專(zhuān)利名稱(chēng)：干細(xì)胞及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞及其分離鑒別方法以及該細(xì)胞的用途。
背景技術(shù)：
已經(jīng)報(bào)道了用[c-Kit-、CD49f+、CD29+、CD45-、TER119-]作標(biāo)志從小鼠胚胎肝臟中分離肝祖細(xì)胞的方法(Hepatology 32(6)，1230-1239(2000))、用[c-Met+、CD49f+/low、c-Kit-、CD45-、TER119-]作標(biāo)志分離肝臟干細(xì)胞的方法(谷口英樹(shù)第117次日本醫(yī)學(xué)會(huì)研討會(huì)“干細(xì)胞與細(xì)胞療法”記錄集，80-89(2001))。雖然認(rèn)為存在器官固有的干細(xì)胞，但是未預(yù)見(jiàn)到干細(xì)胞中存在共同的標(biāo)志。特別是對(duì)于分化為多種多樣、在各方面發(fā)揮著生理學(xué)機(jī)能的胰臟干細(xì)胞，其分離鑒別方法現(xiàn)在仍未確定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供胰臟干細(xì)胞的分離和鑒別方法。本發(fā)明的目的還在于提供胰臟干細(xì)胞以及提供該干細(xì)胞作為藥物和/或試劑。
本發(fā)明人為實(shí)現(xiàn)上述目的，進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了胰臟干細(xì)胞中[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-]這一共同標(biāo)志的表達(dá)形式，利用該特征成功地實(shí)現(xiàn)了胰臟干細(xì)胞的適當(dāng)分離和鑒別。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步詳細(xì)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1-]這一標(biāo)志的表達(dá)形式為指標(biāo)，可以更適當(dāng)?shù)胤蛛x、鑒別胰臟干細(xì)胞，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下所述。
(1)從哺乳動(dòng)物的胰臟分離胰臟干細(xì)胞的方法，該方法使用2種或多種對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119的標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行。
(2)從哺乳動(dòng)物的胰臟分離胰臟干細(xì)胞的方法，該方法使用2種或多種對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119和Flk-1的標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行。
(3)上述(1)或(2)的方法，其中具有特異親和性的物質(zhì)為標(biāo)志蛋白的抗體。
(4)鑒別哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的方法，該方法使用2種或多種對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119的標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行。
(5)鑒別哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的方法，該方法使用2種或多種對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119和Flk-1的標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行。
(6)上述(4)或(5)的方法，其中具有特異親和性的物質(zhì)為標(biāo)志蛋白的抗體。
(7)從哺乳動(dòng)物的胰臟分離胰臟干細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119的2種或多種標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析的步驟。
(8)從哺乳動(dòng)物的胰臟分離胰臟干細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45、TER119和Flk-1的2種或多種標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析的步驟。
(9)鑒別哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119的2種或多種標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析的步驟。
(10)鑒別哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45、TER119和Flk-1的2種或多種標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析的步驟。
(11)胰臟干細(xì)胞，該胰臟干細(xì)胞用上述(1)、(2)、(7)或(8)中任一項(xiàng)的方法從哺乳動(dòng)物的胰臟分離得到。
(12)上述(11)的胰臟干細(xì)胞，該胰臟干細(xì)胞以c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-的形式顯示c-Met、c-Kit、CD45和TER119這四個(gè)標(biāo)志。
(13)上述(11)的胰臟干細(xì)胞，該胰臟干細(xì)胞以c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1-的形式顯示c-Met、c-Kit、CD45、TER119和Flk-1這五個(gè)標(biāo)志。
(14)預(yù)防或治療胰臟機(jī)能減退疾病的藥物，該藥物含有上述(12)或(13)的胰臟干細(xì)胞或從該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞。
(15)預(yù)防或治療肝、膽管或胃腸機(jī)能減退疾病的藥物，該藥物含有上述(12)或(13)的胰臟干細(xì)胞或從該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞。
(16)篩選誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞分化的物質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟(i)使胰臟干細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟，(ii)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中胰臟標(biāo)志的表達(dá)的步驟。
(17)篩選誘導(dǎo)向哺乳動(dòng)物的肝、膽管或胃腸分化的物質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟(i)使上述(12)或(13)的胰臟干細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟，(ii)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中肝、膽管或胃腸標(biāo)志的表達(dá)的步驟。
(18)篩選哺乳動(dòng)物的胰臟機(jī)能調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟(i)使胰臟干細(xì)胞或從該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟，(ii)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中胰臟標(biāo)志的表達(dá)的步驟。
(19)篩選哺乳動(dòng)物的肝、膽管或胃腸機(jī)能調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟(i)使上述(12)或(13)的胰臟干細(xì)胞或從該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟，(ii)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中肝、膽管或胃腸標(biāo)志的表達(dá)的步驟。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供使用對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119的2種或多種，優(yōu)選3種或多種，最優(yōu)選4種全部標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因分別具有特異親和性的物質(zhì)，從哺乳動(dòng)物的胰臟分離、鑒別胰臟干細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還提供使用對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45、TER119和Flk-1的2種或多種，優(yōu)選3種或多種，更優(yōu)選4種或多種，最優(yōu)選5種全部標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因分別具有特異親和性的物質(zhì)，從哺乳動(dòng)物的胰臟分離、鑒別胰臟干細(xì)胞的方法。
本說(shuō)明書(shū)中的“哺乳動(dòng)物”具體是指人、牛、馬、狗、豚鼠、小鼠、大鼠等。
c-Met蛋白是原癌基因產(chǎn)物，作為具有酪氨酸激酶活性的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGF受體)發(fā)揮作用。已有關(guān)于其表達(dá)與胃、膽管等中的癌具有相關(guān)性的報(bào)道。c-Kit蛋白也是同樣的原癌基因產(chǎn)物，是具有與巨噬細(xì)胞集落刺激因子或血小板衍生生長(zhǎng)因子的受體相同結(jié)構(gòu)的受體酪氨酸激酶，據(jù)報(bào)道與某些種類(lèi)的腫瘤有關(guān)。CD45蛋白是白細(xì)胞共同抗原的一種，已知除紅細(xì)胞、血小板及它們的祖細(xì)胞外，在所有的造血細(xì)胞中都有表達(dá)。已知TER119蛋白是選別類(lèi)紅細(xì)胞的有效的細(xì)胞表面標(biāo)志。已知Flk-1蛋白是選別血管內(nèi)皮細(xì)胞的有效的細(xì)胞表面標(biāo)志。本發(fā)明以這些蛋白或編碼這些蛋白的基因在胰臟干細(xì)胞中顯示出特有的表達(dá)形式這一新發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)。本說(shuō)明書(shū)中，“標(biāo)志”如無(wú)預(yù)先說(shuō)明，則是指由這樣的在胰臟干細(xì)胞中顯示出特有表達(dá)形式的一系列蛋白或編碼這些蛋白的基因構(gòu)成的各個(gè)組。所述標(biāo)志蛋白隨哺乳動(dòng)物的種類(lèi)等不同而具有不同的氨基酸序列，本發(fā)明中只要與其在胰臟干細(xì)胞中的表達(dá)形式一樣，則這樣的蛋白也可以用作標(biāo)志蛋白都在本發(fā)明范圍內(nèi)。具體而言，各蛋白的氨基酸序列具有40％以上同源性的同源物也可以用作本發(fā)明的標(biāo)志蛋白，即用作c-Met、c-Kit、CD45、TER119和Flk-1。本發(fā)明包括用對(duì)各標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)分析這些標(biāo)志蛋白和/或編碼這些標(biāo)志蛋白的基因的表達(dá)的步驟。
本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)于“使用”這一用語(yǔ)，對(duì)其方法沒(méi)有特別限制，具體而言，例如使用對(duì)標(biāo)志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)時(shí)，可以有利用與該標(biāo)志蛋白的抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的方法；或者使用對(duì)編碼標(biāo)志蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)時(shí)，可以有利用雜交反應(yīng)的方法(后面描述詳細(xì)的操作)。
作為對(duì)標(biāo)志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)，例如有對(duì)該蛋白具有特異親和性的抗體或其片段，所述特異親和性是指通過(guò)抗原抗體反應(yīng)特異性識(shí)別該蛋白、并與其結(jié)合的能力。只要該抗體或其片段是可以與該蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)即可，對(duì)其沒(méi)有特別限制，可以是多克隆抗體、單克隆抗體以及它們的功能性片段。這些抗體或其功能性片段可以通過(guò)本領(lǐng)域通常所用的方法進(jìn)行制備。例如在采用多克隆抗體的情況下，有將該蛋白注射到小鼠或兔子等動(dòng)物的背部皮下或腹腔內(nèi)或者靜脈等進(jìn)行免疫，等抗體滴度上升后采集抗血清的方法。或者在采用單克隆抗體的情況下，有按照常規(guī)方法制備雜交瘤，采集其分泌液的方法。制備抗體片段的方法常常采用使克隆的抗體基因片段在微生物等中表達(dá)的方法。該抗體、抗體片段等的純度只要保持對(duì)該蛋白的特異親和性即可，對(duì)其沒(méi)有特別限定。這些抗體或其片段可以用螢光物質(zhì)、酶或放射性同位素等進(jìn)行標(biāo)記。而且這些可以使用市售的物質(zhì)。
作為對(duì)編碼標(biāo)志蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)，例如有對(duì)該基因具有特異親和性的寡核苷酸或多核苷酸探針(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為探針)以及寡核苷酸或多核苷酸引物對(duì)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為引物對(duì))，所述“特異親和性”是指只與目標(biāo)基因雜交的性質(zhì)，因此可以與該基因全部或部分互補(bǔ)，或者在滿足上述性質(zhì)的范圍內(nèi)可以含有一個(gè)至數(shù)個(gè)錯(cuò)配。該探針、引物對(duì)只要是對(duì)該基因具有特異親和性即可，對(duì)其沒(méi)有特別限定，例如可以是含有該基因的堿基序列的全部或一部分以及它們的互補(bǔ)序列的寡核苷酸或多核苷酸等，根據(jù)需檢測(cè)的基因的形態(tài)適當(dāng)選擇。所述寡核苷酸或多核苷酸只要對(duì)該基因具有特異親和性即可，對(duì)其來(lái)源沒(méi)有特別限定，可以是合成物質(zhì)，也可以是從該基因切割出需要的部分，通過(guò)常用方法進(jìn)行純化的物質(zhì)。這些寡核苷酸或多核苷酸可以用螢光物質(zhì)、酶或放射性同位素等進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明的胰臟干細(xì)胞的分離或鑒別方法通過(guò)用對(duì)上述5種標(biāo)志蛋白或編碼該標(biāo)志蛋白的基因分別具有特異親和性的5種物質(zhì)中的至少2種，優(yōu)選3種，更優(yōu)選4種，最優(yōu)選5種全部來(lái)對(duì)至少2種，優(yōu)選3種，更優(yōu)選4種，最優(yōu)選5種所有的標(biāo)志進(jìn)行分析而實(shí)施。通過(guò)所述分析，分離出滿足[c-Met表達(dá)、c-Kit不表達(dá)、CD45不表達(dá)、TER119不表達(dá)、Flk-1不表達(dá)](可記為[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1-])特征中至少2個(gè)、優(yōu)選3個(gè)、更優(yōu)選4個(gè)、最優(yōu)選5個(gè)特征的細(xì)胞，從而可得到來(lái)自哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞。所述干細(xì)胞顯示[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1-]標(biāo)志。這里“顯示”是指具有“表達(dá)”或“不表達(dá)”各標(biāo)志蛋白或編碼標(biāo)志蛋白的基因的特征。
用各個(gè)具有特異親和性的物質(zhì)選別、分離顯示各種標(biāo)志的細(xì)胞的方法，通?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域的常用方法及其組合方法。例如，在蛋白質(zhì)水平分析標(biāo)志時(shí)，特別是要求在活狀態(tài)下回收細(xì)胞時(shí)，適當(dāng)選擇標(biāo)記該物質(zhì)的染料，利用流式細(xì)胞儀的方法是比較合適的。更優(yōu)選用熒光激活細(xì)胞分類(lèi)儀(FACS)分離細(xì)胞。通過(guò)使用該裝置，可以自動(dòng)分離、回收目標(biāo)細(xì)胞。
對(duì)于鑒別等不是特別要求以活細(xì)胞回收的情況，可以將細(xì)胞破碎、提取，回收mRNA，進(jìn)行RNA印跡分析，也可以提取膜蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。
作為以基因表達(dá)為指標(biāo)分離干細(xì)胞的方法，例如可以利用以c-Met啟動(dòng)子使GEP(綠色熒光蛋白)基因表達(dá)，用FACS分離的步驟。該步驟(c-Met表達(dá)細(xì)胞的分離、鑒別)通過(guò)與以其它標(biāo)志的表達(dá)為指標(biāo)的方法組合，成為更有效的干細(xì)胞的分離、鑒別手段。
本發(fā)明中，用本發(fā)明的分離方法和鑒別方法可以得到或確認(rèn)哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞。通過(guò)在適當(dāng)條件下誘導(dǎo)分化，所述干細(xì)胞可分化成具有各種生理學(xué)機(jī)能的細(xì)胞(下文將這種接受分化誘導(dǎo)并發(fā)揮生理學(xué)機(jī)能的細(xì)胞簡(jiǎn)稱(chēng)為機(jī)能細(xì)胞)。這里“適當(dāng)?shù)臈l件”是指在添加了肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等細(xì)胞因子的培養(yǎng)條件。例如已知胰臟干細(xì)胞分化成產(chǎn)胰高血糖素細(xì)胞α細(xì)胞、產(chǎn)胰島素細(xì)胞β細(xì)胞、產(chǎn)胰多肽細(xì)胞γ細(xì)胞、產(chǎn)促生長(zhǎng)素抑制素細(xì)胞δ細(xì)胞、外分泌細(xì)胞等，所述分化可以通過(guò)檢測(cè)是否存在這些細(xì)胞表達(dá)、分泌的生理活性物質(zhì)來(lái)確認(rèn)。
本發(fā)明可以穩(wěn)定供應(yīng)干細(xì)胞，因而也可以在所需時(shí)間提供所需量的由該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞。例如，有望通過(guò)將由胰臟干細(xì)胞分化而成的細(xì)胞移植到胰臟機(jī)能減退疾病患者的體內(nèi)，使胰臟機(jī)能恢復(fù)，達(dá)到治療胰臟機(jī)能減退疾病的效果。胰臟機(jī)能減退疾病的例子有糖尿病、慢性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、胰臟切除后常見(jiàn)的胰臟功能失調(diào)等。由于本發(fā)明的由胰臟干細(xì)胞分化而成的細(xì)胞可表達(dá)肝、膽管或胃腸標(biāo)志，因而有望通過(guò)將由胰臟干細(xì)胞分化而成的細(xì)胞移植到肝、膽管或胃腸機(jī)能減退疾病患者的體內(nèi)，使肝、膽管或胃腸機(jī)能恢復(fù)，達(dá)到治療肝、膽管或胃腸機(jī)能減退疾病的效果。肝、膽管機(jī)能減退疾病的例子有急性肝炎、慢性肝炎、代謝性肝疾病等，胃腸機(jī)能減退疾病的例子有短腸綜合征、炎癥性腸疾病、胃切除后常見(jiàn)的胃功能失調(diào)等。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明的胰臟干細(xì)胞篩選誘導(dǎo)胰臟干細(xì)胞分化的物質(zhì)的方法。該方法包括至少下述步驟(1)使胰臟干細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟；(2)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中胰臟標(biāo)志的表達(dá)的步驟。
本篩選方法所用的胰臟干細(xì)胞只要是可分化為胰臟的機(jī)能細(xì)胞的細(xì)胞即可，對(duì)其沒(méi)有特別限定，優(yōu)選用上述本發(fā)明方法分離的胰臟干細(xì)胞。該干細(xì)胞與測(cè)試物的反應(yīng)可根據(jù)所需分化的種類(lèi)、分化誘導(dǎo)條件等適當(dāng)設(shè)定，通常在35-40℃培養(yǎng)數(shù)分鐘至數(shù)十天，優(yōu)選在36.5℃-37.5℃培養(yǎng)8-30天。在與測(cè)試物反應(yīng)后檢測(cè)該干細(xì)胞是否分化以及分化狀況。
可以通過(guò)測(cè)定其胰臟標(biāo)志的表達(dá)來(lái)確認(rèn)干細(xì)胞是否發(fā)生了分化。該標(biāo)志可根據(jù)所需的機(jī)能細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)選擇。這里的胰臟標(biāo)志是胰臟特異性，特別是在胰臟的機(jī)能細(xì)胞中特異性表達(dá)并產(chǎn)生(分泌)的蛋白或編碼該蛋白的基因，例如可以通過(guò)檢測(cè)胰高血糖素的產(chǎn)生和分泌來(lái)確認(rèn)分化成α細(xì)胞的分化誘導(dǎo)能力，通過(guò)檢測(cè)胰島素的產(chǎn)生和分泌來(lái)確認(rèn)分化成β細(xì)胞的分化誘導(dǎo)能力。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明的胰臟干細(xì)胞或其經(jīng)誘導(dǎo)分化而來(lái)的機(jī)能細(xì)胞篩選調(diào)節(jié)胰臟機(jī)能的物質(zhì)的方法。該方法包括至少下述步驟(1)使胰臟干細(xì)胞或由該干細(xì)胞分化而成的細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟；(2)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中胰臟標(biāo)志的表達(dá)的步驟。
本篩選方法中所用的胰臟干細(xì)胞和由其分化而成的機(jī)能細(xì)胞只要是分化成胰臟機(jī)能細(xì)胞的細(xì)胞和其經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞即可，對(duì)其沒(méi)有特別限定，優(yōu)選用上述本發(fā)明的方法分離而得的胰臟干細(xì)胞及其在適當(dāng)條件(上述)下分化而成的細(xì)胞?？梢岳缇唧w如下實(shí)施篩選。向胰臟干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中加入測(cè)試物，培養(yǎng)8-30天后，通過(guò)分析誘導(dǎo)分化的機(jī)能細(xì)胞中基因或蛋白(標(biāo)志)的表達(dá)，來(lái)分析該測(cè)試物在胰臟機(jī)能細(xì)胞的分化、增殖中所起的作用(定量PCR、RNA印跡法、免疫染色、ELISA等)。
本發(fā)明的篩選方法中，對(duì)象測(cè)試物可以是已知或未知的各種物質(zhì)，具體例子有已知的細(xì)胞因子、胞外基質(zhì)、無(wú)機(jī)化合物或適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)株的培養(yǎng)上清或從適當(dāng)?shù)腸DNA文庫(kù)得到的未知的基因或該基因的重組蛋白等。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明的胰臟干細(xì)胞篩選誘導(dǎo)向肝、膽管或胃腸分化的物質(zhì)的方法。該方法包括至少下述步驟(1)使本發(fā)明的胰臟干細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟；(2)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中肝、膽管或胃腸標(biāo)志的表達(dá)的步驟。
該干細(xì)胞與測(cè)試物的反應(yīng)可根據(jù)所需分化的種類(lèi)、分化誘導(dǎo)條件等適當(dāng)設(shè)定，通常在35-40℃培養(yǎng)數(shù)分鐘至數(shù)十天，優(yōu)選在36.5℃-37.5℃培養(yǎng)8-30天。在與測(cè)試物反應(yīng)后檢測(cè)該干細(xì)胞是否分化以及分化狀況。
可以通過(guò)測(cè)定其肝、膽管或胃腸標(biāo)志的表達(dá)來(lái)確認(rèn)干細(xì)胞是否發(fā)生了分化。該標(biāo)志可根據(jù)所需機(jī)能細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)選擇。這里的肝、膽管或胃腸標(biāo)志是肝、膽管或胃腸特異性，特別是在肝、膽管或胃腸的機(jī)能細(xì)胞中表達(dá)并產(chǎn)生(分泌)的蛋白或編碼該蛋白的基因，肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志的例子有清蛋白、α-胎兒球蛋白、葡糖-6-磷酸酶、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、細(xì)胞角蛋白19、細(xì)胞角蛋白18、細(xì)胞角蛋白8、膽汁糖蛋白(biliary glycoprotein)或編碼上述蛋白的基因，胃腸細(xì)胞標(biāo)志的例子有fabp-2、GIP、CCK、TPH、胃蛋白酶原F、胃泌素或編碼上述蛋白的基因。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明的胰臟干細(xì)胞或其經(jīng)誘導(dǎo)分化而來(lái)的機(jī)能細(xì)胞篩選調(diào)節(jié)肝、膽管或胃腸機(jī)能的物質(zhì)的方法。該方法包括至少下述步驟(1)使本發(fā)明的胰臟干細(xì)胞或由該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟；(2)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中肝、膽管或胃腸標(biāo)志的表達(dá)的步驟。
篩選可以例如具體如下實(shí)施。向胰臟干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中加入測(cè)試物，培養(yǎng)8-30天后，通過(guò)分析誘導(dǎo)分化的機(jī)能細(xì)胞中基因或蛋白(標(biāo)志)的表達(dá)，分析該測(cè)試物在胰臟機(jī)能細(xì)胞的分化、增殖中所起的作用(定量PCR、RNA印跡法、免疫染色、ELISA等)。
本發(fā)明的篩選方法中，對(duì)象測(cè)試物可以是已知或未知的各種物質(zhì)，具體例子有已知的細(xì)胞因子、胞外基質(zhì)、無(wú)機(jī)化合物或適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)株的培養(yǎng)上清或從適當(dāng)?shù)腸DNA文庫(kù)得到的未知的基因或該基因的重組蛋白等。
由這樣的篩選方法得到的誘導(dǎo)胰臟干細(xì)胞分化的物質(zhì)、誘導(dǎo)向肝、膽管或胃腸分化的物質(zhì)、胰臟機(jī)能調(diào)節(jié)物質(zhì)或肝、膽管或胃腸機(jī)能調(diào)節(jié)物質(zhì)可用作胰臟機(jī)能減退疾病、肝、膽管機(jī)能減退疾病和胃腸機(jī)能減退疾病的治療藥物。這里的胰臟機(jī)能減退疾病、肝、膽管機(jī)能減退疾病和胃腸機(jī)能減退疾病與上述相同。
本發(fā)明的含有胰臟干細(xì)胞或由該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞的藥物(以下稱(chēng)為本發(fā)明的藥物)可用于預(yù)防、治療人、猴、小鼠、大鼠、兔子、豬、狗、馬、牛等各種哺乳動(dòng)物的胰臟機(jī)能減退疾病、肝、膽管機(jī)能減退疾病和胃腸機(jī)能減退疾病。其給藥量只要是該疾病處置所必需的量即可，對(duì)其沒(méi)有特別限定，隨需要進(jìn)行這種處置的對(duì)象的種類(lèi)、年齡、性別、體重等條件和癥狀而變化。
本發(fā)明的藥物中可以混合例如片劑、丸劑、錠劑、膠囊、栓劑、乳油、軟膏、氣霧劑、吸入粉霧劑、溶液劑、乳劑、混懸劑、其他適于使用用途的劑型中常用的制藥上可接受的實(shí)質(zhì)上無(wú)毒的載體或賦形劑。還可以根據(jù)需要混合助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、著色劑和香料等添加劑。
本發(fā)明的藥物可以用本領(lǐng)域公知的制劑技術(shù)進(jìn)行制造。本發(fā)明的藥物還可以根據(jù)需要用本領(lǐng)域公知的方法制成前藥。
實(shí)施例下面通過(guò)實(shí)施例具體詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限定。
實(shí)施例1胰臟細(xì)胞的回收在立體顯微鏡下從C57BL/6新生小鼠(出生后第1天)摘出胰臟，放入含有0.05％膠原酶和5mmol/L CaCl2(pH7.4)的無(wú)Ca2+的Hank’s平衡鹽溶液中。將其在37℃溫育10分鐘后，通過(guò)輕輕地吹吸來(lái)分離細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次。制備后，用錐蟲(chóng)藍(lán)檢測(cè)證明有80％以上的細(xì)胞存活。使用將下列組分獨(dú)立配制而成的細(xì)胞培養(yǎng)液。
(細(xì)胞培養(yǎng)液的配制)向DMEM和F-12的1∶1混合液中加入胎牛血清(FBS，10％)、γ-胰島素(1μg/mL)、地塞米松(1×10-7M)、煙酰胺(10mM)、L-谷酰胺(2mM)、β-巰基乙醇(50μM)、HEPES(5mM)和青霉素/鏈霉素進(jìn)行配制。
流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)首先使制備的細(xì)胞與生物素化的抗CD45單克隆抗體(PharMingen，San Joes，CA)、生物素化的抗TER119單克隆抗體(PharMingen，San Joes，CA)和抗c-Met單克隆抗體(Upstate biotechnology，Lake Placid，NY)在冰中反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后用染色介質(zhì)(含有3％FBS的PBS(磷酸緩沖鹽溶液))將細(xì)胞洗滌3次，接著與FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的抗小鼠IgG2a單克隆抗體(PharMingen，San Joes，CA)、APC(別藻藍(lán)蛋白)標(biāo)記的抗c-Kit單克隆抗體(PharMingen，San Joes，CA)和德克薩斯紅標(biāo)記的鏈霉抗生物素(Gibco BRL，GaithersBurg，MD)在冰中反應(yīng)30分鐘。最后用染色介質(zhì)洗滌細(xì)胞3次，將細(xì)胞懸浮于含有PI(碘化丙錠)(5μg/mL)的染色介質(zhì)中。將這些熒光標(biāo)記的細(xì)胞用FACS-vantage進(jìn)行分析，分離各流分。以陰性對(duì)照為指標(biāo)進(jìn)行閘門(mén)的設(shè)定。
細(xì)胞的回收首先對(duì)CD45-、TER119-細(xì)胞設(shè)置閘門(mén)，除去CD45+細(xì)胞和TER119+細(xì)胞。通過(guò)該操作可以除去血細(xì)胞。然后將CD45-細(xì)胞、TER119-細(xì)胞分組到c-Met+/c-Kit-、c-Met-/c-Kit+、c-Met+/c-Kit+和c-Met-/c-Kit-細(xì)胞流分中，設(shè)置細(xì)胞的回收閘門(mén)。接著，將回收的細(xì)胞以200細(xì)胞/cm2的濃度接種到35mm直徑的組織培養(yǎng)皿上，進(jìn)行低密度培養(yǎng)。將殘存的紅細(xì)胞、細(xì)胞殘骸、2個(gè)以上細(xì)胞凝集而成的細(xì)胞塊和死細(xì)胞通過(guò)向前散射光、側(cè)散射光和PI除去。回收后，錐蟲(chóng)藍(lán)檢測(cè)證明有90％以上的細(xì)胞存活。
體外的集落分析將通過(guò)FACS回收的細(xì)胞在上述細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)(37℃，5％CO2)。培養(yǎng)開(kāi)始24小時(shí)后，加入人重組肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rHGF)(50ng/mL；Sigma)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(20ng/mL；Sigma)。在培養(yǎng)開(kāi)始后第8天測(cè)定集落數(shù)。
RT-PCR在培養(yǎng)了14天的集落上套上克隆環(huán)，向其中加入ISOGEN，通過(guò)輕輕地吹吸，從集落形成細(xì)胞中得到RNA。接著，用逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperSctipt II)由所得RNA制備cDNA。然后以制備的cDNA為模板，用下面的引物進(jìn)行PCR，嘗試檢測(cè)各種胰臟機(jī)能細(xì)胞的標(biāo)志。
目標(biāo)標(biāo)志及其引物如表1所示。
表1中的各種引物使用請(qǐng)北海道System Science株式會(huì)社合成的引物。
PCR循環(huán)為95℃(4分鐘)→[94℃(1分鐘)→56℃(1分鐘)→72℃(1分鐘)]×45個(gè)循環(huán)→72℃(10分鐘)。將通過(guò)PCR產(chǎn)生的核酸用2％瓊脂糖凝膠展開(kāi)、分析。
免疫染色將培養(yǎng)第14天形成的集落用PBS洗滌3次，用甲醇固定(-20℃，10分鐘)后，用含有吐溫20(0.05％)的PBS(PBS-吐溫20)洗滌3次。用10％猴血清封閉后，使其與山羊抗胰島素抗體或小鼠抗胰高血糖素抗體反應(yīng)(4℃，16小時(shí))。用PBS-吐溫20洗滌3次后，再次進(jìn)行封閉，然后使其分別與Alexa 488標(biāo)記的猴抗山羊IgG抗體或Cy3標(biāo)記的猴抗小鼠IgG抗體反應(yīng)(4℃，3小時(shí))。最后用PBS-吐溫20洗滌3次后，用Zeiss LSM510激光掃描顯微鏡觀察、分析。
結(jié)果使用FACS，對(duì)于從新生小鼠制備的經(jīng)過(guò)配制的胰臟細(xì)胞，首先對(duì)活細(xì)胞(約80％)設(shè)置閘門(mén)，然后分別用抗CD45抗體和抗TER119抗體展開(kāi)，確定非血細(xì)胞流分即[CD45-、TER119-]細(xì)胞流分(約為全體的40％)。然后分別用抗c-Met(HGF受體)抗體和抗c-Kit(SCF受體)抗體進(jìn)一步展開(kāi)[CD45-、TER119-]細(xì)胞。[c-Met+、c-Kit+、CD45-、TER119-]細(xì)胞為全體細(xì)胞的約0.01％，[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-]細(xì)胞為全體細(xì)胞的約1.0％，[c-Met-、c-Kit+、CD45-、TER119-]細(xì)胞為全體細(xì)胞的約0.8％，[c-Met-、c-Kit-、CD45-、TER119-]細(xì)胞為全體細(xì)胞的約36％。將各流分中所含的細(xì)胞以存活狀態(tài)回收、培養(yǎng)(200細(xì)胞/cm2)，進(jìn)行體外集落測(cè)定。一些回收的細(xì)胞顯示出高的增殖能力，形成來(lái)自單細(xì)胞的克隆系集落。在培養(yǎng)第8天的觀察中，可觀察到由形態(tài)學(xué)上不同的細(xì)胞形成的集落主要有兩類(lèi)。將由上皮型細(xì)胞形成的集落命名為上皮集落，將成纖維細(xì)胞樣的集落命名為成纖維細(xì)胞樣集落。分別用這些不同的集落制備cDNA，通過(guò)PCR檢測(cè)各種胰臟機(jī)能細(xì)胞的標(biāo)志。結(jié)果只在上皮集落中檢測(cè)到了胰島素和胰高血糖素等胰臟機(jī)能細(xì)胞的標(biāo)志。這強(qiáng)烈顯示上皮集落形成細(xì)胞(ECFC)中含有胰臟干細(xì)胞/祖細(xì)胞。計(jì)量ECFC的數(shù)目，結(jié)果顯示ECFC限于[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-]細(xì)胞流分中，并且以高頻率存在(與未設(shè)置閘門(mén)的細(xì)胞相比為13.1倍，與[CD45-、TER119-]細(xì)胞流分相比為9.45倍)。
然后用RT-PCR法和免疫染色法分析這些ECFC是否具有胰臟干細(xì)胞/祖細(xì)胞特征之一的多向分化潛能。用RT-PCR法分析總計(jì)30個(gè)的克隆系集落，結(jié)果這些集落中，大多含有產(chǎn)胰高血糖素細(xì)胞α細(xì)胞、產(chǎn)胰島素細(xì)胞β細(xì)胞、產(chǎn)胰多肽細(xì)胞γ細(xì)胞、產(chǎn)促生長(zhǎng)素抑制素細(xì)胞δ細(xì)胞全部，或者含有其中幾種細(xì)胞，而且還發(fā)現(xiàn)了大量含有表達(dá)外分泌細(xì)胞的標(biāo)志即淀粉酶或脂酶的細(xì)胞的集落。使用免疫染色法時(shí)也一樣，證實(shí)了同一集落內(nèi)混合存在有產(chǎn)胰高血糖素細(xì)胞α細(xì)胞和產(chǎn)胰島素細(xì)胞β細(xì)胞。由這些結(jié)果可知，具有胰臟干細(xì)胞/祖細(xì)胞所具有的重要性質(zhì)之一的多向分化潛能的細(xì)胞(ECFC)在僅占新生小鼠胰臟細(xì)胞的1％的[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-]細(xì)胞流分中高頻率濃縮。同時(shí)表明這些細(xì)胞能用FACS以存活態(tài)分離、回收。
實(shí)施例2胰臟細(xì)胞的回收通過(guò)與實(shí)施例1同樣的方法回收胰臟細(xì)胞。使用與實(shí)施例1一樣的細(xì)胞培養(yǎng)液。
流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)除實(shí)施例1所用的各種標(biāo)記抗體或標(biāo)記試劑之外，還使用PE(藻紅蛋白)標(biāo)記的抗Flk-1單克隆抗體(PharMingen，San Jose，CA)，其他均以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行。
細(xì)胞的回收除了將與實(shí)施例1同樣的方法得到的[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-]細(xì)胞再分組為Flk-1陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞外，其他均以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行。
體外的集落分析以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行。
RT-PCR以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行。
免疫染色以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行。
結(jié)果將實(shí)施例1所得[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-]細(xì)胞再分組為Flk-1陽(yáng)性和陰性細(xì)胞。[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1-]細(xì)胞為全體細(xì)胞(回收的全部胰臟細(xì)胞)的約0.7％，[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1+]細(xì)胞為全體細(xì)胞的約0.3％。與實(shí)施例1一樣計(jì)量ECFC的數(shù)目，結(jié)果表明與[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-]細(xì)胞流分相比，ECFC更被限定于[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1-]細(xì)胞流分中，并且以高頻率存在(與未設(shè)置閘門(mén)的細(xì)胞相比為19.7倍，與[CD45-、TER119-]細(xì)胞流分相比為14.1倍)。
接著與實(shí)施例1一樣，用RT-PCR法和免疫染色法分析這些ECEF是否具有胰臟干細(xì)胞/祖細(xì)胞特征之一的多向分化潛能。結(jié)果可知，具有胰臟干細(xì)胞/祖細(xì)胞所具有的重要性質(zhì)之一的多向分化潛能的細(xì)胞(ECFC)在僅占新生小鼠胰臟細(xì)胞0.7％的[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1-]細(xì)胞流分中高頻率濃縮。同時(shí)可知這些細(xì)胞能用FACS以存活態(tài)分離、回收。
實(shí)施例3胰臟細(xì)胞的回收通過(guò)與實(shí)施例1同樣的方法回收胰臟細(xì)胞。使用與實(shí)施例1一樣的細(xì)胞培養(yǎng)液。
流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)除實(shí)施例1所用的各種標(biāo)記抗體或標(biāo)記試劑之外，還使用PE(藻紅蛋白)標(biāo)記的抗Flk-1單克隆抗體(PharMingen，San Jose，CA)，其他均以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行。
細(xì)胞的回收除了將與實(shí)施例1同樣的方法得到的[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-]細(xì)胞再分組為Flk-1陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞外，其他均以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行。
體外培養(yǎng)將通過(guò)FACS回收的細(xì)胞在與實(shí)施例1相同的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)(37℃，5％CO2)。培養(yǎng)開(kāi)始24小時(shí)后，加入人重組肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rHGF)(50ng/mL，Sigma)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(20ng/mL；Sigma)。在培養(yǎng)開(kāi)始后第30天通過(guò)流式細(xì)胞儀分離細(xì)胞，用RT-PCR分析由這些細(xì)胞形成的集落中所含細(xì)胞的分化標(biāo)志表達(dá)。
RT-PCR以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行。
結(jié)果將[c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1-]細(xì)胞培養(yǎng)30天后，通過(guò)流式細(xì)胞儀分離，對(duì)由這些細(xì)胞形成的集落中所含細(xì)胞的分化標(biāo)志的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果除各種胰臟細(xì)胞標(biāo)志外，還確認(rèn)了作為肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志的清蛋白、α-胎兒球蛋白、葡糖-6-磷酸酶、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、細(xì)胞角蛋白19、細(xì)胞角蛋白18、細(xì)胞角蛋白8、膽汁糖蛋白和作為胃腸細(xì)胞標(biāo)志的fabp-2、GIP、CCK、TPH、胃蛋白酶原F、胃泌素的表達(dá)。
詳見(jiàn)表1(17頁(yè)-19頁(yè))產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的胰臟干細(xì)胞或由該干細(xì)胞分化而來(lái)的各種機(jī)能細(xì)胞通過(guò)移植到糖尿病等胰臟機(jī)能減退疾病患者的體內(nèi)，有望使胰臟機(jī)能恢復(fù)，達(dá)到治療糖尿病等疾病的效果。而且，還有望實(shí)現(xiàn)治療肝、膽管或胃腸機(jī)能減退疾病的效果。
通過(guò)應(yīng)用該干細(xì)胞和/或機(jī)能細(xì)胞，可以篩選誘導(dǎo)胰臟干細(xì)胞分化的物質(zhì)、誘導(dǎo)向肝、膽管或胃腸分化的物質(zhì)、胰臟機(jī)能調(diào)節(jié)物質(zhì)和肝、膽管或胃腸機(jī)能調(diào)節(jié)物質(zhì)。這些物質(zhì)有望用作胰臟、肝、膽管或胃腸機(jī)能減退疾病的治療藥物。
本說(shuō)明書(shū)以在日本申請(qǐng)的特愿2001-126315為基礎(chǔ)，其全文都包含在本說(shuō)明書(shū)中。
表1



序列表獨(dú)立文本SEQ ID NO1設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰高血糖素原(preproglucagon)(α細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO2設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰高血糖素原(α細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO3設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰島素原I(β細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO4設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰島素原I(β細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO5設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰島素原II(β細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO6設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰島素原II(β細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO7設(shè)計(jì)用作檢測(cè)胰多肽(γ細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO8設(shè)計(jì)用作檢測(cè)胰多肽(γ細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO9設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前促生長(zhǎng)素抑制素原(δ細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO10設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前促生長(zhǎng)素抑制素原(δ細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO11設(shè)計(jì)用作檢測(cè)淀粉酶2(外分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO12設(shè)計(jì)用作檢測(cè)淀粉酶2(外分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO13設(shè)計(jì)用作檢測(cè)激素敏感解脂酶(外分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO14設(shè)計(jì)用作檢測(cè)激素敏感解脂酶(外分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO15設(shè)計(jì)用作檢測(cè)ipf1/pdx1基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO16設(shè)計(jì)用作檢測(cè)ipfl/pdx1基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO17設(shè)計(jì)用作檢測(cè)c-Met基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO18設(shè)計(jì)用作檢測(cè)c-Met基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO19設(shè)計(jì)用作檢測(cè)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT，陽(yáng)性對(duì)照)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO20設(shè)計(jì)用作檢測(cè)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT，陽(yáng)性對(duì)照)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO21設(shè)計(jì)用作檢測(cè)清蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO22設(shè)計(jì)用作檢測(cè)清蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO23設(shè)計(jì)用作檢測(cè)α-胎兒球蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO24設(shè)計(jì)用作檢測(cè)α-胎兒球蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO25設(shè)計(jì)用作檢測(cè)葡糖-6-磷酸酶(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO26設(shè)計(jì)用作檢測(cè)葡糖-6-磷酸酶(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO27設(shè)計(jì)用作檢測(cè)甲狀腺素運(yùn)載蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO28設(shè)計(jì)用作檢測(cè)甲狀腺素運(yùn)載蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO29設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白19(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO30設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白19(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO31設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO32設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO33設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白8(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO34設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白8(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO35設(shè)計(jì)用作檢測(cè)膽汁糖蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO36設(shè)計(jì)用作檢測(cè)膽汁糖蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO37設(shè)計(jì)用作檢測(cè)腸脂肪酸結(jié)合蛋白(胃腸細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO38設(shè)計(jì)用作檢測(cè)腸脂肪酸結(jié)合蛋白(胃腸細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO39設(shè)計(jì)用作檢測(cè)胃蛋白酶原F(胃腸細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
SEQ ID NO40設(shè)計(jì)用作檢測(cè)胃蛋白酶原F(胃腸細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸。
序列表<110>味之素株式會(huì)社(AJINOMOTO CO.，INC.)<120>干細(xì)胞及其分離方法<130>09474<150>JP 2001-126315<151>2001-04-24<160>40<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰高血糖素原(α細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>1atttactttg tggctggatt g21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰高血糖素原(α細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>2tgtcagtgat cttggtttga a21<210>3
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰島素原I(β細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>3ctgttggtgc acttcctacc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰島素原I(β細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>4gcagtagttc tccagctggt 20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰島素原II(β細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>5tcaagcagca cctttgtggt t21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前胰島素原II(β細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>6gttgcagtag ttctccagct g 21<210>7<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)胰多肽(γ細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>7ctccctgttt ctcgtatcca 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)胰多肽(γ細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>8agagcaggga at caagccaa20<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前促生長(zhǎng)素抑制素原(δ細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>9ctctgcatcg tcctggctt 19<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)前促生長(zhǎng)素抑制素原(δ細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>10caggatgtga atgtcttcca g 21<210>11<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)淀粉酶2(外分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>11agtacctgtg gaagttacct 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)淀粉酶2(外分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>12acacaagggc tctgtcagaa 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)激素敏感解脂酶(外分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>13tcttcttcga gggtgatgaa 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)激素敏感解脂酶(外分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>14taccttgctg tcctgtcctt20<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)ipf1/pdx1基因的PCR引物的寡核苷酸<400>15ttacaagctc gctgggatca c 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)ipf1/pdx1基因的PCR引物的寡核苷酸<400>16aggtcaccgc acaatcttgc t 21<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)c-Met基因的PCR引物的寡核苷酸<400>17agccagtaat gatctcaatg 20<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)c-Met基因的PCR引物的寡核苷酸<400>18tcaggatagg ggacaggt 18<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT，陽(yáng)性對(duì)照)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>19ctgtaatgat cagtcaacgg c 21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT，陽(yáng)性對(duì)照)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>20ggcctatagg ctcatagtgc a 21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)清蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>21catgacacca tgcctgctga t 21<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)清蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>22ctctgatctt caggaagtgt ac22<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)α-胎兒球蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸
<400>23actcacccca accttcctgt c21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)α-胎兒球蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>24cagcagtggc tgataccaga g21<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)葡糖-6-磷酸酶(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>25aacccattgt gaggccagag g 21<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)葡糖-6-磷酸酶(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>26tactcattac actagttggt c 21<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)甲狀腺素運(yùn)載蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>27
tggtatttgt gtctgaagct g 21<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)甲狀腺素運(yùn)載蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>28ttaataagaa tgcttcacgg c 21<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白19(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>29gtcctacaga ttgacaatgc 20<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白19(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>30cacgctctgg atctgtgaca g 21<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>31ggacctcagc aagatcatgg c 21
<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>32ccacgatctt acgggtagtt g 21<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白8(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>33agtctcagat ctcagacacg20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)細(xì)胞角蛋白8(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>34ccataggatg aactcagtcc20<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)膽汁糖蛋白(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>35gaactagact ctgtcaccct g 21
<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)膽汁糖蛋白(biliary glycoprotein)(肝、膽管細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>36gccagacttc ctggaataga 20<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)腸脂肪酸結(jié)合蛋白(fabp-2；胃腸細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>37attcgacggc acgtggaaag t 21<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)腸脂肪酸結(jié)合蛋白(fabp-2；胃腸細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>38aagaatcgct tggcctcaac t 21<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)胃蛋白酶原F(胃腸細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>39acctagacct ggtctacatt g 21
<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)用作檢測(cè)胃蛋白酶原F(胃腸細(xì)胞標(biāo)志)基因的PCR引物的寡核苷酸<400>40agtgaagctc tccatggtag t 2權(quán)利要求
1.從哺乳動(dòng)物的胰臟分離胰臟干細(xì)胞的方法，該方法使用2種或多種對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119的標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行。
2.從哺乳動(dòng)物的胰臟分離胰臟干細(xì)胞的方法，該方法使用2種或多種對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119和Flk-1的標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中具有特異親和性的物質(zhì)為標(biāo)志蛋白的抗體。
4.鑒別哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的方法，該方法使用2種或多種對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119的標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行。
5.鑒別哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的方法，該方法使用2種或多種對(duì)選自c-Met、c-Kit、CD45、TER119和Flk-1的標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中具有特異親和性的物質(zhì)為標(biāo)志蛋白的抗體。
7.從哺乳動(dòng)物的胰臟分離胰臟干細(xì)胞的方法，該方法包括分析選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119的2種或多種標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因的表達(dá)情況的步驟。
8.從哺乳動(dòng)物的胰臟分離胰臟干細(xì)胞的方法，該方法包括分析選自c-Met、c-Kit、CD45、TER119和Flk-1的2種或多種標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因的表達(dá)情況的步驟。
9.鑒別哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的方法，該方法包括分析選自c-Met、c-Kit、CD45和TER119的2種或多種標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因的表達(dá)情況的步驟。
10.鑒別哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的方法，該方法包括分析選自c-Met、c-Kit、CD45、TER119和Flk-1的2種或多種標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因的表達(dá)情況的步驟。
11.胰臟干細(xì)胞，該胰臟干細(xì)胞用權(quán)利要求1、2、7或8中任一項(xiàng)的方法從哺乳動(dòng)物的胰臟分離得到。
12.權(quán)利要求11的胰臟干細(xì)胞，該胰臟干細(xì)胞以c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-的形式顯示c-Met、c-Kit、CD45和TER119這四個(gè)標(biāo)志。
13.權(quán)利要求11的胰臟干細(xì)胞，該胰臟干細(xì)胞以c-Met+、c-Kit-、CD45-、TER119-、Flk-1-的形式顯示c-Met、c-Kit、CD45、TER119和Flk-1這五個(gè)標(biāo)志。
14.預(yù)防或治療胰臟機(jī)能減退疾病的藥物，該藥物含有權(quán)利要求12或13的胰臟干細(xì)胞或從該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞。
15.預(yù)防或治療肝、膽管或胃腸機(jī)能減退疾病的藥物，該藥物含有權(quán)利要求12或13的胰臟干細(xì)胞或從該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞。
16.篩選誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞分化的物質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟(i)使胰臟干細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟，(ii)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中胰臟標(biāo)志表達(dá)的步驟。
17.篩選誘導(dǎo)向哺乳動(dòng)物的肝、膽管或胃腸分化的物質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟(i)使權(quán)利要求12或13的胰臟干細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟，(ii)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中肝、膽管或胃腸標(biāo)志表達(dá)的步驟。
18.篩選哺乳動(dòng)物的胰臟機(jī)能調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟(i)使胰臟干細(xì)胞或從該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟，(ii)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中胰臟標(biāo)志表達(dá)的步驟。
19.篩選哺乳動(dòng)物的肝、膽管或胃腸機(jī)能調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法，該方法包括下述步驟(i)使權(quán)利要求12或13的胰臟干細(xì)胞或從該干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞與測(cè)試物反應(yīng)的步驟，(ii)測(cè)定反應(yīng)后細(xì)胞中肝、膽管或胃腸標(biāo)志表達(dá)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供從哺乳動(dòng)物的胰臟分離胰臟干細(xì)胞的方法和鑒別哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的方法以及通過(guò)所述方法分離、鑒別得到的胰臟干細(xì)胞的用途。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供哺乳動(dòng)物的胰臟干細(xì)胞的分離方法和鑒別方法，所述方法包括對(duì)選自c－Met、c－Kit、CD45和TER119和Flk－1的2種或多種標(biāo)志蛋白或編碼該蛋白的基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1518593SQ0281247
公開(kāi)日2004年8月4日 申請(qǐng)日期2002年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月24日
發(fā)明者谷口英樹(shù), 鈴木淳史, 史 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社