磷酸酯基團(tuán)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“C1-4-烷基”意指直鏈或支鏈飽和烴鏈，其中該鏈具有一至四個(gè)碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。
當(dāng)LNA核苷酸是寡聚化合物的5’-末端核苷酸時(shí)，Z*是端基；如果LNA核苷酸是寡聚化合物的3’-末端核苷酸時(shí)，Z是端基。這類端基一般選自氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Prot-O-、Act-O-、巰基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷基硫代、氨基、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、單-或二(C1-6-烷基)氨基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的C2-6鏈烯基、任選取代的C2-6-鏈烯氧基、任選取代的C2-6炔基、任選取代的C2-6-炔氧基、一磷酸酯、一硫代磷酸酯、二磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯、三硫代磷酸酯、DNA嵌入劑、光化學(xué)活性基團(tuán)、熱化學(xué)活性基團(tuán)、螯合基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、配體、羥基、砜、羥甲基、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、氨基甲基、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、羧甲基和砜甲基，其中Prot是-OH、-SH和-NH(RH)各自的保護(hù)基團(tuán)，Act是-OH、-SH和-NH(RH)各自的活化基團(tuán)，且RH選自氫和C1-6烷基。端基的優(yōu)選實(shí)例是氫、疊氮基、鹵素、氰基、硝基、羥基、Prot-O-、Act-O-、巰基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷基硫代、氨基、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、單-或二(C1-6-烷基)氨基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基、任選取代的一磷酸酯、一硫代磷酸酯、二磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯、三硫代磷酸酯，其中Prot是-OH、-SH和-NH(RH)各自的保護(hù)基團(tuán)，Act是-OH、-SH和-NH(RH)各自的活化基團(tuán)，且RH選自氫和C1-6-烷基。
羥基(和硫)取代基的保護(hù)基團(tuán)(Prot)包括取代的三苯甲基，例如4，4’-二甲氧基三苯甲氧基(4，4’-dimethoxytrityloxy，DMT)、4-一甲氧基三苯甲氧基(4-monomethoxytrityloxy，MMT)和三苯甲氧基(trityloxy)、任選取代的9-(9-苯基)呫噸氧基(xanthenyloxy)(pixyl)、任選取代的甲氧基四氫吡喃氧基(methoxytetrahydropyranyloxy，mthp)、甲硅烷氧基例如三甲基甲硅烷氧基(TMS)、三異丙基甲硅烷氧基(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷氧基(TBDMS)、三乙基甲硅烷氧基和苯基二甲基甲硅烷氧基、叔丁基醚、縮醛(包括兩個(gè)羥基基團(tuán))、酰氧基例如乙?；螓u素取代的乙?；?，即氯乙酰氧基或氟乙酰氧基、異丁酰氧基、新戊酰氧基(pivaloyloxy)、苯甲酰氧基和取代的苯甲?；?、甲氧基甲基氧基(methoxymethyloxy，MOM)和二芐醚或取代的二芐醚例如2，6-二氯芐氧基(2，6-Cl2Bzl)。羥基(和硫)取代基的優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)包括取代的三苯甲基例如4，4’-二甲氧基三苯甲氧基(DMT)、4-一甲氧基三苯甲氧基(MMT)、任選取代的9-(9-苯基)呫噸氧基(pixyl)、任選取代的甲氧基四氫吡喃氧基(mthp)、甲硅烷氧基例如三甲基甲硅烷氧基(TMS)、三異丙基甲硅烷氧基(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷氧基(TBDMS)、三乙基甲硅烷氧基和苯基二甲基甲硅烷氧基、叔丁基醚、縮醛(包括兩個(gè)羥基基團(tuán))和酰氧基例如乙?；?br> 氨基或酰胺基的保護(hù)基團(tuán)的示例性實(shí)例是芴基甲氧基-羰基氨基(Fmoc)、叔丁氧基羰基氨基(BOC)、三氟乙酰氨基、烯丙氧基羰基氨基(alloc，AOC)、Z芐氧基羰基氨基(Cbz)、取代的芐氧基羰基氨基例如2-氯芐氧基羰基氨基(2-Cbz)、一甲氧基三苯甲基氨基(MMT)、二甲氧基三苯甲基氨基(DMT)、鄰苯二甲酰氨基和9-(9-苯基)呫噸基氨基(pixyl)。優(yōu)選的實(shí)例是芴基甲氧基-羰基氨基(Fmoc)、叔丁氧基羰基氨基(BOC)、三氟乙酰氨基、烯丙氧基羰基氨基(alloc，AOC)、一甲氧基三苯甲基氨基(MMT)、二甲氧基三苯甲基氨基(DMT)、鄰苯二甲酰氨基。
基團(tuán)“Act”是指-OH、-SH和-NH(RH)各自的活化基團(tuán)，以便偶聯(lián)其他的核苷酸、固相、蛋白質(zhì)等。在上述實(shí)施方案中“Act”是指活化基團(tuán)。這類活化基團(tuán)例如選自任選取代的O-亞磷酰胺、任選取代的O-磷酸三酯、任選取代的O-磷酸二酯、任選取代的H-膦酸酯和任選取代的O-膦酸酯。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“亞磷酰胺”指式-P(ORx)-N(Ry)2的基團(tuán)，其中Rx是指任選取代的烷基，例如甲基、2-氰基乙基或芐基，且每個(gè)Ry指任選取代的烷基，例如乙基或異丙基，或-N(Ry)2基團(tuán)形成嗎啉代基團(tuán)(-N(CH2CH2)O)。Rx優(yōu)選是指2-氰基乙基，兩個(gè)Ry優(yōu)選相同并且指異丙基。因此，特別相關(guān)的亞磷酰胺是N，N-二異丙基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺。
如上所述，該寡聚化合物包含LNA核苷酸，可能與非LNA核苷酸的核苷酸相組合。這類核苷酸包括脫氧核糖核苷酸(DNA核苷酸)、核糖核苷酸(RNA核苷酸)、核苷酸衍生物、LNA類似物核苷酸、核苷酸類似物(不同于LNA)和PNA單元等。
核苷酸類似物和核苷酸衍生物描述于例如Freier & Altmann(Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443)和Uhlmann(Curr.Opinionin Drug & Development(2000，3(2)293-213))。方案1圖示就此選擇的實(shí)例 硫代磷酸酯 2’-O-甲基2’-MOE 2’-氟代 2’-AP HNA CeNA PNA 嗎啉代 2’-F-ANA 2’-(3-羥甲基)丙基 3’-亞磷酰胺 硼烷磷酸酯方案1術(shù)語(yǔ)“LNA類似物核苷酸”是那些概述于WO 99/14226以及后續(xù)申請(qǐng)WO 00/56746、WO 00/56748、WO 00/66604、WO 00/125248、WO02/28875、WO 2002/094250和WO 2003/006475(PCT/DK02/00488)(參考上述)的二環(huán)核苷酸類似物，但是排除已描述過(guò)的“LNA核苷酸”。
優(yōu)選的LNA類似物核苷酸的具體基團(tuán)實(shí)例以式2為例 式2(LNA類似物核苷酸)在式2中，X和Y獨(dú)立地選自-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-CH2-或-CH-(如果是雙鍵部分)、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-或-CH2-CH-(如果是雙鍵部分)、-CH＝CH-，其中R選自氫和C1-4烷基。不對(duì)稱基團(tuán)可以任一方向存在。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，X是氧，Y選自-O-、-S-、-N(H)-和-N(R)-，注意不包括“LNA核苷酸”(X＝O且Y＝O)。
本發(fā)明的寡聚化合物可以進(jìn)一步帶有針對(duì)LNA核苷酸中定義的那些Z和Z*基團(tuán)。
在式2中，四個(gè)手性中心以固定的構(gòu)型顯示。但是，本發(fā)明中也包括通式2中的化合物，其中這些手性中心以不同的構(gòu)型存在。因此，式2中的每個(gè)手性中心可以R或S構(gòu)型存在。R(rectus)和S(sinister)的定義描述于IUPAC 1974 Recommendations，E部分，F(xiàn)undamentalStereochemistry(基礎(chǔ)立體化學(xué))規(guī)則可見(jiàn)于Pure Appl.Chem.45，13-30，(1976)和“Nomenclature of organic Chemistry(有機(jī)化學(xué)命名法)”Pergamon，紐約，1979中發(fā)現(xiàn)。
“LNA類似物核苷酸”的具體例子以式I、II、III、IV、V和VI為例圖示 一個(gè)例子是“硫代-LNA”核苷酸，即其中式I、III、IV或VI中的至少一個(gè)X選自-S-或-CH2-S-的LNA類似物核苷酸。這種硫代-LNA可分別處于β-D-構(gòu)型(I和IV)和α-L-構(gòu)型(III和VI)。
另一個(gè)實(shí)例是“氨基-LNA”核苷酸，即其中式I、III、IV或VI中的至少一個(gè)X選自-N(H)-、-N(R)-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-的LNA類似物核苷酸，其中R選自氫和C1-4烷基。這種氨基-LNA可分別以β-D-構(gòu)型(I和IV)和α-L-構(gòu)型(III和VI)存在。
另一個(gè)實(shí)例是“ena-LNA”核苷酸，其中式II或V中的至少一個(gè)X是-CH2-O-的LNA類似物核苷酸。
β-D-氧基-LNAα-L-氧基-LNA在另一個(gè)實(shí)施方案中，該寡聚化合物包含“α-L-LNA”(即“阿爾法-L-LNA”)核苷酸，即式III和VI中所示的LNA核苷酸。
這就是說(shuō)，該LNA核苷酸類似物(如果存在)優(yōu)選選自β-D-氨基-LNA、β-D-硫代-LNA和α-L-氧基-LNA，更特別地，所有的LNA核苷酸類似物(如果存在)是α-L-氧代-LNA。
如上所述，本發(fā)明具體涉及10-30個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度的寡聚化合物，其包含與人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的區(qū)域特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，其中所述靶結(jié)合區(qū)具有下式5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA類似物核苷酸；該靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸。
因此，該寡聚化合物是10-30個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度，例如10-25個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度，例如10-20個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度，例如為10-18個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度或10-16個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度。其靶結(jié)合區(qū)具有多達(dá)18個(gè)核苷酸堿基/核苷酸，因?yàn)樵摪薪Y(jié)合區(qū)不可以比其應(yīng)當(dāng)“可特異結(jié)合”的區(qū)域更長(zhǎng)。然而，根據(jù)下文可以理解的是，該靶結(jié)合區(qū)不需要是18個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度，甚至當(dāng)寡聚化合物是18個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度或更長(zhǎng)時(shí)也不需要。例如，該寡聚化合物可以是20個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度，那么該靶結(jié)合區(qū)可以是18或17或16個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度等等。(因而，可以理解該寡聚化合物的任何不是所述靶結(jié)合區(qū)部分的核苷酸可以結(jié)合到靶mRNA指示區(qū)域附近的核苷堿基上。)然而，理想的是靶結(jié)合區(qū)代表寡聚化合物的主要部分。最優(yōu)選地，靶結(jié)合區(qū)組成不超過(guò)18個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的寡聚化合物的90％-100％，即，如果寡聚化合物具有多達(dá)18個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，那么靶結(jié)合區(qū)構(gòu)成它的90％-100％，如果寡聚化合物具有19個(gè)或更多個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，那么靶結(jié)合區(qū)具有16-18個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度(18個(gè)核苷酸的90％-100％)。更優(yōu)選的，靶結(jié)合區(qū)構(gòu)成整個(gè)寡聚化合物。
本文使用的“雜交”是指互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基之間的氫鍵鍵合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen、反相Hoogsteen氫鍵鍵合等。Watson和Crick在大約五十年前揭示了脫氧核糖核酸由兩條鏈組成，這兩條鏈通過(guò)它們中的反向互補(bǔ)核苷堿基間形成的氫鍵以螺旋構(gòu)型結(jié)合在一起。在DNA中普遍可見(jiàn)的四種核苷堿基是鳥(niǎo)嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)，其中G與C核苷堿基配對(duì)，A與T核苷堿基配對(duì)。在RNA中，核苷堿基胸腺嘧啶被核苷堿基尿嘧啶(U)替代，其與T類似地和A核苷堿基配對(duì)。參與標(biāo)準(zhǔn)雙鏈體形成的核苷堿基中的化學(xué)基團(tuán)組成Watson-Crick面(Watson-Crickface)。幾年后Hoogsteen揭示嘌呤核苷堿基(G和A)除了具有Watson-Crick面之外還具有可在雙鏈體外面識(shí)別的Hoogsteen面，其通過(guò)氫鍵鍵合結(jié)合嘧啶寡核苷酸，由此形成三螺旋結(jié)構(gòu)。
術(shù)語(yǔ)“可特異性雜交”是指所述的寡聚化合物能夠與靶mRNA足夠強(qiáng)和特異性地結(jié)合，以便提供對(duì)靶mRNA正常功能的期望干擾，同時(shí)使非靶mRNA的功能不受干擾。相關(guān)的雜交和由此的功能干擾在大約37℃的生理?xiàng)l件下發(fā)生。然而，這并不排除在靶結(jié)合區(qū)中可以存在一個(gè)或兩個(gè)錯(cuò)配。靶結(jié)合區(qū)優(yōu)選不包括錯(cuò)配或最多有一個(gè)錯(cuò)配(進(jìn)一步參見(jiàn)下文)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶mRNA”是指編碼人Bcl-2蛋白的人Bcl-2mRNA。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指通過(guò)寡聚化合物與編碼人Bcl-2蛋白的人Bcl-2mRNA的結(jié)合而降低(抑制)人Bcl-2基因的表達(dá)。
通過(guò)靶結(jié)合區(qū)與靶mRNA的指定區(qū)域的結(jié)合獲得“特異性雜交”。應(yīng)該理解的是，靶結(jié)合區(qū)不需要結(jié)合靶mRNA的全部18個(gè)核苷酸區(qū)域，在寡聚化合物并且由此地靶結(jié)合區(qū)具有少于18個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)度時(shí)尤其如此。然而，靶結(jié)合區(qū)優(yōu)選結(jié)合靶mRNA的指定區(qū)域中至少10個(gè)核苷堿基的一個(gè)片段，例如10-18或10-17或10-16或10-15或10-14范圍內(nèi)的一個(gè)片段。
一般優(yōu)選地，靶結(jié)合區(qū)中的大量核苷酸連鍵(更準(zhǔn)確地，核苷間的連鍵，即核苷間鍵合)是硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)。更優(yōu)選地，至少70％，例如至少80％或至少87％或至少93％的核苷酸連鍵是硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)。在具體的實(shí)施方案中，所有的核苷酸連鍵是硫代磷酸酯基團(tuán)。更具體地，寡聚化合物中的所有核苷酸連鍵是硫代磷酸酯基團(tuán)。
在許多實(shí)施方案中，靶結(jié)合區(qū)中的至少3個(gè)，例如至少4個(gè)、至少5個(gè)或甚至至少6個(gè)、至少7個(gè)或至少8個(gè)核苷堿基是LNA核苷酸的核苷堿基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶結(jié)合區(qū)中的至少3個(gè)，例如至少4個(gè)、至少5個(gè)或甚至至少6個(gè)、至少7個(gè)或至少8個(gè)核苷堿基是LNA類似物核苷酸的核苷堿基。
在關(guān)于表1中的許多具體序列的優(yōu)選實(shí)施方案中，靶結(jié)合區(qū)中的10-50％核苷堿基是LNA核苷酸的核苷堿基。
在一些優(yōu)選的設(shè)計(jì)中，所述靶結(jié)合區(qū)中的兩個(gè)5’-末端核苷堿基是LNA核苷酸的核苷堿基。
在其他優(yōu)選的設(shè)計(jì)中，所述靶結(jié)合區(qū)中的兩個(gè)5’-末端核苷堿基是DNA或RNA核苷酸的核苷堿基及隨后的LNA核苷酸的核苷堿基，特別是DNA或RNA核苷酸及隨后的LNA核苷酸的兩個(gè)核苷堿基。
在另一個(gè)優(yōu)選的設(shè)計(jì)中，所述靶結(jié)合區(qū)中的3’-末端核苷堿基是DNA或RNA核苷酸的核苷堿基。
在其變通方案中，所述靶結(jié)合區(qū)中的兩個(gè)3’-末端核苷堿基是DNA或RNA核苷酸的核苷堿基及隨后的LNA核苷酸的核苷堿基。
在另一個(gè)優(yōu)選的設(shè)計(jì)中，所述靶結(jié)合區(qū)中的兩個(gè)3’-末端核苷堿基是LNA核苷酸的核苷堿基。
該寡聚化合物具有含gapmer設(shè)計(jì)的靶結(jié)合區(qū)，例如LNA/(非-LNA)/LNA gapmer設(shè)計(jì)。上面定義的gapmer構(gòu)建物的具體變體是具有選自下面的通式的靶結(jié)合區(qū)5′-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3′；5′-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3′；5′-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3′；和5′-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3′.
相信上述四種gapmer類型將產(chǎn)生相同類型的活性種類，即通過(guò)外切核酸酶裂解5’-或3’-DNA部分后的5’-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3’型gapmer，參見(jiàn)實(shí)施例15。因此，因?yàn)镾EQID NO15是特別優(yōu)選的gapmer(和具體化合物)，因而相信SEQ IDNO29是同等令人感興趣的。同樣，因?yàn)镾EQ ID NO8是特別優(yōu)選的gapmer(和具體化合物)，因而相信SEQ ID NO35是同等令人感興趣的。
具體的設(shè)計(jì)是靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，特別是5’-[(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’。
表述“(LNA/LNA*)”是指所述區(qū)段(即含有2-7個(gè)核苷酸的區(qū)段)可包括LNA核苷酸、LNA類似物核苷酸或此兩者。同理，區(qū)段“(DNA/RNA/LNA*)”可包括脫氧核糖核苷酸(DNA核苷酸)、核糖核苷酸(RNA核苷酸)和LNA類似物核苷酸以及它們的組合。區(qū)段“(DNA/RNA)”可包括脫氧核糖核苷酸(DNA核苷酸)和核糖核苷酸(RNA核苷酸)或此兩者。
相信-(DNA/RNA/LNA*)4-14-亞區(qū)段應(yīng)該可以募集RNA酶H，理由是該亞區(qū)段優(yōu)選由α-L-LNA核苷酸形式的DNA核苷酸或LNA類似物核苷酸、特別是DNA核苷酸組成。雖然亞區(qū)段定義為長(zhǎng)度為4至14個(gè)核苷堿基，但是相信在7至12個(gè)核苷堿基范圍內(nèi)的長(zhǎng)度，例如10至12個(gè)核苷堿基，特別是11個(gè)核苷堿基可產(chǎn)生特別有用的gapmer，參見(jiàn)表1。
因此，更具體的設(shè)計(jì)是其中靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[(LNA/LNA*)2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA/LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，特別是5’-[(LNA/LNA*)2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA/LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’的類型。
另一個(gè)特別令人感興趣的設(shè)計(jì)是其中靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA/RNA)]-3’，特別是5’-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4(DNA/RNA)]-3’。另一個(gè)特別令人感興趣的設(shè)計(jì)是其中靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’或5’-[LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’，例如，5’-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’或5’-[LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’，特別是5’-[LNA2-4(DNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’或5’-[LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’的類型。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，特別是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，特別是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA/RNA)]-3’或5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’，特別是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA/RNA)]-3’。另一個(gè)特別令人感興趣的設(shè)計(jì)是其中靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7-(DNA)]-3’，例如5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5-(DNA)]-3’，特別是5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(RNA)]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4-(DNA)]-3’的類型。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3’，特別是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3’，例如5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5]-3’，特別是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[(DNA/RNA)-(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4]-3’，特別是式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’。另一個(gè)特別令人感興趣的設(shè)計(jì)是其中靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7]-3’，例如5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5]-3或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5]-3’，特別是5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’或5’-[(DNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’或5’-[(RNA)-LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4]-3’。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7]-3’，特別是式5’-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3’，例如5’-[(LNA/LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA/LNA*2-5]-3’，特別是式5’-[(LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[(LNA/LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA/LNA*2-4]-3’，特別是式5’-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’。另一個(gè)特別令人感興趣的設(shè)計(jì)是其中靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[LNA2-7-(DNA)5-14-LNA2-7]-3’或5’-[LNA2-7-(DNA/α-L-LNA)5-14-LNA2-7]-3’，例如5’-[LNA2-5-(DNA)7-12-LNA2-5]-3’或5’-[LNA2-5-(DNA/α-L-LNA)7-12-LNA2-5]-3’，特別是5’-[LNA2-4-(DNA)10-12-LNA2-4]-3’或5’-[LNA2-4-(DNA/α-L-LNA)10-12-LNA2-4]-3的類型。
在一些實(shí)施方案中，寡聚化合物還包含LNA類似物核苷酸(本文中命名為“LNA*”)。特別地，靶結(jié)合區(qū)中核苷堿基的10-100％或0-90％，例如10-50％是LNA類似物核苷酸(“LNA*”)的核苷堿基。
在其變通方案中，靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，特別是式5’-[LNA*2-7-(DNA)4-14-LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’，例如5’-[(LNA*)2-5-(DNA/RNA/LNA*)7-12-LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，特別是5’-[(LNA*)2-5-(DNA)7-12-LNA*2-5-(DNA/RNA)]-3’，或5’-[(LNA*)2-4-(DNA/RNA/LNA*)10-12-LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’，特別是5’-[LNA*2-4-(DNA)10-12-LNA*2-4-(DNA/RNA)]-3’。
如上所述，寡聚化合物應(yīng)當(dāng)與靶mRNA的指定區(qū)域特異性雜交。更具體地，該靶結(jié)合區(qū)與和其特異性雜交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的區(qū)域部分互補(bǔ)，其中可能有至多2個(gè)非互補(bǔ)核苷堿基。
本發(fā)明的上下文中的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”指靶mRNA相關(guān)區(qū)域的核苷酸和靶結(jié)合區(qū)的核苷酸之間準(zhǔn)確配對(duì)的能力。例如，如果靶mRNA的某個(gè)位點(diǎn)的核苷酸能夠與靶結(jié)合區(qū)的核苷酸氫鍵鍵合，那么，認(rèn)為該靶mRNA和該靶結(jié)合區(qū)在這個(gè)位點(diǎn)彼此互補(bǔ)。(從上面又可以理解，該靶結(jié)合區(qū)是對(duì)應(yīng)于人Bcl-2mRNA的指定區(qū)域或其短片段)。術(shù)語(yǔ)“非互補(bǔ)核苷堿基”自然指具體核苷酸的核苷堿基不互補(bǔ)的情形。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該靶結(jié)合區(qū)與和其特異性雜交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的區(qū)域部分互補(bǔ)。
該實(shí)施方案中優(yōu)選化合物的例子是包含選自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52、特別是SEQ ID NO8(和35)的靶結(jié)合區(qū)的那些化合物。在一個(gè)變通方案中，該靶結(jié)合區(qū)是SEQ ID NO8。在另一個(gè)變通方案中，該靶結(jié)合區(qū)是SEQ ID NO35。
更優(yōu)選的化合物是選自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52的那些化合物，特別是SEQ ID NO8(和35)。在一個(gè)變通方案中，該化合物是SEQ ID NO8。在另一個(gè)變通方案中，該化合物是SEQ ID NO35。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該靶結(jié)合區(qū)除了l-2個(gè)非互補(bǔ)核苷堿基外，尤其是除了1個(gè)非互補(bǔ)核苷堿基外，與和其特異性雜交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的區(qū)域部分互補(bǔ)。因此，允許有至多兩個(gè)錯(cuò)配(非互補(bǔ)核苷堿基)，但是通常僅引入一個(gè)錯(cuò)配。這種錯(cuò)配最常存在于寡聚化合物的DNA/RNA/LNA*區(qū)段內(nèi)，例如存在于具有包含式5’-[(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-LNA/LNA*2-7-(DNA/RNA)]-3’區(qū)段的靶結(jié)合區(qū)之化合物的DNA/RNA/LNA*區(qū)段中。
在其一個(gè)變通方案中，該靶結(jié)合區(qū)包含GCGXGCGC亞序列，其中X不是T(胸腺嘧啶)。具體地，X是C(胞嘧啶)或X是A(腺嘌呤)或X是G(鳥(niǎo)嘌呤)。
在其另一個(gè)變通方案中，該靶結(jié)合區(qū)包含CCCAXCGT亞序列，其中X不是G(鳥(niǎo)嘌呤)。具體地，X是A(腺嘌呤)或X是T(胸腺嘧啶)或X是C(胞嘧啶)。
在其另一個(gè)變通方案中，該靶結(jié)合區(qū)包含CAGXGTG亞序列，其中X不是C(胞嘧啶)。具體地，X是A(腺嘌呤)或X是T(胸腺嘧啶)或X是G(鳥(niǎo)嘌呤)。
在其另一個(gè)變通方案中，該靶結(jié)合區(qū)包含AGCXTGC亞序列，其中X不是G(鳥(niǎo)嘌呤)。具體地，X是A(腺嘌呤)或X是T(胸腺嘧啶)或X是C(胞嘧啶)。
該實(shí)施方案中優(yōu)選化合物的例子是包含選自SEQ ID NO15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55的靶結(jié)合區(qū)、特別是SEQ ID NO15(和29)的那些化合物。在一個(gè)變通方案中，該靶結(jié)合區(qū)是SEQ ID NO15。在另一個(gè)變通方案中，該靶結(jié)合區(qū)是SEQ ID NO29。
更優(yōu)選的化合物是選自SEQ ID NO15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55的那些化合物，特別是SEQ ID NO15(和29)。在一個(gè)變通方案中，該化合物是SEQ IDNO15。在另一個(gè)變通方案中，該化合物是SEQ ID NO29。
這就是說(shuō)，現(xiàn)在相信對(duì)于期望的生物學(xué)效果而言，寡聚化合物SEQID NO8(以及35)和寡聚化合物SEQ ID NO15(以及29)相比于奧利默森鈉(SEQ ID NO56，參比)有顯著的優(yōu)勢(shì)，參見(jiàn)實(shí)施例。
本發(fā)明人已揭示相比于同樣劑量的SEQ ID NO56(參比)，當(dāng)腹膜內(nèi)施用7mg/kg的SEQ ID NO8計(jì)14時(shí)，在黑素瘤518A2 scid小鼠異種移植物模型中體內(nèi)腫瘤重量有進(jìn)一步減少，參見(jiàn)圖11。當(dāng)SEQID NO8以比SEQ ID NO56(參比)低7倍的劑量施用時(shí)，其顯示相同的抗腫瘤活性。
在圖13中顯示了在單劑量靜脈內(nèi)施用SEQ ID NO15(25mg/kg)后，其在來(lái)自NMRI小鼠的肝臟和腎臟中的水平。發(fā)現(xiàn)活性化合物SEQID NO15在肝臟和腎臟中的半壽期(T1/2)均是大約3天。這表明SEQID NO15的最佳生物劑量的給藥方案可以比連續(xù)輸注和每天給藥的頻率低。
本發(fā)明人已證明，相比于鹽水對(duì)照，在前列腺PC3無(wú)胸腺裸鼠異種移植物模型中第7-15天中的每天或第8、11、13、15、18、20天使用SEQ ID NO15的體內(nèi)腫瘤體積的有效減小。該化合物以10mg/kg腹膜內(nèi)施用14天。處理后觀察腫瘤生長(zhǎng)8天。
這就是說(shuō)，本發(fā)明的寡聚化合物在分布的合適體內(nèi)譜圖及下調(diào)Bcl-2方面具有合適的體內(nèi)模式，從而具有與各種Bcl-2相關(guān)疾病、特別是癌癥的治療相關(guān)性。
寡聚化合物的制備本發(fā)明的寡聚化合物可以按照實(shí)施例1和2及WO 99/14226、WO00/56746、WO00/56748、WO 00/66604、WO 00/125248、WO02/28875、WO2002/094250、PCT/DK02/00488和Herdewijin，P.，Oligonucleotide Synthesis，Methods and Applications，第127-145頁(yè)，Humana Press，Totowa，New Jersey，2005的描述制備。因此，本發(fā)明的寡聚化合物可以使用有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員眾所周知的核酸化學(xué)聚合技術(shù)來(lái)制備。一般而言，使用亞磷酸胺方法(S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1993，49，6123；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223)的標(biāo)準(zhǔn)寡聚反應(yīng)循環(huán)，但是也可以使用例如H-膦酸酯化學(xué)、磷酸三酯化學(xué)法。
對(duì)于本發(fā)明的一些單體，使用了較長(zhǎng)的偶聯(lián)時(shí)間，和/或與新試劑的反復(fù)偶聯(lián)，和/或更濃縮的偶聯(lián)試劑。
所使用的亞磷酸胺以＞95％的令人滿意的分步偶聯(lián)產(chǎn)率進(jìn)行偶聯(lián)。通過(guò)例如將用于合成磷酸二酯寡聚物的常規(guī)碘/吡啶/H2O氧化換成使用ADTT試劑(蒼耳烷氫化物(在體積比為9∶1的乙腈∶吡啶中0.01M))的氧化，進(jìn)行磷酸鹽的硫醇化。也包括其他硫醇化試劑，例如Beaucage。有效地合成了該硫代磷酸酯LNA寡聚物，分步偶聯(lián)產(chǎn)率＞＝98％。
使用亞磷酸胺步驟也有效地合成了β-D-氨基-LNA、β-D-硫代-LNA寡核苷酸、α-L-LNA和β-D-甲基氨基-LNA寡核苷酸，分步偶聯(lián)產(chǎn)率≥98％。
使用一次性反相純化柱和/或反相HPLC和/或通過(guò)乙醇或丁醇的沉淀進(jìn)行LNA寡聚化合物的純化。毛細(xì)管凝膠電泳、反相HPLC、MALDI-MS和ESI-MS用于證實(shí)合成的寡核苷酸的純度。此外，特別令人感興趣的是具有固定于其上的任選核苷堿基保護(hù)的LNA和任選5’-OH保護(hù)的LNA的固體支持物作為用于合成含有LNA的寡聚化合物的物質(zhì)，其中LNA核苷酸包括在3’末端。在這種情況下，該固體支持物優(yōu)選是CPG，例如可獲得(市售)的CPG物質(zhì)或聚苯乙烯，其上通過(guò)供應(yīng)商針對(duì)該具體物質(zhì)規(guī)定的條件，連接上3’-官能化的、任選核苷堿基保護(hù)的LNA或3’-官能化的、任選5’-OH保護(hù)的LNA。鹽本發(fā)明的寡聚化合物可以多種藥學(xué)上可接受的鹽使用。本文使用的該術(shù)語(yǔ)是指保持此處鑒別的化合物的期望生物活性并顯示最小的不期望的毒理作用的鹽。這類鹽的非限定性實(shí)例可由有機(jī)氨基酸和堿加成鹽形成，所述堿加成鹽與金屬陽(yáng)離子例如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘、鈉、鉀等，或由氨、N，N-二芐基亞乙二胺、D-葡糖胺、四乙銨或乙二胺形成；或(c)(a)和(b)的組合，例如單寧酸鋅鹽等。
這類鹽例如是由具有酸性基團(tuán)、例如羧基基團(tuán)、磷酸二酯基團(tuán)或硫代磷酸酯基團(tuán)的本發(fā)明化合物形成的，例如與合適堿形成的鹽。這些鹽包括，例如源自元素周期表第Ia、Ib、IIa和IIB族金屬的無(wú)毒金屬鹽，特別是合適的堿金屬鹽，例如鋰鹽、鈉鹽或鉀鹽，或堿土金屬鹽，例如鎂鹽或鈣鹽。它們進(jìn)一步包括鋅鹽和銨鹽，還包括和適合的有機(jī)胺形成的鹽，例如未取代的或羥基取代的一、二或三烷基胺，特別是一、二或三烷基胺，或和季銨化合物，例如和N-甲基-N-乙基胺、二乙胺、三乙胺、單、雙或三-(2-羥基-低級(jí)烷基)胺，例如單、雙或三-(2-羥乙基)胺、2-羥基-叔丁基胺或三(羥甲基)甲胺、N，N-二低級(jí)烷基-N-(羥基-低級(jí)烷基)胺，例如N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)胺或三-(2-羥乙基)胺或N-甲基-D-葡糖胺，或例如四丁基銨鹽的季銨化合物形成的鹽。優(yōu)選鋰鹽、鈉鹽、鎂鹽、鋅鹽或鉀鹽，特別優(yōu)選鈉鹽。
具有堿性基團(tuán)例如氨基或亞氨基的本發(fā)明化合物可以形成酸加成鹽，例如和無(wú)機(jī)酸、例如和諸如鹽酸的氫鹵酸、硫酸或磷酸形成鹽，或和有機(jī)羧酸、磺酸(sulfonic acid)、硫代酸(sulfo acid)或膦酸或N-取代的氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、甲基馬來(lái)酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙氧基苯甲酸、embonic酸、煙酸或異煙酸形成鹽，以及和氨基酸形成鹽，例如和氨基酸形成鹽，且還可和甲磺酸、乙磺酸、2-羥基甲磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯二磺酸、4-甲基苯二磺酸、萘磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡糖磷酸或N-環(huán)己氨基磺酸(和形成甜蜜素(cyclamate))形成鹽，或和其他酸性有機(jī)化合物例如抗壞血酸形成鹽。
具有酸性和堿性基團(tuán)二者的本發(fā)明化合物也可以形成內(nèi)鹽。例如苦味酸鹽或高氯酸鹽的藥學(xué)不合適鹽可用于分離和純化。
只有在正確使用時(shí)無(wú)毒的藥學(xué)上允許的鹽才被用于治療目的，因此是優(yōu)選的鹽。
綴合物本發(fā)明另一方面涉及包含本文定義的化合物的綴合物，所述化合物上共價(jià)連接了至少一個(gè)非核苷酸或非多核苷酸部分。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“綴合物”旨在表示異質(zhì)分子(heterogenous molecule)，其通過(guò)本文描述的寡聚化合物(即，包含核苷或核苷類似物序列的化合物)和一個(gè)或多個(gè)非核苷酸或非多核苷酸部分的共價(jià)連接而形成。
因此，該寡聚化合物可以例如是綴合的，或與非核苷酸或非多核苷酸部分形成嵌合體，所述非核苷酸或非多核苷酸部分包括肽核酸(PNA)、蛋白質(zhì)(例如靶蛋白質(zhì)的抗體)、大分子、低分子量藥物、脂肪酸鏈、糖殘基、糖蛋白、聚合物(例如聚乙二醇)、膠束形成基團(tuán)、抗體、糖類、受體結(jié)合基團(tuán)、甾族化合物例如膽固醇、多肽、插入劑例如吖啶衍生物、長(zhǎng)鏈醇、樹(shù)枝狀聚合物(dendrimer)、磷脂和其他親油基或它們的組合等，該寡聚化合物可以以二聚化或樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)排列。本發(fā)明的化合物或綴合物也可與活性藥物綴合或進(jìn)一步綴合，所述活性藥物例如阿司匹林、ibuprofen、磺胺藥、抗糖尿病的制劑、抗菌劑、化療化合物或抗生素。
這種方式的綴合為本發(fā)明的寡聚化合物帶來(lái)了藥物動(dòng)力學(xué)特征方面的有益性質(zhì)。特別地，這種方式的綴合實(shí)現(xiàn)了增加的細(xì)胞攝入。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物連接到配體上形成綴合物，所述配體是為了增加綴合物相對(duì)于反義寡核苷酸的細(xì)胞攝入。該綴合可出現(xiàn)在末端位置5’/3’-OH，但是該配體也可以出現(xiàn)在糖和/或堿基上。綴合物/配體的實(shí)例是膽固醇部分，Soutschek等人，Nature，432，173-178(2004)，雙鏈體插入劑例如吖啶、聚-L-賴氨酸、以一個(gè)或多個(gè)核酸酶-抗性連接基團(tuán)例如一硫代磷酸、運(yùn)鐵蛋白復(fù)合體(Wagner等人，Pro.Natl.美國(guó)87，3410-3414(1990))、葉酸衍生物(Low等人，美國(guó)專利5,108,921號(hào)，也參見(jiàn)Leamon等人，Pro.Natl Acad.Sci.88，5572(1991))等的“封端”。
前藥在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，寡聚化合物可以是前藥的形式。實(shí)際上，寡核苷酸是帶負(fù)電荷的離子。由于細(xì)胞膜的親脂性，相比于中性或親脂性對(duì)應(yīng)物，寡核苷酸的細(xì)胞攝入有所減少。該極性“障礙”通過(guò)使用前藥方法可以避免(見(jiàn)，例如Crook，R.M.(1998)在Crook，S.T.，Antisense Research and Application.Springer-Verlag，Berlin，德國(guó)，第131卷，第103-140頁(yè))。在該方法中，寡聚化合物以被保護(hù)的方式制備，使得該寡聚化合物在施用時(shí)是中性的。這些保護(hù)基團(tuán)被設(shè)計(jì)成當(dāng)寡聚化合物被細(xì)胞攝入時(shí)，它們可以被除去。這類保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例是S-乙酰硫乙基(SATE)或S-新戊酰基硫乙基(叔丁基-SATE)。這些保護(hù)基團(tuán)是核酸酶抗性，可以在細(xì)胞內(nèi)選擇性除去。
治療原理本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明的LNA寡聚化合物基于多種不同的機(jī)理可用于抗擊Bcl-2相關(guān)的疾病，這屬于本發(fā)明的精神。
例如，LNA寡聚化合物可設(shè)計(jì)成反義抑制劑，其是單鏈核酸，通過(guò)在mRNA水平上進(jìn)行干預(yù)而防止生成致病蛋白質(zhì)。同時(shí)，它們可設(shè)計(jì)成免疫調(diào)節(jié)劑寡核苷酸(IMO)、核酶或是反義寡核苷酸的oligozyme，它們除了含有一個(gè)或多個(gè)靶結(jié)合區(qū)之外還含有降解靶mRNA(oligozyme)的催化活性，或含有募集降解靶mRNA(oligozyme)的內(nèi)源酶(RNA酶P)的外部引導(dǎo)序列(EGS)。
同樣，LNA寡聚化合物可被設(shè)計(jì)成siRNA，其是小的雙鏈RNA分子，可被細(xì)胞利用，通過(guò)至今仍了解甚少的“反義樣”機(jī)制沉默特定內(nèi)源或外源基因。
寡聚化合物也可被設(shè)計(jì)成Aptamer(及其變異體，稱為spiegelmer)，其是通過(guò)分子內(nèi)氫鍵結(jié)合而形成三維結(jié)構(gòu)，使得它們能夠以高親和性和特異性結(jié)合并阻斷它們的生物靶的核酸。同樣，LNA寡聚化合物可被設(shè)計(jì)成小的雙鏈核酸形式的Decoy，其通過(guò)選擇性封閉它們的DNA結(jié)合位點(diǎn)而防止細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子反式激活它們的靶基因。
另外，LNA寡聚化合物可被設(shè)計(jì)成Chimeraplast，其是能夠和靶基因序列特異性配對(duì)并將其改變的小的單鏈核酸。因此，含有利用該機(jī)理的寡聚化合物的LNA特別可用于治療由于Bcl-2基因中的突變導(dǎo)致的Bcl-2相關(guān)疾病。
最后，LNA寡聚化合物可被設(shè)計(jì)成TFO(形成三鏈體的寡核苷酸)，其是與雙鏈DNA結(jié)合并通過(guò)RNA轉(zhuǎn)錄水平上的干預(yù)而防止生成致病蛋白質(zhì)的核酸。就LNA寡聚化合物可以發(fā)揮其治療作用的上述原理而言，本發(fā)明的靶是Bcl-2mRNA。
該LNA寡聚化合物與包含翻譯起始位點(diǎn)的人Bcl-2mRNA的部分，即編碼人Bcl-2蛋白的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基之間的區(qū)域相雜交。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，優(yōu)選的LNA寡聚化合物是與人Bcl-2mRNA的部分雜交的那些，所述人Bcl-2mRNA的序列在不相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物中不常出現(xiàn)，從而可以維持治療的特異性。
本發(fā)明的寡聚化合物被設(shè)計(jì)成與靶充分互補(bǔ)，以便提供期望的臨床反應(yīng)，例如該寡聚化合物必須與它的靶以足夠的強(qiáng)度和特異性相結(jié)合，以獲得希望的效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LNA寡聚化合物被設(shè)計(jì)成也可調(diào)節(jié)不編碼人Bcl-2蛋白的其他特異核酸。
優(yōu)選本發(fā)明的寡聚化合物被設(shè)計(jì)成可避免分子內(nèi)和分子間寡核苷酸雜交的形式。
反義藥物在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，LNA寡聚化合物以合適的反義藥物形式呈遞。有效和安全的反義藥物的設(shè)計(jì)需要微調(diào)各種參數(shù)，例如效力/效能、親和性/特異性、生物流體中的穩(wěn)定性、細(xì)胞攝入、作用方式、藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和毒性。
親和性和特異性具有氧亞甲基2’-O，4’-C鍵的LNA(β-D-氧基-LNA)顯示出對(duì)DNA和RNA靶序列的空前結(jié)合特性、同樣，LNA的衍生物，例如氨基-、硫代-和α-L-氧基-LNA表現(xiàn)出對(duì)互補(bǔ)RNA和DNA的空前親和性，而在硫代-LNA的情況下，其對(duì)RNA的親和性甚至大于β-D-氧基-LNA。
除了這些顯著的雜交特性外，LNA核苷酸還可以和DNA及RNA核苷酸以及其他核酸類似物例如2’-O-烷基改性的RNA單體混合并協(xié)同作用。同樣的，本發(fā)明的寡核苷酸可完全由β-D-氧基-LNA核苷酸組成，或者它可以由β-D-氧基-LNA與DNA、RNA核苷酸或同代核酸類似物的任意組合組成，所述同代核酸類似物包括LNA衍生物，例如氨基-LNA、硫代-LNA和α-L-氧基-LNA。根據(jù)本發(fā)明，LNA對(duì)DNA和RNA靶序列的空前結(jié)合親和性及其與DNA、RNA和一系列同代核酸類似物自由混合的能力對(duì)于研發(fā)有效和安全的反義藥物有一系列重要影響。此外，含有LNA的寡核苷酸表現(xiàn)出優(yōu)異的水溶性。
首先，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，它能夠?qū)⒎戳x核苷酸的通常長(zhǎng)度縮短相當(dāng)多(例如從20-25mer縮短至12-16mer)而不損害藥理學(xué)活性所需要的親和性。由于寡核苷酸本身的特異性和其長(zhǎng)度反相關(guān)，這種縮短將顯著地增加反義化合物對(duì)其RNA靶的特異性。由于可得到人類基因組序列，并且對(duì)其基因的闡明快速進(jìn)展，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是在靶mRNA中鑒別盡可能短的特有序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用LNA減小反義寡核苷酸的大小顯著縮短了工藝過(guò)程并降低了費(fèi)用，因此為反義治療提供了基礎(chǔ)，可以作為多種疾病的商業(yè)上有競(jìng)爭(zhēng)力的治療選擇方案。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，LNA的空前親和性可用于充分提高寡聚化合物與其靶mRNA體內(nèi)雜交的能力，因此，相對(duì)于其他化學(xué)物的情況而言，可顯著降低鑒定活性化合物所需的時(shí)間和努力(工作)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，LNA的空前親和性可用于提高反義寡核苷酸的效力，因此，能夠研發(fā)相對(duì)于那些目前臨床治療中應(yīng)用的化合物而言具有更加有益的治療性質(zhì)的化合物。
當(dāng)設(shè)計(jì)為反義抑制劑時(shí)，本發(fā)明的寡核苷酸與靶核酸特異性及選擇性結(jié)合，并調(diào)節(jié)其相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。優(yōu)選地，相對(duì)于正常表達(dá)水平而言，這類調(diào)節(jié)引起至少10％至20％的表達(dá)抑制，更優(yōu)選地，相對(duì)于正常表達(dá)水平而言，引起至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的抑制。
生物流體中的穩(wěn)定性本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括將LNA核苷酸摻入標(biāo)準(zhǔn)的DNA或RNA寡核苷酸中來(lái)提高所得寡聚化合物在生物流體中的穩(wěn)定性，例如通過(guò)增加對(duì)核酸酶(內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶)的抗性。穩(wěn)定性的程度將依賴于所使用的LNA核苷酸的數(shù)目、它們?cè)诠押塑账嶂械奈恢煤退褂玫腖NA核苷酸的類型。相比于DNA和硫代磷酸酯，穩(wěn)定寡核苷酸抗核酸水解降解的能力的順序如下DNA＜＜硫代磷酸酯～氧基-LNA＜α-L-LNA＜氨基-LNA＜硫代-LNA。
既然LNA與標(biāo)準(zhǔn)DNA合成兼容并可與許多同代核酸類似物自由混合，那么可通過(guò)摻入表現(xiàn)增加的核酸酶穩(wěn)定性的其他類似物或通過(guò)使用核酸酶抗性核苷間鍵，例如一硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和膦酸甲酯鍵等，可以按照本發(fā)明進(jìn)一步增強(qiáng)LNA-寡聚化合物的核酸酶抗性。
作用方式本發(fā)明的反義化合物可通過(guò)多種機(jī)理發(fā)揮他們的治療作用，并能夠與多個(gè)相同的化合物組合。在一個(gè)方案中，寡核苷酸與其靶(前mRNA或mRNA)的結(jié)合可防止靶發(fā)揮正確功能所需要的其他因子(蛋白質(zhì)、其他核酸等)的結(jié)合，即通過(guò)位阻實(shí)現(xiàn)。例如，反義寡核苷酸可與對(duì)于識(shí)別和結(jié)合剪接、多聚腺苷酸化、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA中的核苷轉(zhuǎn)錄后的修飾、5’-末端加帽、翻譯等重要的前mRNA或mRNA中的序列基序結(jié)合。在前mRNA剪接的情況下，寡核苷酸及其靶間的相互作用結(jié)果可以是抑制不期望的蛋白質(zhì)的表達(dá)、編碼希望的蛋白質(zhì)的可變剪接mRNA的產(chǎn)生，或兩者。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與其靶的結(jié)合通過(guò)對(duì)核糖體的機(jī)制產(chǎn)生物理阻礙而使翻譯過(guò)程不能進(jìn)行，即翻譯終止。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與其靶的結(jié)合干擾了RNA產(chǎn)生對(duì)于其正確功能很重要的二級(jí)和更高級(jí)結(jié)構(gòu)的能力即結(jié)構(gòu)干擾。例如，寡核苷酸可干擾在多種功能中具有重要作用的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)形成，這種重要作用例如為RNA提供額外的穩(wěn)定性或?qū)Σ煌牡鞍踪|(zhì)使用基本的識(shí)別基序。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與其靶的結(jié)合通過(guò)募集降解mRNA的細(xì)胞酶而使靶對(duì)于其他的細(xì)胞代謝過(guò)程失活。例如，寡核苷酸可包含能夠募集降解DNA/RNA雙鏈體中的RNA部分的核糖核酸酶H(RNA酶H)的核苷區(qū)段。同樣，寡核苷酸可包含募集雙鏈RNA酶(例如RNA酶III)的區(qū)段，或包含募集降解靶mRNA的內(nèi)源酶(RNA酶P)的外部指導(dǎo)序列(EGS)。同樣，寡核苷酸可包含顯示RNA酶催化活性的序列基序，或者可在寡核苷酸上連接一些部分，當(dāng)通過(guò)雜交事件使其與靶接近時(shí)，它能夠使該靶不具有代謝活性。
這就是說(shuō)，gapmer的缺口大小，即該亞片段被定義為具有4至14個(gè)核苷堿基的長(zhǎng)度，但相信在8至13個(gè)核苷酸堿基范圍內(nèi)的長(zhǎng)度，例如10至12個(gè)核苷酸堿基，特別是11個(gè)核苷酸堿基可產(chǎn)生特別有用的gapmer，參見(jiàn)表1。
藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)反義寡核苷酸的臨床效力取決于它們的藥物動(dòng)力學(xué)，例如吸收、分布、細(xì)胞攝入、代謝和排泄。反之，這些參數(shù)由寡核苷酸的基本化學(xué)性質(zhì)及其大小和三維結(jié)構(gòu)所充分控制。
如前所述，本發(fā)明的LNA不是具有單一的，而是多個(gè)相關(guān)的化學(xué)性質(zhì)，其雖然在分子上不同，但對(duì)互補(bǔ)DNA和RNA均顯示極好的親和性。因此，LNA家族的化學(xué)性質(zhì)特別適合研發(fā)具有定制的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的本發(fā)明寡聚物，其可利用LNA的高親和性來(lái)調(diào)節(jié)活性化合物的大小，或利用不同的LNA化學(xué)性質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)活性化合物的精確分子組成。在后一種情況下，例如，相比于氧基-LNA，氨基-LNA的使用將改變寡聚化合物的整體電荷并影響攝入和分布行為。同樣，使用硫代-LNA代替氧基-LNA將增加寡核苷酸的親脂性，并因此影響其通過(guò)親脂性屏障(例如細(xì)胞膜)的能力。
另外，調(diào)節(jié)本發(fā)明LNA寡核苷酸的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可通過(guò)與多種不同部分的連接來(lái)達(dá)到。例如，可以通過(guò)將諸如脂類部分連接到寡核苷酸上來(lái)增強(qiáng)寡核苷酸通過(guò)細(xì)胞膜的能力，所述脂類部分是例如膽固醇部分、硫醚、脂族鏈、磷脂或多胺。同樣，可通過(guò)將與膜內(nèi)的分子相互作用、介導(dǎo)向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)的部分和寡核苷酸綴合來(lái)增加LNA寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的攝入。
藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)根據(jù)本發(fā)明，藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可用增加寡聚物攝入、提高生物穩(wěn)定性，例如提高寡聚物對(duì)降解的抗性，和/或增加寡核苷酸與靶序列例如mRNA序列的雜交性質(zhì)中的特異性和親和性的基團(tuán)進(jìn)行改善。
毒性與反義寡聚物相關(guān)的毒性主要有兩類序列依賴性毒性，包括靶結(jié)合區(qū)，以及非序列依賴性、種類相關(guān)性(class-related)毒性。除了與通過(guò)天然CpG序列基序的免疫刺激相關(guān)的情況外，在反義寡核苷酸的研發(fā)中最為突出的毒性與序列無(wú)關(guān)，例如和寡核苷酸的化學(xué)性質(zhì)和劑量、施用方式、頻率和持續(xù)時(shí)間相關(guān)。特別是，硫代磷酸酯類的寡核苷酸已充分表征，并發(fā)現(xiàn)可引起許多副作用，例如補(bǔ)體激活、延長(zhǎng)PTT(部分凝血激酶時(shí)間(partial thromboplastin time))、血小板減少、肝毒性(肝酶的增加)、脾腫大和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生。
如前所述，LNA家族的化學(xué)性質(zhì)提供了空前的親和性、極高的生物穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)寡核苷酸的精確分子組成的能力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，含有LNA的化合物使得能夠開(kāi)發(fā)出結(jié)合了高效力與少量(如果有的話)硫代磷酸酯鍵、并因此很可能相比于同代的反義化合物而言表現(xiàn)出更好的功效和安全性的寡核苷酸。
藥物組合物根據(jù)上文，應(yīng)該理解的是本發(fā)明也涉及包含寡聚化合物或本文定義的綴合物及藥物可接受載體的藥物組合物。
藥物組合物制備的指導(dǎo)可見(jiàn)于Alfonso R.Gennaro的“RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy”和下文中。
藥物可接受載體，例如粘合劑和佐劑，是藥物組合物的一部分。膠囊劑、片劑和丸劑等可例如含有下列化合物微晶纖維素、作為粘合劑的樹(shù)膠或明膠、作為賦形劑的淀粉或乳糖、作為潤(rùn)滑劑的硬脂酸鹽(酯)、各種甜味劑或增香劑。對(duì)于膠囊劑，單位劑型可含有液體載體，例如脂肪油。同樣，糖包衣或腸劑(enteric agent)可以是該單位劑型的一部分。該藥物組合物也可以是活性藥物成分(包括寡聚化合物)的乳劑和形成微膠粒乳劑的脂類。
本發(fā)明的寡聚化合物可以和不損害期望活性的任何物質(zhì)混合，或和補(bǔ)充期望活性的物質(zhì)混合。這些物質(zhì)可包含其他藥物，包括其他核苷化合物。
對(duì)于靜脈內(nèi)、皮下或局部施用，該制劑可包括無(wú)菌稀釋劑、緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑和抗菌劑?；钚曰衔锟梢院洼d體一起制備，該載體可以起到保護(hù)作用，防止降解或從機(jī)體直接排出，所述載體包括具有受控釋放性質(zhì)的植入物或微膠囊。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，優(yōu)選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水。
優(yōu)選地，寡聚化合物以足以向患者投遞治療有效量而在該被治療患者中不產(chǎn)生嚴(yán)重副作用的量包括在單位制劑中，例如在藥物可接受載體或稀釋劑中。
該藥物組合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，寡聚化合物被配制在水性載體中，特別是在含有保持pH在4.0-8.5的范圍內(nèi)，并具有20-2000mM離子強(qiáng)度的緩沖液的水性載體中。
術(shù)語(yǔ)“水性載體”是指所討論的藥物組合物是液體形式，并且該液體載體主要由水組成，即至少80％(w/w)、或至少90％(w/w)、或甚至至少95％(w/w)的載體由水組成。也可以使用其他液體成分，例如乙醇、DMSO、乙二醇等。
該水性載體優(yōu)選包含保持pH在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖液。優(yōu)選地，該緩沖液將保持pH在5.0-8.0的范圍內(nèi)，例如在6.0-7.5的范圍內(nèi)。
藥物組合物的離子強(qiáng)度/張力也是重要的。因此，液體藥物組合物一般具有20-2000mM范圍內(nèi)的離子強(qiáng)度，例如在50-1500mM的范圍內(nèi)，或者在100-1000mM的范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該液體藥物組合物包含本文定義的在水性載體中的寡聚化合物；并且所述水性載體包含保持pH在4.0-8.5的范圍內(nèi)，并具有20-2000mM離子強(qiáng)度的緩沖液。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該液體藥物組合物包含在水性載體中的綴合物；所述綴合物由本文定義的寡聚化合物和至少一種共價(jià)連接到所述寡聚化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，并且所述水性載體包含保持pH在4.0-8.5范圍內(nèi)、并具有20-2000mM離子強(qiáng)度的緩沖液。
在這兩個(gè)實(shí)施方案中，寡聚化合物的靶結(jié)合區(qū)優(yōu)選選自SEQ IDNO1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52，更具體地，該靶結(jié)合區(qū)是SEQ ID NO8(和35)，或者該寡聚化合物的靶結(jié)合區(qū)優(yōu)選選自SEQ IDNO15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55，更具體地，該靶結(jié)合區(qū)是SEQ ID NO15(和29)。
如上所述，如果該化合物選自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52，特別是SEQ ID NO8(和35)，或者如果該化合物選自SEQ ID NO15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55，特別是SEQ ID NO15(和29)是特別優(yōu)選的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物也包含其他藥劑，其選自化療化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制化合物、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡(pro-apoptotic)化合物、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑和激酶抑制劑。
在特別令人感興趣的變通方案中，該其他藥劑是至少一種化療化合物。這類化療化合物的合適實(shí)例是選自下列的化合物腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，例如強(qiáng)的松、地塞米松(dexamethasone)或地塞米松(decadron)、六甲蜜胺(克瘤靈、hexamethylmelamine(HMM))、氨磷汀(氨磷汀針?lè)蹌?、氨魯米特(氨魯米特片劑)、安吖啶(M-AMSA)、阿那曲唑(瑞寧得)、雄激素，例如睪酮、天冬酰胺酶(愛(ài)施巴)、卡介苗、比卡魯氨(康士德)、博來(lái)霉素(硫酸博來(lái)霉素)、白消安(馬利蘭)、碳鉑(伯爾定)、卡莫斯汀(BCNU、BiCNU)、苯丁酸氮芥(留可然)、氯脫氧腺嘌呤(2-CDA、克拉屈濱、leustatin)、順鉑(platinol)、阿糖胞苷(cytarabine)、達(dá)卡包嗪(DTIC)、放線霉素D(actinomycin-D、cosmegen)、柔紅霉素(鹽酸柔紅霉素)、多西他賽(泰索帝)、阿霉素(adriomycin)、表柔比星、雌莫司汀(emcyt)、雌激素，例如己烯雌酸(DES)、etopside(VP-16、依托泊甙、凡畢復(fù))、氟達(dá)拉濱(fludara)、氟他胺(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他濱(健擇)、戈舍瑞林(zodalex)、曲妥單抗(司徒曼布)、羥基脲(hydrea)、依達(dá)比星(鹽酸依達(dá)比星)、異環(huán)磷酰胺、IL-2(重組白細(xì)胞介素-2、阿地白介素)、干擾素α(intron A、roferon A)、依立替康(camptosar)、醋酸亮丙瑞林(亮丙瑞林)、左旋咪唑(ergamisole)、洛莫司汀(CCNU)、鹽酸氮芥(mustargen、氮芥)、美法侖(愛(ài)克蘭)、巰嘌呤(purinethol、6-MP)、氨甲蝶呤(mexate)、絲裂霉素-C(mutamucin)、米托蒽醌(novantrone)、奧曲肽(善寧)、脫氧助間型霉素(2-噴斯他丁、nipent)、普卡霉素(光輝霉素、mithracin)、prorocarbazine(鹽酸甲基芐肼)、鏈脲霉素、他莫昔芬(諾瓦得士)、泰素(紫杉醇)、替尼泊苷(衛(wèi)萌、VM-26)、噻替哌、托泊替康(鹽酸拓?fù)涮婵?、維A酸(vesanoid、全反式維A酸)、長(zhǎng)春堿(valban)、長(zhǎng)春新堿(硫酸長(zhǎng)春新堿)和長(zhǎng)春瑞濱(諾維本)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該化療化合物選自氟達(dá)拉濱和例如泰素(taxol)、紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽的紫杉烷類，特別是氟達(dá)拉濱。
在一個(gè)變通方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含(a)一種或多種寡聚化合物及(b)一種或多種通過(guò)非反義機(jī)理起作用的其他化療化合物。當(dāng)與本發(fā)明的這些化合物一起使用時(shí)，這類化療化合物可以單獨(dú)使用(例如光輝霉素和寡核苷酸)、連續(xù)使用(例如，使用光輝霉素和寡核苷酸一段時(shí)間再使用另一種藥劑和寡核苷酸)，或和一種或多種其他這類化療化合物組合，或和放療組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有化療化合物包括那些上面清楚描述的那些化合物，都被引入本文，和本發(fā)明的化合物一起作為聯(lián)合治療。
在一個(gè)變通方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含(a)一種或多種寡聚化合物及(b)一種或多種抗體化合物。也可在該組合中加入一種和多種化療化合物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該藥物組合物和選自氟達(dá)拉濱和紫杉烷的化合物組合施用。
術(shù)語(yǔ)“紫杉烷化合物”是指包括紫杉醇(Taxol)、紫杉醇衍生物、多西他賽、泰索帝、改性的紫杉烷和紫杉烷類似物。紫杉醇(Taxol)是分離自西方(pacific)紫杉即短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)的樹(shù)皮的二萜，并代表b具有紫杉烷環(huán)系的一類治療劑。紫杉烷及其類似物已通過(guò)從10-去乙酰基漿果赤霉素III(獲自紅豆杉針葉和小枝的前體)通過(guò)部分合成及全合成得到制備。見(jiàn)Holton.，等人，J.Am.Chem.Soc.1161597-1601(1994)和Nicolaou等人，Nature 367630(1994)。已顯示紫杉醇在幾種人類腫瘤的臨床治療中具有療效。見(jiàn)McGuire等人，Ann.Int.Med.11237-279(1989)；Holmes等人，J.Natl.Cancer Inst.831797-1805(1991)；Kohn等人J.Natl.Cancer Inst.8618-24(1994)；和Kohn等人，American Societyfor Clinical Oncology 12(1993)。改性的紫杉烷和紫杉烷類似物是那些具有帶改性側(cè)鏈的紫杉烷環(huán)的化合物。許多這些類似物具有改進(jìn)的性質(zhì)，例如比天然產(chǎn)生的紫杉醇更高的水溶性和穩(wěn)定性。這些類似物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并公開(kāi)于例如美國(guó)專利第5,278,324號(hào)、5,272,171號(hào)、5,254,580、5,250,683號(hào)、5,248,796號(hào)和5,227,400號(hào)中，它們的公開(kāi)內(nèi)容在此全部引用作為參考。紫杉醇和taxotene可以通過(guò)WO93/18210、EP0 253 739、EP 0 253 739和WO92/09589中的方法制備，它們的公開(kāi)內(nèi)容在此全部引用作為參考。在具體的實(shí)施方案中，紫杉烷化合物是紫杉醇或多西紫杉醇。
一般而言，該組合物中化療化合物(例如，氟達(dá)拉濱和/或紫杉烷化合物)和寡聚化合物的重量比在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)，例如在25∶1至1∶25的范圍內(nèi)，或在10∶1至1∶25的范圍內(nèi)，或在1∶1至1∶25的范圍內(nèi)，或在50∶1至1∶10的范圍內(nèi)，或在1∶1到1∶50的范圍內(nèi)，或在25∶1至1∶10的范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物在藥學(xué)可接受的載體中包含至少一種化療化合物(例如，氟達(dá)拉濱和/或紫杉烷化合物)和本文定義的寡聚化合物，其中在所述組合物中該化療化合物和該寡聚化合物的重量比在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物在藥學(xué)可接受的載體中包含至少一種化療化合物(例如，氟達(dá)拉濱和/或紫杉烷化合物)和綴合物，所述綴合物由本文定義的寡聚化合物和至少一種共價(jià)連接到所述寡聚化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成；并且其中在所述組合物中所述化療化合物和該綴合物的寡聚化合物部分的重量比在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。在該實(shí)施方案的變通方案中，所述至少一種非核苷酸/非多核苷酸部分包含化療化合物(例如，氟達(dá)拉濱或紫杉烷化合物)。
在這兩個(gè)實(shí)施方案中，該寡聚化合物的靶結(jié)合區(qū)優(yōu)選是選自SEQID NO1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52中的一種，特別地，該靶結(jié)合區(qū)是SEQ ID NO8(和35)?；蛘咴摴丫刍衔锏陌薪Y(jié)合區(qū)優(yōu)選是選自SEQ ID NO15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55中的一種，特別地，該靶結(jié)合區(qū)是SEQID NO15(和29)。
如上所述，如果該化合物選自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8(和35)、12、13、14、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52，特別是SEQ ID NO8(和35)，或者如果該化合物選自SEQ ID NO15(和29)、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、53、54和55，特別是SEQ ID NO15(和29)是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的寡聚化合物也可與活性藥物物質(zhì)綴合，例如阿司匹林、布洛芬、磺胺藥、抗糖尿病藥物、抗菌藥物或抗生素。
抗炎藥物，包括、但不限于非甾族抗炎藥物和皮質(zhì)類固醇、抗病毒化合物及免疫調(diào)節(jié)藥物，也包括在本發(fā)明的組合物中。兩種或多種組合的化合物可以一起使用或依次使用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以包含一種或多種靶向Bcl-2的寡聚化合物和一種或多種靶向第二核酸靶的其他反義化合物。兩種或多種組合的化合物可以一起使用或依次使用。
另外，包含寡聚化合物的藥物可以和放療等組合使用。
優(yōu)選的藥物組合物在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是在水性載體中包含10-30個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度的寡聚化合物的液體藥物組合物，所述寡聚化合物包含與人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基之間的區(qū)域可特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，所述靶結(jié)合區(qū)具有下式5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA類似物核苷酸；并且所述靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸；并且所述水性載體包含保持pH在4.0-8.5的范圍內(nèi)，并具有20-2000mM離子強(qiáng)度的緩沖液。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是在水性載體中包含綴合物的液體藥物組合物，所述綴合物由10-30個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度的寡聚化合物和至少一種共價(jià)連接到所述化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述寡聚化合物包含與人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基之間的區(qū)域可特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，所述靶結(jié)合區(qū)具有下式5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′
其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA類似物核苷酸；并且所述靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸；并且所述水性載體包含保持pH在4.0-8.5的范圍內(nèi)，并具有20-2000mM離子強(qiáng)度的緩沖液。
這種組合物優(yōu)選進(jìn)一步包含至少一種化療化合物(例如，氟達(dá)拉濱和/或紫杉烷化合物)。如上所述，在所述組合物中該化療化合物和該綴合物的LNA寡核苷酸部分的重量比在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是在水性載體中包含至少一種化療化合物(例如，氟達(dá)拉濱和/或紫杉烷化合物)和10-30個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度的寡聚化合物的藥物組合物，所述寡聚化合物包含與人Bcl-2 mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基之間的區(qū)域可特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，所述靶結(jié)合區(qū)具有下式5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA類似物核苷酸；并且所述靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸；并且在所述組合物中該化療化合物和該LNA寡核苷酸部分的重量比在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是在藥物可接受載體中包含至少一種化療化合物(例如，氟達(dá)拉濱和/或紫杉烷化合物)和綴合物的藥物組合物，所述綴合物由10-30個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度的寡聚化合物和至少一種共價(jià)連接到所述化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成，所述寡聚化合物包含與人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基之間的區(qū)域可特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，所述靶結(jié)合區(qū)具有下式5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA類似物核苷酸；并且所述靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸；并且在所述組合物中該化療化合物和該綴合物中的LNA寡核苷酸部分的重量比在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
指征Bcl-2參與許多基礎(chǔ)生物機(jī)制，包括紅細(xì)胞增殖、細(xì)胞增殖、離子代謝、葡萄糖和能量代謝、pH調(diào)節(jié)和基質(zhì)代謝。本發(fā)明的方法優(yōu)選用于癌癥導(dǎo)致的疾病的治療、維持治療或預(yù)防，特別是用于治療和Bcl-2的表達(dá)相關(guān)的癌癥，例如乳癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌、腎癌、腦癌、睪丸癌、胃癌、小腸癌、腸癌、脊髓癌、竇癌(sinuses cancer)、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、頭頸癌、血癌、皮膚癌、胃癌或骨癌。
本發(fā)明包括預(yù)防、維持治療或治療癌癥的方法，其包括對(duì)人給予治療有效量的Bcl-2調(diào)節(jié)寡聚化合物。本發(fā)明進(jìn)一步包括短期施用Bcl-2調(diào)節(jié)寡聚化合物的用途。通常，非癌性細(xì)胞以該具體細(xì)胞類型特征性的頻率分裂。當(dāng)細(xì)胞已轉(zhuǎn)化進(jìn)入癌性階段，將產(chǎn)生不受控制的細(xì)胞增殖和降低的細(xì)胞死亡。因此，雜亂的細(xì)胞分裂或細(xì)胞生長(zhǎng)是癌性細(xì)胞類型的特點(diǎn)。這些癌癥類型的實(shí)例包括、但不限于淋巴瘤和白血病(例如，非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)、急性白血病，例如急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤)、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨膜癌、子宮頸癌、睪丸癌、肺癌、膀胱癌、黑素瘤、頭頸癌、腦癌、未知源發(fā)位置癌(cancersof unknown primary site)、瘤、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、不同類型的腫瘤(例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌(papillary denocarcinomas)、囊腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯瘤(Wilms′tumour)、小細(xì)胞肺癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)鞘瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)、重鏈病、轉(zhuǎn)移或以不受控制的或異常細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的任何疾病或病癥。
本發(fā)明的非何杰金淋巴瘤包括，但不限于前體細(xì)胞淋巴瘤，例如原始淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(T細(xì)胞和B細(xì)胞)；外周B細(xì)胞瘤(Peripheral B-cell neoplasma)，例如B-慢性淋巴細(xì)胞性白血病和小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、B-幼淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(prolymphocyticleukaemia)、淋巴漿細(xì)胞樣淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤(Mantel Celllymphoma)、濾泡型淋巴瘤、MALT型淋巴結(jié)外邊緣帶B細(xì)胞淋巴瘤、淋巴結(jié)邊緣帶B細(xì)胞淋巴瘤、脾邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤、多毛細(xì)胞白血病、彌漫型大B細(xì)胞淋巴瘤、包括Burkitt樣淋巴瘤的Burkitt淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤和漿細(xì)胞骨髓瘤；外周T細(xì)胞和NK細(xì)胞腫瘤，例如T-幼淋巴細(xì)胞性白血病、T細(xì)胞顆粒淋巴細(xì)胞白血病、侵襲性NK細(xì)胞白血病、蕈樣肉芽腫病和塞澤里綜合征、外周T細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤、NK/T細(xì)胞淋巴結(jié)外淋巴瘤(鼻和鼻型)、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤、肝脾γδT細(xì)胞淋巴瘤、皮下脂膜炎樣T細(xì)胞淋巴瘤、退行性大細(xì)胞淋巴瘤(T細(xì)胞/裸細(xì)胞和原發(fā)性系統(tǒng)性類型)、退行性大細(xì)胞淋巴瘤(T細(xì)胞/裸細(xì)胞、原發(fā)性皮膚性類型)和成人T細(xì)胞淋巴瘤和白血病(HTLV1+)。
目前已相信可以得到特別好的臨床結(jié)果的癌癥類型是急性粒細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和非何杰金淋巴瘤，尤其是濾泡型淋巴瘤和彌散型大B細(xì)胞淋巴瘤。
術(shù)語(yǔ)“癌(carcinoma)”是指上皮來(lái)源的惡性腫瘤。上皮組織覆蓋或沿著機(jī)體內(nèi)外的機(jī)體表面。上皮組織的實(shí)例是皮膚及沿著體腔和內(nèi)部器官，例如腸、膀胱、子宮等的粘膜和漿膜。上皮組織也可以延伸入更深的組織層以形成腺體，例如粘液分泌腺。
術(shù)語(yǔ)“肉瘤(sarcoma)”是指由結(jié)締組織，例如軟骨、脂肪、肌肉、腱和骨，發(fā)展成的惡性腫瘤。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)”是指涵蓋起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤。
用途本發(fā)明的寡聚化合物可用于治療、維持治療和預(yù)防之中。在研究中，該反義寡聚化合物可用于特異性抑制細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物中Bcl-2蛋白的合成，由此方便靶的功能性分析或評(píng)價(jià)其作為治療干預(yù)目標(biāo)的有效性。對(duì)于治療，疑似患有可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)進(jìn)行治療的疾病或病癥的動(dòng)物或人(特別是人)可通過(guò)給予本發(fā)明的反義化合物來(lái)治療。進(jìn)一步提供了治療動(dòng)物，特別是小鼠和大鼠，和治療人的方法，所述動(dòng)物和人疑似患有與Bcl-2表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥或者對(duì)其易感，所述方法包括施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的反義化合物或組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在細(xì)胞或組織內(nèi)調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)的方法，該方法包括用本文定義的寡聚化合物或綴合物，特別是本文定義的藥物組合物接觸該細(xì)胞或組織，以便調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)癌癥疾病中涉及的基因的表達(dá)的方法，其包括將本文定義的寡聚化合物或綴合物，特別是本文定義的藥物組合物與該基因或來(lái)自該基因的RNA相接觸，以便調(diào)節(jié)基因表達(dá)。該基因優(yōu)選是人Bcl-2基因。
本發(fā)明的另一方面涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，其包括將本文定義的寡聚化合物或綴合物、特別是本文定義的藥物組合物與該細(xì)胞或來(lái)自該細(xì)胞的RNA相接觸，以便誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該凋亡的誘導(dǎo)可以在體外或體內(nèi)。該誘導(dǎo)可以在細(xì)胞測(cè)定中或組織樣品內(nèi)或活的哺乳動(dòng)物內(nèi)引發(fā)。
本發(fā)明的另一方面涉及防止或減少細(xì)胞增殖的方法，其包括將本文定義的寡聚化合物或綴合物、特別是本文定義的藥物組合物與該細(xì)胞或來(lái)自該細(xì)胞的RNA相接觸，以便防止或減少細(xì)胞增殖。該細(xì)胞增殖的防止或減少可以是體外或體內(nèi)的。該防止可以在細(xì)胞測(cè)定中或組織樣品內(nèi)或活的哺乳動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行。
另一方面，本發(fā)明提供了治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用治療有效量的本文定義的寡聚化合物或綴合物，特別是本文定義的藥物組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療與其他制劑的給藥聯(lián)合應(yīng)用，所述制劑選自化療化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡化合物、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑、抗體和激酶抑制劑。在一個(gè)特別的變通方案中，所述其他制劑是至少一種化療制劑，尤其是一種或多種上述的特定化療劑。
本發(fā)明也提供治療患有或易患血管發(fā)生導(dǎo)致的疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給予治療有效量的本文定義的寡聚化合物或綴合物，特別是本文定義的藥物組合物。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供本文定義的寡聚化合物用作藥物。更特別的，本發(fā)明提供本文定義的寡聚化合物在制備用于治療癌癥疾病的藥物上的用途。該藥物優(yōu)選處于上述定義的藥物組合物的形式。
因此，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面涉及本文定義的寡聚化合物在制備用于治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物、特別是人的藥物組合物上的用途。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物、特別是人的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給予一種或多種治療有效劑量的含本文定義的寡聚化合物的第一藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療患有或易患癌癥疾病的哺乳動(dòng)物、特別是人的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給予一種或多種治療有效劑量的含綴合物的第一藥物組合物，所述綴合物由本文定義的寡聚化合物和至少一種共價(jià)連接到該寡聚化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分組成。
上面后兩個(gè)方面的變通方案是其中一種或多種化療化合物(例如，氟達(dá)拉濱和/或紫杉烷化合物)和LNA寡核苷酸聯(lián)合施用，特別是其中化療化合物存在于含LNA寡核苷酸的第一藥物組合物中的情形。
上面后兩個(gè)方面的另一個(gè)變通方案是其中一種或多種化療化合物(例如氟達(dá)拉濱和/或紫杉烷化合物)存在于不含LNA寡核苷酸的第二藥物組合物中。在這種情況下，第一藥物組合物和第二藥物組合物可以同時(shí)施用或依次施用。
更普遍的，該藥物可以進(jìn)一步包含其他藥劑，所述其它藥劑選自化療化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡化合物、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑和激酶抑制劑。在一個(gè)特別的變通方案中，該其他制劑是至少一種化療化合物，尤其是一種或多種上述的特定化療化合物。
上面所指的癌癥疾病特別是上面詳細(xì)描述的肺癌、乳癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌、腎癌、腦癌、睪丸癌、胃癌、小腸癌、腸癌、脊髓癌、竇癌、膀胱癌、尿道癌、卵巢癌、頭頸癌、血癌或皮膚癌。
另外。本發(fā)明提供包含與編碼人Bcl-2蛋白的核糖核酸雜交的化合物的復(fù)合物，所述化合物是本文定義的寡聚化合物或綴合物。這類復(fù)合物可以是用本文定義的寡聚化合物或綴合物。對(duì)靶即編碼人Bcl-2蛋白的核糖核酸進(jìn)行治療的結(jié)果。
施用本發(fā)明的藥物組合物可用多種方式施用，這取決于期望的是局部還是系統(tǒng)性治療及待治療的面積。施用可以是(a)口服(b)經(jīng)肺，例如通過(guò)吹入或吸入粉末或氣溶膠，包括通過(guò)噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)；(c)局部，包括經(jīng)表皮、透皮、眼和包括陰道和直腸的粘膜遞送；或(d)腸胃外的，包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚化合物通過(guò)靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)、經(jīng)口、局部地或以大藥丸式注射或施用直接到達(dá)靶器官。
局部施用的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏、洗劑、乳劑、凝膠、滴劑、噴霧劑、栓劑、液體劑和粉末劑。常規(guī)藥物載體、水性、粉末或油基、增稠劑等是必需的或期望的。包被的避孕套、手套等也是有用的。優(yōu)選的局部制劑包括其中本發(fā)明的寡核苷酸和局部遞送劑相混合的那些，所述局部遞送劑例如為脂類、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑?？诜慕M合物和制劑包括、但不限于粉末或顆粒、微顆粒、納米粒、在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊(gel capsules)、小袋(sachets)、片劑或小片劑。腸胃外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和制劑可包括無(wú)菌水溶液，其也可以包含緩沖劑、稀釋劑和其他合適的添加劑，例如但不限于滲透增強(qiáng)劑、載體化合物和其他藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
遞送本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑和含脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可由許多組分形成，這些組分包括但不限于預(yù)制液(preformed liquid)、自乳化固體和自乳化半固體。藥物向腫瘤組織的遞送可以通過(guò)載體介導(dǎo)的遞送增強(qiáng)，其包括但不限于陽(yáng)離子脂質(zhì)體、環(huán)糊精、卟啉衍生物、支鏈樹(shù)形分子(dendrimer)、聚乙烯亞胺聚合體、納米顆粒和微球體(Dass CR.J Pharm Pharmacol 2002；54(1)3-27)。
可方便地以單位劑型形式存在的本發(fā)明藥物制劑可根據(jù)制藥業(yè)中眾所周知的常規(guī)技術(shù)制備。這類技術(shù)包括使活性組分與一種或多種藥物載體或賦形劑相混合的步驟。一般而言，該制劑通過(guò)均勻和緊密地將把活性組分與液體載體或分得很小的固相載體或二者相結(jié)合，然后，如果需要的話將產(chǎn)品成形來(lái)制備。
本發(fā)明的組合物可配制成多種可能的劑型形式中的任一種，例如但不限于片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿劑、軟凝膠劑和栓劑。本發(fā)明的組合物也可配制成水性、非水性或混合介質(zhì)中的懸浮液。水性懸浮液可進(jìn)一步包含增加懸浮劑粘性的物質(zhì)，包括例如羥甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。該懸浮液也可以含有穩(wěn)定劑。
劑量給藥量取決于待治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和反應(yīng)性以及治療過(guò)程，可持續(xù)幾天至幾個(gè)月，或直至達(dá)到治療的效果或達(dá)到疾病狀態(tài)的減輕。最佳劑型方案將取決于例如組合治療的選擇、疾病和疾病狀態(tài)及起始臨床治療的結(jié)果。
最佳劑量可根據(jù)各個(gè)寡聚化合物的相關(guān)對(duì)效力而不同。一般而言，它可根據(jù)在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型上發(fā)現(xiàn)有效的EC50來(lái)估計(jì)。一般地，劑量在每公斤體重0.01μg至1g的范圍內(nèi)，并且可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次，或甚至每2至10年給予一次，或連續(xù)輸注幾小時(shí)長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月。給藥的重復(fù)頻率可根據(jù)所測(cè)定的藥物在體液或組織中的停留時(shí)間和濃度估計(jì)。成功治療后，可能希望患者接受維持治療以預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)。
并不局限于任何具體的理論，預(yù)計(jì)化療化合物和本發(fā)明的寡聚化合物的聯(lián)合效果(及潛在的協(xié)同效果)將使得有可能降低化療化合物或寡聚化合物或此兩者的劑量。
試劑盒本發(fā)明的另一方面涉及試劑盒，其包含(a)含有一種或多種本文定義的寡聚化合物的可注射溶液劑的第一組分，和(b)含有一種或多種化療化合物(例如，氟達(dá)拉濱和/或紫杉烷化合物)的一種或多種可注射溶液的第二組分，和其中在所述組合物中所述至少一種紫杉烷化合物和至少一種LNA寡核苷酸的重量比在50∶1至1∶25的范圍內(nèi)。
優(yōu)選的，寡聚化合物的可注射溶液劑是上述定義的藥物組合物。
實(shí)施例實(shí)施例1單體合成LNA單體構(gòu)建模塊及其衍生物按照以下公開(kāi)的步驟和其中引用的文獻(xiàn)制備，參見(jiàn)WO 03/095467A1D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)Preparation of LNA Phosphoramidites，Synthesis 6，802-808.
M.D.Srensen，L.Kvaern，T.Bryld，A.E.Hkansson，B.Verbeure，G.Gaubert，P.Herdewijn，J.Wengel(2002)α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid(α-l-LNA)Synthesisand Properties，J.Am.Chem.Soc.，124，2164-2176.
S.K.Slngh，R.Kumar，J.Wengel(1998)Synthesis of Novel Blcyclo[2.2.1]Ribonucleosides2′-Amino-and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides，J.Org.Chem.1998，63，6078-6079.
C.Rosenbohm，S.M.Christensen，M.D.Srensen，D.S.Pedersen，L.E.Larsen，J.Wengel，T.Koch(2003)Synthesis of 2′-amino-LNAa new strategy，Org.Biomol.Chem.1，655-663.
D.S.Pedersen，T.Koch(2003)Analogues of LNA(Locked Nucleic Acid).Synthesis of the 2′-Thio-LNA Thymine and 5-Methyl Cytosine Phosphoramidites，Synthesis，accepted.
實(shí)施例2寡核苷酸的合成寡核苷酸的小量合成在Expedite 8900/MOSS合成儀(Multiple OligonucleotideSynthesis System)上使用亞磷酰胺(phospheramidite)方法，以1μmol或15μmol的量合成寡核苷酸。對(duì)于大量合成，使用KTA OligoPilot。在合成的最后(具有DMT)，在室溫下使用氨水1-2小時(shí)從固相支持物上裂解下寡核苷酸，并進(jìn)一步在65℃下脫保護(hù)4個(gè)小時(shí)。通過(guò)反相HPLC(RP-HPLC)純化該寡核苷酸。除去DMT基團(tuán)后，該寡核苷酸通過(guò)AE-HPLC、RP-HPLC和CGE表征，并且通過(guò)ESI-MS證實(shí)分子量。
更詳細(xì)見(jiàn)下LNA-固相載體的制備LNA琥珀酰半酯(succinyl hemiester)的制備將5’-O-Dmt-3’-羥基-LNA單體(500mg)、琥珀酸酐(1.2當(dāng)量)和DMAP(1.2當(dāng)量)溶解在DCM(35ml)中。該反應(yīng)物在室溫下攪拌過(guò)夜。用0.1M的NaH2PO4，pH 5.5(2x)和鹽水(1x)萃取后，用無(wú)水Na2SO4進(jìn)一步干燥有機(jī)層，過(guò)濾并蒸發(fā)。以95％的收率獲得該半酯衍生物，其無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。
LNA-支持物的制備將以上制備的半酯衍生物(90μmol)溶解在微量DMF中，加入DIEA和pyBOP(90μmol)并混合在一起1分鐘。將該預(yù)激活的混合物與LCAA-CPG(500，80-120目徑，300mg)在手動(dòng)合成器里混合并攪拌。室溫下1.5小時(shí)后，將濾掉支持物并用DMF、DCM和MeOH洗滌。干燥后，上樣被確定為57μmol/g(見(jiàn)Tom Brown，Dorcas J.S.Brown.Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotidesynthesis.InF.Eckstein，編者。Oligonucleotides andAnalogues A Practical Approach.OxfordIRL Press，199113-14)。
寡核苷酸的延伸通過(guò)使用乙腈中0.1M 5’-O-DMT-保護(hù)的amidite和乙腈0.25ml中的DCI(4，5-二氰咪唑)溶液作為激活劑，進(jìn)行亞磷酰胺(A(bz)，G(ibu)，5-甲基-C(bz))或T-β-氰乙基-亞磷酰胺的偶聯(lián)。通過(guò)使用氫化黃原素(xanthane hydride)(在乙腈吡啶10％中的0.01M)進(jìn)行硫醇化反應(yīng)。其余的試劑是一般用于寡核苷酸合成的那些。將供應(yīng)商提供的方案合適地優(yōu)化。
RP-HPLC純化柱Xterra RP18
流速3ml/min緩沖液0.1M醋酸銨，pH 8和乙腈縮寫DMT二甲氧三苯甲基DCI4，5-二氰咪唑DMAP4-二甲氨基吡啶DCM二氯甲烷DMF二甲基甲酰胺THF四氫呋喃DIEAN-二異丙基乙胺PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷并鏻Bz苯甲?；鵌bu異丁?；押塑账岬拇罅亢铣稍邳錕TA OligoPilot上使用亞磷酰胺方法，以200μmole到1mmole的量合成大量寡核苷酸。在寡聚化合物的DMT-OFF-合成后，進(jìn)行DEA-處理，也在合成器上進(jìn)行。在55℃下用氨水處理12個(gè)小時(shí)，從固相支持物上裂解下寡核苷酸并去除保護(hù)基團(tuán)。然后，該寡核苷酸通過(guò)在KTA Pilot上的離子交換(IEX)純化。在SephadexTMG-25介質(zhì)上進(jìn)行脫鹽，然后凍干。該寡核苷酸通過(guò)IEX-HPLC、CGE和ESI-MS表征。
通過(guò)使用乙腈中的0.2M所述亞酰胺酯(amidite)和0.75MDCI(4，5-二氰基咪唑)溶液用作激活劑，進(jìn)行DNA-亞磷酰胺(A(bz)、C(bz)、G(ibu)和(T))和LNA-亞磷酰胺(C(bz)和(T))的偶聯(lián)。通過(guò)使用氫化黃原素(0.0175M，在乙腈吡啶20％中)進(jìn)行硫醇化反應(yīng)。其余的試劑是一般用于寡核苷酸合成的那些。
實(shí)施例3寡聚化合物的設(shè)計(jì)表1-本發(fā)明的寡聚化合物在本申請(qǐng)中，以指定的序列號(hào)、例如“SEQ ID NO15”表示寡聚化合物。化合物“SEQ ID NO56”也被稱為奧利默森鈉，在此處被用作參比化合物。
SEQ ID序列設(shè)計(jì)NO互補(bǔ)的18mers1 TsCstscscscsasgscsgstsgscsgscsCsAst gap 132 TsCsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsAst gap 113 TsCsTsCscscsasgscsgstsgscsGsCsCsAst gap 94 tsCsTsCscscsasgscsgstsgscsgsCsCsAst gap 105 TsCsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsAsT gap 116 TαsCαsTαscscscsasgscsgstsgscsgsCαsCαsAαst gap 117 tsCαsTαsCαscscsasgscsgstsgscsgsCαsCαsAast gap 10互補(bǔ)的16mers8 CsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsagap 119 CαsTαscscscsasgscsgstsgscsgsCαsCαsagap 11，α-L-LNA10CsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsALNA 3′-end11CsTscscscsasgscsgstsgscsgscsCsALNA 3′-end12CsTsCscscsasgscsgstsgscsGsCsCsagap 913CsTsCsCscsasgscsgstsgsCsGsCsCsagap 714CsTsCscscsasgscsgstsgscsGsCsCsAgap 9cstscscscsasMscsgstsgscsgscacsa，16mers15CsTscscscsasascsgstsgscsgsCsCsagap 1116CαsTαscscscsasascsgstsgscsgsCαsCαsagap 11，α-L-LNA17CsTsCscscsasascsgstsgscsGsCsCsagap 918CsTsCscscsastscsgstsgscsGsCsCsagap 919CsTsCsCscsasascsgstsgsCsGsCsCsagap 720CsTscscscsasascsgstsgscsGsCsCsagap 10cstscscscsasgscsgsMsgscsgscscsa，16mers21CsTscscscsasgscsgscsgscsgsCsCsagap 1122CsTsCscscsasgscsgscsgscsGsCsCsagap 923CsTsCsCscsasgscsgscsgsCsGsCsCsagap 724CsTscscscsasgscsgsasgscsgsCsCsagap 1125CsTscscscsasgscsgsgsgscsgsCsCsagap 11tscstscscscsasgsMsgstsgscsgscscsa，t，18mers26TCsTscscscsasgsasgstsgscsgsCsCsAstgap 1127TCsTscscscsasgstsgstsgscsgsCsCsAstgap 1128TCsTscscscsasgsgsgstsgscsgsCsCsAstgap 11標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的29CsTscscscsasascsgstsgscsgsCsCN-1，3′-end30CsTscscscsasascsgstsgscsgsC N-2，3′-end(ref.)31CsTscscscsasascsgstsgscsgsN-3，3′-end(ref.)32TscscscsasascsgstsgscsgsCsCsaN-1，5′-end(ref.)33cscscsasascsgstsgscsgsCsCsa N-2，5′-end(ref.)34cscsasascsgstsgscsgsCsCsa N-3，5′-end(ref.)35CsTscscscsasgscsgstsgscsgsCsCN-1，3′-end36CsTscscscsasgscsgstsgscsgsC N-2，3′-end(ref.)37CsTscscscsasgscsgstsgscsgsN-3，3′-end(ref.)38TscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsaN-1，5′-end(ref.)39cscscsasgscsgstsgscsgsCsCsa N-2，5′-end(ref.)40cscsasgscsgstsgscsgsCsCsa N-3，5′-end(ref.)41CsTscscscsasgscsgstsgscsgscsCsAst gap 1242CsTsCscscsasgscsgstsgscsgsCsCsAst gap 1043CsTsCsCscsasgscsgstsgscsGsCsCsAst gap 844TsCstscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsa gap 1245TsCsTscscscsasgscsgstsgscsGsCsCsa gap 1046TsCsTsCscscsasgscsgstsgsCsGsCsCsa gap 847TsCstscscscsasgscsgstsgscsGsCsc gap 1148TsCsTscscscsasgscsgstsgsCsGsCsc gap 949TsCsTsCscscsasgscsgstsGsCsGsCsc gap 750TsCscscsasgscsgstsgscsgscsCsAst gap 1151TsCsCscsasgscsgstsgscsgsCsCsAst gap 953TCsTscscscsasgscsastsgscsgsCsCsAst gap 1154TCsTscscscsasgscststsgscsgsCsCsAst gap 1155TCsTscscscsasgscscstsgscsgsCsCsAst gap 1156tscstscscscsasgscsgstsgscsgscscsast Reference57TsCsTscscscsasgscsastsgstsgsCsCsAst 2mismatches58AsCscsgscsgstsgscsgsascscsCsTsc Reference；reversedpola rity59tsmcstsmcsmcsmcsasgsmcsgstsgsmcsgsmcsmcsast Reference60CsTscscscsasascmsgstsgscmsgsCsCsagap 1161CsTsmcsmcsmcsasasmcsgstsgsmcsgsCsCsagap 11SEQ ID序列 設(shè)計(jì)引物62catgtgtgtggagagcgtcaa63gccggttcaggtactcagtca64FAM-cctggtggacaacatcgccctgt-TAMRA在表1中，大寫字母表示LAN核苷酸，上標(biāo)“α”表示LAN核苷酸是α-L-LNA核苷酸(例如，LNA類似物核苷酸)，下標(biāo)“S”表示相鄰核苷酸通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)連接。所有LNA-C單體是甲基-C。
實(shí)施例4體外模型細(xì)胞培養(yǎng)反義化合物對(duì)靶核酸表達(dá)的影響可在多種細(xì)胞類型中的任何一種中檢測(cè)，條件是目標(biāo)核酸以可測(cè)量的水平存在。靶可內(nèi)源性表達(dá)，或通過(guò)編碼所述核酸的核酸的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)。
靶核酸的表達(dá)水平可使用例如Northern印跡分析、定量PCR、核糖核酸酶保護(hù)測(cè)試或其他定量方法按常規(guī)確定。為示例目的提供以下細(xì)胞類型，但是其他細(xì)胞類型也可按常規(guī)使用，條件是靶在所選細(xì)胞類型中表達(dá)。
細(xì)胞培養(yǎng)在如以下所述的合適培養(yǎng)基中，并保持在37℃下、95-98％濕度和5％CO2中。細(xì)胞每周按常規(guī)傳代2-3次。
15PC3人前列腺癌細(xì)胞系15PC3由F.Baas博士，NeurozintuigenLaboratory，AMC，The Netherland惠贈(zèng)，并培養(yǎng)在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+慶大霉素。
PC3人前列腺癌細(xì)胞系PC3購(gòu)自ATCC，并培養(yǎng)在含有谷氨酰胺(Gibco)+10％(FBS)+慶大霉素的F12Coon’s中。
518A2人黑素瘤癌細(xì)胞系518A2由B.Jansen博士，Section ofexperimental Oncology，Molecular Pharmacology，Department ofClinical Pharmacology，University of Vienna惠贈(zèng)，并培養(yǎng)在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+慶大霉素中。
實(shí)施例5體外模型反義寡核苷酸的處理使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體制劑Lipofect AMINE 2000(Gibco)作為轉(zhuǎn)染載體，用寡核苷酸處理細(xì)胞。
將細(xì)胞接種于12-孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC)中，在80-90％融合時(shí)處理。所用的寡聚物的濃度在0.2nM到100nM最終濃度的范圍內(nèi)。寡聚物-脂質(zhì)復(fù)合物的配制基本按照Dean等人(Journal of BiologicalChemistry 1994，269，16416-16424)所述實(shí)施，其中在500μl總體積中使用無(wú)血清OptiMEM(Gibco)和最終脂質(zhì)濃度為10μg/ml的LipofectAMINE 2000。
通過(guò)在37℃下孵育4小時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。隨后，去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并在加入含血清的培養(yǎng)基之前洗滌細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)0到72小時(shí)范圍內(nèi)的不同時(shí)間長(zhǎng)度。
實(shí)施例6體外模型RNA和cDNA合成的提取分離總RNA使用RNeasy小試劑盒(Qiagen cat.No.74104)或Trizol試劑(Life technologies cat.No.15596)分離總RNA。RNeasy是從細(xì)胞系中分離RNA的優(yōu)選方法，Trizol是從組織樣品中分離RNA的優(yōu)選方法。
按照制造商提供的方案，使用Qiagen RNA OPF-BIO Robot 3000從細(xì)胞系中分離總RNA。
使用制造商提供的Trizol試劑方案勻漿組織樣品并分離總RNA。
第一條鏈的合成按照制造商的指導(dǎo)，使用OmniScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(cat#205133，Qiagen)進(jìn)行第一條鏈的合成。
對(duì)每個(gè)樣品，分別用不含RNase的水將0.5μg總RNA調(diào)整到12μl，并與2μl聚(dT)12-18(2.5μg/ml)(Life Technologies，GibcoBRL，Roskilde，DK)、2μl dNTP混合物(每種dNTP 5mM)、2μl 10X緩沖液RT、lμl RNAguardTMRNase抑制劑(33.3U/ml)、(cat#27-0816-01，Amersham Pharmacia Biotech，Hφrsholm，DK)和1μl OmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶(4U/μl)混合，隨后在37℃下孵育60分鐘并在93℃下熱滅活5分鐘。
實(shí)施例7體外模型通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析Bcl-2表達(dá)的寡核苷酸抑制可用本領(lǐng)域已知的多種方法測(cè)定Bcl-2表達(dá)的反義調(diào)節(jié)。例如，Bcl-2 mRNA的水平可通過(guò)如Northern印跡分析或定量PCR來(lái)定量。目前，定量實(shí)時(shí)PCR是優(yōu)選的。RNA分析可在總細(xì)胞RNA或mRNA上進(jìn)行。
RNA分離和分析方法，如Northern印跡分析，在本領(lǐng)域是常規(guī)的，并在如John Wiley和Sons所著Current Protocols in MolecularBiology中有教導(dǎo)。
使用可從BioRAD Laboratories商購(gòu)的市售iQ多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)可方便地實(shí)現(xiàn)定量實(shí)時(shí)PCR。
Bcl-2mRNA水平的實(shí)時(shí)定量PCR分析按照制造商的指導(dǎo)，使用iQ多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(BioRAD)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR確定mRNA水平的量。
實(shí)時(shí)定量PCR是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，并在如Heid等人Real timequantitative PCR，Genome Research(1996)，6986-994中有教導(dǎo)。
Platinum Quantitative PCR SuperMix UGD 2x PCR master mix獲自Invitrogen cat#11730。引物和TaqMan探針獲自MWG-BiotechAG，Ebersberg，德國(guó)。
使用公開(kāi)的序列信息(GenBank登陸號(hào)NM 001168，以SEQ IDNO1001形入并入本文)，設(shè)計(jì)與人Bcl-2序列雜交的人Bcl-2探針和引物。
對(duì)于人Bcl-2，PCR引物是正向引物5’catgtgtgtggagagcgtcaa 3’(測(cè)試中的最終濃度；0.6μM)(SEQ ID NO62)反向引物5’gccggttcaggtactcagtca 3’(測(cè)試中的最終濃度；0.6μM)(SEQ ID NO63)，PCR探針是5’FAM-cctggtggacaacatcgccctgt-TAMRA 3’(測(cè)試中的最終濃度；0.1μM)(SEQ ID NO64)3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)mRNA的量被用作內(nèi)源對(duì)照從而對(duì)樣品制備中的任何變化進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
按照制造商的指導(dǎo)，使用人GAPDH ABI Prism Pre-DevelopedTagMan Assay試劑(Applied Biosystems cat.No.4310884E)對(duì)人GAPDH mRNA中的樣品含量進(jìn)行定量。
實(shí)時(shí)PCR將來(lái)自如上述進(jìn)行的第一條鏈合成的eDNA稀釋2-20倍，并由實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行分析。將引物和探針與2x Platinum Quantitative PCRSuperMix UDG(cat.#11730，Invitrogen)混合，并加入到3.3μl的cDNA中達(dá)到最終體積25μl。每個(gè)樣品一式三份分析。從表達(dá)目的RNA的細(xì)胞系中純化的材料制備的cDNA的2倍稀釋物進(jìn)行測(cè)定，得到了該測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用無(wú)菌水代替cDNA用作無(wú)模板對(duì)照。PCR程序50℃2分鐘，95℃10分鐘，隨后95℃15秒、60℃1分鐘循環(huán)40次。
使用iCycler iQ實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)軟件，從計(jì)算的閥值循環(huán)確定目標(biāo)mRNA序列的相對(duì)量(見(jiàn)表3)。
實(shí)施例8體外分析Bcl-2蛋白水平的Western印跡分析可用本領(lǐng)域中公知的多種方法對(duì)Bcl-2蛋白水平定量，例如免疫沉淀法、Western印跡分析(免疫印跡法)、ELISA、RIA(放射免疫測(cè)定)或熒光激活細(xì)胞分揀術(shù)(FACS)和其他?？蓮亩喾N來(lái)源鑒定及獲得針對(duì)Bcl-2的抗體，例如Upstate Biotechnologies(Lake Placid，美國(guó))、Novus Biologicals(Littleton，Colorado)、Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，California)、DAKO(Glostrup，丹麥)或可通過(guò)常規(guī)抗體生產(chǎn)方法制備。Western印跡由Western印跡確定Bcl-2寡聚物對(duì)Bcl-2蛋白水平的體外影響。
按照實(shí)施例5所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，在0至72小時(shí)范圍內(nèi)的時(shí)間點(diǎn)處收獲細(xì)胞，在2.5％SDS、5mM DTT和6M補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物藥片(Roche)的尿素中裂解。使用Bradford試劑測(cè)定總蛋白的濃度。按照制造商的建議(Invitrogen)，將150μg總蛋白在MOPS緩沖液中的12％Bis-Tris凝膠上電泳，并印跡到PVDF膜上。在封閉緩沖液(Introgen)中孵育過(guò)夜后，用單克隆抗Bcl-2抗體(DAKO)及抗Survivin抗體(Novus Biologicals 500-205克隆60.11)或抗微管蛋白抗體(NeoMarkers)將膜孵育2小時(shí)，隨后在二抗中孵育1小時(shí)。使用生色免疫檢測(cè)試劑盒(Invitrogen)顯現(xiàn)Bcl-2、Survivin或微管蛋白。或者，用綴合了HRP的小鼠免疫球蛋白(DAKO)孵育該膜，隨后用ECL+Plus試劑(Amersham)孵育，并用VersaDoc化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)顯示。見(jiàn)圖1、2A、2B和2C。圖6表示Bcl-2蛋白上SEQ ID NO15的活性的持續(xù)時(shí)間。表2表示化合物濃度為10nM和10nM的凝膠的化學(xué)發(fā)光值(凝膠未示出)。圖2A表示來(lái)自相似實(shí)驗(yàn)但不同劑量(1nM和5nM)的凝膠。
表2

實(shí)施例9體外分析使用反義寡核苷酸對(duì)人Bcl-2表達(dá)的反義抑制根據(jù)本發(fā)明，設(shè)計(jì)了一系列與人Bcl-2mRNA的特定區(qū)域、即翻譯起始密碼子周圍的區(qū)域可雜交的寡核苷酸。寡核苷酸的不同設(shè)計(jì)和長(zhǎng)度顯示在表1中。通過(guò)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系15PC3和518A2中，評(píng)價(jià)寡聚化合物在這些細(xì)胞系中破壞Bcl-2的潛力。Bcl-2轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定狀態(tài)由實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)，并被標(biāo)準(zhǔn)化成GAPDH轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定狀態(tài)水平。表3顯示與SEQ ID NO56(奧利默森鈉；完全改性的硫代磷酸酯；參比)相比的一系列有效化合物。
表3.由實(shí)時(shí)PCR確定的Bcl-2 mRNA表達(dá)。15PC3或518A2細(xì)胞被指定濃度的寡聚化合物轉(zhuǎn)染，24小時(shí)孵育后提取RNA。以相對(duì)于模擬處理的形式顯示下調(diào)結(jié)果。

實(shí)施例10用LNA反義寡聚化合物誘導(dǎo)凋亡轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以每孔12,000個(gè)細(xì)胞的密度接種在白色96孔板(Nunc 136101)內(nèi)DMEM中。第二天，在預(yù)熱的OptiMEM里洗滌細(xì)胞一次，隨后加入72μl含有5μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM將細(xì)胞培育7分鐘后，加入18μl在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸。最終寡核苷酸濃度在0.2nM到25nM的范圍內(nèi)。處理4小時(shí)后，將細(xì)胞在OptiMEM中洗滌，并加入50μl含血清的DMEM。用寡聚化合物處理后，使細(xì)胞恢復(fù)指定的時(shí)間，然后將細(xì)胞從CO2培養(yǎng)箱中取出并用15分鐘平衡到室溫。直接將相等體積的高度敏感性Capsase 3/7-GloTM試劑(Promega)加到96孔內(nèi)的細(xì)胞中，將板孵育60分鐘，然后在1分鐘遲滯后在來(lái)自Thermo Labsystems的Luminoskan Ascent儀器中記錄發(fā)光(螢光素酶活性)。螢光素酶活性以每秒的相對(duì)光單位(RLU/s)測(cè)量。在Ascent 2.6軟件中處理數(shù)據(jù)，并在excel中做圖。(見(jiàn)圖3A和3B)。
Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染前一天，將0.4×106個(gè)Hela細(xì)胞接種到T25燒瓶中。轉(zhuǎn)染當(dāng)日，將細(xì)胞在37℃的OpiMEM中洗滌一次，隨后加入2.8ml含有5μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。細(xì)胞孵育7分鐘后，加入700μl在OptiMEM中稀釋到最終寡核苷酸濃度為5nM或25nM的寡核苷酸。沒(méi)有寡核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。處理4小時(shí)后，將細(xì)胞在OptiMEM中洗滌，并加入3ml培養(yǎng)基。寡聚物處理后，允許細(xì)胞恢復(fù)48小時(shí)，然后收集細(xì)胞(通過(guò)刮)，在PBS中洗滌兩次。用5μl Annexin V-FITC和10μl碘化丙錠(PI-10mg/ml)孵育0.2×106個(gè)細(xì)胞，并在黑暗中RT下孵育15分鐘。
與在加入Annexin V-FITC前與阻斷Annexin V的結(jié)合的純化重組Annexin V孵育的轉(zhuǎn)染細(xì)胞被用于證實(shí)染色的特異性和選擇性。此外，TRAIL(Apo2L)誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞(0.5g/ml)被用做陽(yáng)性對(duì)照(數(shù)據(jù)未顯示)。(見(jiàn)圖3C和3D)實(shí)施例11在增殖的癌細(xì)胞中Bcl-2的反義寡核苷酸抑制轉(zhuǎn)染前日，將細(xì)胞以每孔12,000個(gè)細(xì)胞的密度接種在白色96孔板(Nunc 136101)內(nèi)DMEM中。第二天，在預(yù)熱的OptiMEM里洗滌細(xì)胞一次，隨后加入72μl含有5μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。將細(xì)胞培育7分鐘后，加入18μl在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸。最終寡核苷酸濃度在5nM到100nM的范圍內(nèi)。處理4小時(shí)后，將細(xì)胞在OptiMEM中洗滌，并加入100μl含血清的DMEM。用寡聚化合物處理后，使細(xì)胞恢復(fù)指定的時(shí)間，通過(guò)每100μlDMEM加入20μl四唑化合物[3-(4，5-二甲基-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-硫代苯基(sulophenyl))-2H-四唑，內(nèi)鹽；MTS]和電子偶聯(lián)試劑(吩嗪乙基硫酸酯；phenazine ethosulfate，PES)(CellTiter 96AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay，Promega)，測(cè)量活細(xì)胞。在Powerwave(Biotek Instruments)中以490nm測(cè)定活細(xì)胞。將生長(zhǎng)速率(ΔOD/小時(shí))對(duì)寡聚化合物濃度作圖(見(jiàn)圖4和5)。
實(shí)施例12體內(nèi)模型通過(guò)反義寡核苷酸的系統(tǒng)處理，對(duì)體內(nèi)生長(zhǎng)的人異種移植PC-3腫瘤細(xì)胞進(jìn)行腫瘤生長(zhǎng)抑制從M&B，丹麥購(gòu)買6周齡的雌性Balb/c無(wú)胸腺裸鼠，并在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)之前使之適應(yīng)氣候至少1周。將人類癌細(xì)胞，一般為懸浮在300μlmatrigel(BD Bioscience)中的3×106細(xì)胞，皮下注射到體側(cè)。對(duì)雙異種移植模型而言，植入兩個(gè)腫瘤，每側(cè)一個(gè)。當(dāng)確定腫瘤生長(zhǎng)時(shí)，一般在腫瘤細(xì)胞注射后5-12天；每天、每天兩次、每?jī)商旎蛎咳旎蛎恐懿捎肐P(腹膜內(nèi)(intaperitoneal))給藥途徑以0.01到20mg/kg/天給予不同的反義寡核苷酸長(zhǎng)達(dá)30天。對(duì)照動(dòng)物以同樣時(shí)間和同樣的給藥途徑僅給予生理鹽水。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組至少包括5只小鼠。通過(guò)由腫瘤體積測(cè)量的腫瘤生長(zhǎng)抑制來(lái)估測(cè)抗腫瘤活性。一般通過(guò)測(cè)量2個(gè)正交直徑來(lái)有規(guī)律地跟蹤腫瘤生長(zhǎng)。根據(jù)Teicher BA，Tumour Models inCancer Research.Humana Press，NJ，美國(guó)2002，第596頁(yè)腫瘤體積(mm3)＝L×W2×0.5)中的公式計(jì)算腫瘤體積，其中L代表最大直徑，W是與L垂直的腫瘤直徑。在處理結(jié)束時(shí)，處死動(dòng)物，測(cè)量腫瘤重量。使用Mann-Whitney檢測(cè)比較各組的平均腫瘤體積和重量。所有分析都在用于Windows的11.0版SPSS中進(jìn)行。見(jiàn)圖7A、7B、7C和7D。
實(shí)施例13體內(nèi)分析通過(guò)反義寡核苷酸的系統(tǒng)處理，對(duì)體內(nèi)生長(zhǎng)的人異種移植PC-3腫瘤細(xì)胞的Bcl-2進(jìn)行抑制從M&B，丹麥購(gòu)買6周齡的雌性Balb/c無(wú)胸腺裸鼠，并在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)之前使之適應(yīng)氣候至少1周。將人類癌細(xì)胞，一般為懸浮在300μlmatrigel(BD Bioscience)中的3×106細(xì)胞，皮下注射到體側(cè)。對(duì)雙異種移植模型而言，植入兩個(gè)腫瘤，每側(cè)一個(gè)。當(dāng)確定腫瘤生長(zhǎng)時(shí)，一般在腫瘤細(xì)胞注射后5-12天；每天、每天兩次、每?jī)商旎蛎咳旎蛎恐懿捎肐V(靜脈內(nèi))或IP(腹膜內(nèi))給藥途徑以0.01到20mg/kg/天給予不同的反義寡核苷酸長(zhǎng)達(dá)30天。對(duì)照動(dòng)物以同樣時(shí)間和同樣的給藥途徑僅給予鹽水。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包括至少5只小鼠。在處理結(jié)束時(shí)，麻醉小鼠，切除腫瘤，立即將其在液氮里冷凍。
為測(cè)量反義寡核苷酸是否在蛋白質(zhì)水平上有抑制作用，進(jìn)行了Western印跡分析。在4℃下用電動(dòng)勻漿器將腫瘤在裂解緩沖液(即，20mM Tris-Cl[pH 7.5]；2％Triton X-100；1/100體積蛋白酶抑制劑混合物套裝III(Calbiochem)；1/100體積蛋白酶抑制劑混合物套裝II(Calbiochem))中勻漿。每100mg腫瘤組織使用500μl裂解緩沖液。將來(lái)自每組小鼠的腫瘤裂解物集中，并在4℃下以13.000g離心5分鐘，以去除組織碎片。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(Pierce，Rockford)確定腫瘤提取物的蛋白質(zhì)濃度。
將腫瘤提取物(50-100μg)在4到20％的梯度SDS-PAGE凝膠上分級(jí)分離，并將其轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用氨基黑染色法顯色。用抗人Bcl-2抗體sc-509(Santa Cruz Biotechnology，Inc.Snata Cruz，CA，美國(guó))或抗人Bcl-2抗體(clone101，Zymed)、隨后用綴合了辣根過(guò)氧化物酶抗山羊IgG(DAKO)檢測(cè)Bcl-2的表達(dá)。用ECL Plus(Amershambiotech)檢測(cè)免疫反應(yīng)性，并用Versadoc 5000Lite系統(tǒng)(Bio-Rad)定量。
實(shí)施例14體內(nèi)將LNA Bcl-2寡聚物與在518A2人黑素瘤異種移植SCID小鼠中目前臨床測(cè)試的奧利默森鈉(SEQ ID NO56)進(jìn)行比較測(cè)試泄漏程度的4-6周齡無(wú)菌雌性C.B-17scid/scid(SCID)小鼠獲自Harlan & Winkelmann(Borchen，德國(guó))。將動(dòng)物圈養(yǎng)在層架(laminar flow rack)上的微隔離盒中，隨意獲得高壓滅菌的食物和水。對(duì)SCID小鼠皮下注射懸浮在200μl PBS中的1.5×107518A2人黑素瘤細(xì)胞至左下側(cè)。10天后，將所有長(zhǎng)出皮下可觸及腫瘤的小鼠隨機(jī)分為處理組或?qū)φ战M，并開(kāi)始處理。為連續(xù)皮下給藥，將小鼠麻醉，并將充滿生理鹽水溶液中的寡核苷酸或作為載體對(duì)照的鹽水的微型滲透泵皮下植入脊旁腔(paraspinal pocket)。
抗腫瘤活性按照參考時(shí)間表，以7mg/kg/天的標(biāo)準(zhǔn)劑量由微滲透泵皮下給予SEQ ID NO56(參比)14天。以7、3.5和1.75mg/kg連續(xù)皮下輸注LNA寡聚化合物SEQ ID NO15 14天。將經(jīng)鹽水處理的動(dòng)物作為對(duì)照。
由圓規(guī)測(cè)量的腫瘤隨時(shí)間的生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腫瘤重量是要被確定的主要參數(shù)。
見(jiàn)圖8A、8B、9、10A、10B和10C，其中顯示了1.75mg/kg的SEQID NO15的數(shù)據(jù)。增加濃度(7和3.5mg/kg)未導(dǎo)致腫瘤重量或腫瘤體積的進(jìn)一步減小，這表示SEQ ID NO15化合物在較低濃度時(shí)具有劑量反應(yīng)曲線。
圖11顯示1和7mg/kg時(shí)SEQ ID NO8的數(shù)據(jù)以及7mg/kg時(shí)SEQID NO15和SEQ ID NO56的數(shù)據(jù)。當(dāng)給予SEQ ID NO8化合物時(shí)，未觀察到隨處理時(shí)間的體量減小，對(duì)照表現(xiàn)出相似模式。
實(shí)施例15大鼠血漿中SEQ ID NO15和SEQ ID NO8的穩(wěn)定性大鼠血漿(NtacSD雄性，Li-Heparine(Taconic，M&B))中20μM SEQ ID NO15在37℃下不同時(shí)間點(diǎn)樣品內(nèi)的穩(wěn)定性0、4、24和48小時(shí)。SEQ ID NO56與SEQ ID NO56(參比)對(duì)應(yīng)。SEQ ID NO20和16是也進(jìn)行了測(cè)試的其他寡核苷酸。為了具有一個(gè)能識(shí)別SEQ IDNO15的可能消化片段的對(duì)照，還包括了與SEQ ID NO15(自3’-端)的n-1，n-2和n-3相應(yīng)的寡核苷酸。還包括了市售ladder(10和20mer在PAGE上可見(jiàn))。(見(jiàn)圖12A)大鼠血漿(NtacSD雄性，Li-Heparine(Taconic，M&B))中20μM SEQ ID NO8在37℃下不同時(shí)間點(diǎn)樣品內(nèi)的穩(wěn)定性0、4、24和48小時(shí)。SEQ ID NO56與SEQ ID NO56(參比)對(duì)應(yīng)。SEQ ID NO9是也進(jìn)行了測(cè)試的另一種寡核苷酸。為了具有一個(gè)能識(shí)別SEQ ID NO8的可能消化片段的對(duì)照，還包括了與SEQ ID NO8(自3’-末端)的n-1，n-2和n-3相當(dāng)?shù)墓押塑账?。也包括了市售ladder(10和20mer在PAGE上可見(jiàn))。(見(jiàn)圖12B)寡聚化合物，例如SEQ ID NO8和SEQ ID NO15，被合成為DNA的3’端通過(guò)硫代磷酸酯連接到相鄰LNA的寡核苷酸。所述的3’DNA部分可被核酸外切酶切除。降解產(chǎn)物是截?cái)?個(gè)核苷酸(N-1)的寡聚化合物(SEQ ID NO35)，所述的截?cái)?個(gè)核苷酸的寡聚化合物與全長(zhǎng)母分子相比，對(duì)核酸酶降解具有充分增強(qiáng)的抗性。在例如SEQ IDNO8(見(jiàn)圖2C)情況下，N-1化合物(如SEQ ID NO35)保持完全活性。
實(shí)施例16肝臟和腎中SEQ ID NO15的組織半衰期分析將90只NMRI雌性小鼠(大約30g)被分為5組，并30秒內(nèi)靜脈內(nèi)注射給予25mg/kg SPC 2996(10ml/kg，2.5mg/ml)。對(duì)對(duì)照組給予0.9％的鹽水。注射后30分鐘、6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)處死所述組。取出組織樣品并在RNA-later里制備。
從組織里提取寡核苷酸將約100mg組織在500μl提取緩沖液(0.5％Igepal CA-630，25mMTris pH 8.0，25mM EDTA，100mM NaCl，含有1mg/ml RNAse A)里機(jī)械勻漿，并在37℃下孵育過(guò)夜。用參比寡核苷酸示蹤500ml，并通過(guò)加入1ml苯酚-isoamyl-choloroform(25∶1∶24(v/v/v))萃取。將水相轉(zhuǎn)移到新試管里并再次萃取。如果必要，將提取物凍干。
對(duì)從組織樣品里提取出的寡核苷酸進(jìn)行IEX-HPLC分析通過(guò)配有保護(hù)柱DNAPac PA-100(2×50毫米，Dioex)的DNA PacPA-100(2×250毫米，Dioex)柱分離體積為50μl的樣品。該柱子加熱到40℃。流速0.25ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。流動(dòng)相A的梯度TRIS(20mM)、EDTA(1mM)和高氯酸鈉(10mM)pH7.6，BTRIS(20mM)、EDTA(1mM)和高氯酸鈉(1M)pH7.6，(0-13分鐘，A20％、B20％；14-18分鐘，A40％、B60％；22-28分鐘，A0％、B100％；33-38分鐘，A80％、B20％)。
圖13顯示單劑量靜脈內(nèi)注射(25mg/kg)后，SEQ ID NO15在NMRI小鼠的肝臟和腎里的組織半壽期。
序列表<110>Santaris A/S<120>用于調(diào)節(jié)bcl-2的寡聚化合物<130>15705PCT00<160>64<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>49tntnccagcg tgngnc 16<210>50<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>50
tnccagcgtg cgcnat 16<210>51<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(3)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(14)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>51tnncagcgtg cgnnat 16<210>52<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(4)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(14)
<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>52tnnnagcgtg cgnnat 16<210>53<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(16)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>53tntcccagca tgcgnnat18<210>54<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(16)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>54tntcccagct tgcgnnat18<210>55<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(16)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>55tntcccagcc tgcgnnat18<210>56<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<400>56tctcccagcg tgcgccat18<210>57
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(16)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>57tntcccagca tgtgnnat18<210>58<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>58ancgcgtgcg accntc 16
<210>59<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(6)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(16)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>59tntnnnagng tgngnnat18<210>60<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(17)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>60ntcccaacmg tgcmgnna18<210>61<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(5)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n是5-甲基胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(15)<223>n是5-甲基胞嘧啶<400>61ntnnnaangt gngnna 16<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<400>62catgtgtgtg gagagcgtca a21<210>63<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列<400>63gccggttcag gtactcagtc a21<210>64<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸序列
<400>64cctggtggac aacatcgccc tgt 2權(quán)利要求
1.10-30個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度的寡聚化合物，其包含與人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的區(qū)域可特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，所述靶結(jié)合區(qū)具有下式5′-[(DNA/RNA)0-1-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA/LNA*)4-14-(LNA/LNA*)2-7-(DNA/RNA)0-1]-3′其中，“LNA”表示LNA核苷酸，“LNA*”表示LNA類似物核苷酸；并且所述靶結(jié)合區(qū)包含至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)連接的LNA核苷酸或LNA類似物核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)中的大量核苷酸連鍵是硫代磷酸酯基團(tuán)(-O-P(O，S)-O-)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中寡聚化合物中的所有核苷酸連鍵是硫代磷酸酯基團(tuán)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)中10-50％的核苷堿基是LNA核苷酸的核苷堿基。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7-(DNA/RNA)]-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[(DNA/RNA)-LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)具有式5’-[LNA2-7-(DNA)4-14-LNA2-7]-3’。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)中10-100％的核苷堿基是LNA類似物核苷酸(LNA*)的核苷堿基。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)與和其特異性雜交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的部分區(qū)域互補(bǔ)，其中可能有至多2個(gè)非互補(bǔ)核苷堿基除外。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)與和其特異性雜交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的部分區(qū)域互補(bǔ)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)選自SEQID NO1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14、35、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)是SEQ IDNO8。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)是SEQ IDNO35。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)與和其特異性雜交的人Bcl-2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基位置之間的部分區(qū)域互補(bǔ)，其中1-2個(gè)非互補(bǔ)核苷堿基除外。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)包含CCCAXCGT亞序列，其中X不是G(鳥(niǎo)嘌呤)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)選自SRQID NO15、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、29、53、54和55。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)選自SEQID NO15。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其中所述靶結(jié)合區(qū)選自SEQID NO29。
20.包含根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物和至少一種共價(jià)連接到所述化合物上的非核苷酸/非多核苷酸部分的綴合物。
21.包含根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物或根據(jù)權(quán)利要求20所述的綴合物和藥物可接受載體的藥物組合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其包含選自化療化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制化合物、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡化合物、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑和激酶抑制劑中的額外藥劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物或根據(jù)權(quán)利要求20的綴合物用作藥物。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物或根據(jù)權(quán)利要求20的綴合物在制備用于治療癌癥疾病的藥物中的用途。
25.包含與編碼人Bcl-2蛋白的核糖核酸雜交的化合物的復(fù)合物，所述化合物是權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)定義的寡聚化合物或權(quán)利要求20定義的綴合物。
全文摘要
本發(fā)明提供改進(jìn)的寡聚化合物，特別是寡核苷酸化合物，以及在人中調(diào)節(jié)BCL－2基因表達(dá)的方法。具體而言，本發(fā)明涉及10－30個(gè)核苷堿基長(zhǎng)度的寡聚化合物，其包含與人Bcl－2mRNA上第1459(5’)位至第1476(3’)位堿基之間的區(qū)域可特異性雜交的靶結(jié)合區(qū)，所述靶結(jié)合區(qū)具有式5’－[(DNA/RNA)
文檔編號(hào)A61K48/00GK1918292SQ200480041819
公開(kāi)日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月23日
發(fā)明者M·弗雷登, J·B·漢森, H·歐拉姆, M·韋斯特加德, C·A·斯魯 申請(qǐng)人:桑塔里斯制藥公司