經(jīng)血保存液及其應(yīng)用、經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及經(jīng)血保存液及其應(yīng)用、經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞 的分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 子宮是一個(gè)具有高度再生及分化能力的組織，每個(gè)月經(jīng)周期，女性的子宮內(nèi)膜可 以從0.5_左右增長(zhǎng)到5~7mm左右，一個(gè)女性一生可以經(jīng)歷400次這樣的循環(huán)。研究表明，子 宮內(nèi)膜中含有干細(xì)胞，具有高度的分化潛能，增殖能力以及較低的免疫源性。但是其直接獲 得途徑，包括子宮切除術(shù)、早期妊娠脫膜、刮除術(shù)均對(duì)供者具有嚴(yán)重侵入性。
[0003] 近年來(lái)，日本科學(xué)家在女性經(jīng)血中發(fā)現(xiàn)了具有多向分化潛能的干細(xì)胞，該干細(xì)胞 可用于修復(fù)受損的心肌組織。2008年，美國(guó)科學(xué)家Patel等發(fā)現(xiàn)，從健康女性經(jīng)血中可分離 出來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有多向分化能力，并將該細(xì)胞命名為經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細(xì) 胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells JenSCshMenSCs屬于成體干細(xì) 胞的一種，具有來(lái)源豐富、有效成分含量豐富、收集過(guò)程無(wú)創(chuàng)、增殖和分化潛能巨大、無(wú)倫理 爭(zhēng)論及廢物回收利用等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，研究表明，宮內(nèi)膜干細(xì)胞可以用于治療卵巢早衰、子宮 內(nèi)膜疾病、預(yù)防衰老等功能，有望成為較為理想的種子細(xì)胞。
[0004] 目前，對(duì)于宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，多采用直接獲得途徑，對(duì)患者造成很大的傷 害，同時(shí)來(lái)源苦難以及受倫理限制等問(wèn)題;經(jīng)血源干細(xì)胞雖有少量研究，但是其無(wú)簡(jiǎn)單方便 的方法采集經(jīng)血，導(dǎo)致經(jīng)血受污染幾率較高，獲得的干細(xì)胞數(shù)量較少，純度較低，分化潛能 較低，同時(shí)成本較高、過(guò)程復(fù)雜等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供經(jīng)血保存液及其應(yīng)用、經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方 法。利用女性經(jīng)血作為干細(xì)胞采集來(lái)源，廢物利用，變廢為寶，來(lái)源豐富；月經(jīng)血中富含宮內(nèi) 膜干細(xì)胞的數(shù)量為骨髓的30倍有效成分含量豐富；采用經(jīng)血保存液進(jìn)行保存，避免經(jīng)血在 采集到分離的過(guò)程中受外界污染。本發(fā)明采用獨(dú)特配方的經(jīng)血保存液對(duì)經(jīng)血進(jìn)行保存，顯 著(P<0.05)降低了經(jīng)血的污染率，同時(shí)保證了獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的純度和活力。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種經(jīng)血保存液，包括抗生素、枸櫞酸鈉和肝素鈉。
[0008] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述經(jīng)血保存液中所述抗生素選自青霉素、鏈 霉素或卡那霉素。
[0009] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述經(jīng)血保存液中所述卡那霉素的濃度為30~ 50yg/mL〇
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述經(jīng)血保存液中所述枸櫞酸鈉的濃度為30~ 50μg/ml〇
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述經(jīng)血保存液中所述肝素鈉為100U/ml肝素 鈉的磷酸鹽緩沖液。
[0012] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述經(jīng)血保存液包括(2~5) X青霉素、（2~5) X鏈霉素、30~50μg/ml卡那霉素、30~50μg/ml枸櫞酸鈉、100U/ml肝素鈉的磷酸鹽緩沖液。
[0013] 本發(fā)明提供的所述經(jīng)血保存液在保存經(jīng)血中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供了經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0015] 步驟1:獲得經(jīng)血;采用所述經(jīng)血保存液保存所述經(jīng)血；
[0016] 步驟2:取所述經(jīng)血稀釋后獲得經(jīng)血稀釋液，與分離液混合、離心；
[0017]步驟3:收集上清液清洗后，再與培養(yǎng)基混合，離心；
[0018] 步驟4:收集沉淀，接種，培養(yǎng)。
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟2中所述稀釋為經(jīng)PBS溶液 按照體積比1:1的比例稀釋?zhuān)?br>[0020] 步驟2中所述分離液為Ficoll分離液，所述經(jīng)血稀釋液與所述分離液的體積比為1 :(0.5 ~1);
[0021 ] 步驟2中所述離心為于700~800g離心15~30min。
[0022] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟3中所述清洗為用PBS清洗 2~4次；
[0023] 步驟3中所述培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0024] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟4中所述接種的密度為（7 ~8) X105/mL〇
[0025] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟4中所述培養(yǎng)為48h后半量 換液，72h后全量換液，之后每3d換液1次，7~14d在顯微鏡下觀察到克隆的形成，當(dāng)細(xì)胞生 長(zhǎng)至70~80 %匯合時(shí)，胰蛋白酶消化。
[0026] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)方案中，所述分離培養(yǎng)方法所述胰蛋白酶消化為棄去培養(yǎng) 基，清洗，加質(zhì)量濃度為〇. 3~0.5 % (w/w)的胰蛋白酶消化，傳代。
[0027]在本發(fā)明的一些具體實(shí)方案中，所述分離培養(yǎng)方法所述消化的時(shí)間為2~3min，終 止消化，離心，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。
[0028] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)方案中，所述分離培養(yǎng)方法所述終止消化采用細(xì)胞體積3-5倍量的含5 % FBS的培養(yǎng)基；
[0029] 所述離心為lOOOrpm離心5min。
[0030] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟1中獲得的經(jīng)血采用經(jīng)血 保存液保存;所述經(jīng)血保存液包括(2-5) X青霉素、（2-5) X鏈霉素、30~50μg/ml卡那霉素、 30~50μg/ml枸櫞酸鈉、100U/ml肝素鈉的磷酸鹽緩沖液。
[0031] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟2所述與分離液混合和/或 步驟3中所述清洗采用隔層離心管。
[0032] 本發(fā)明提供了經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟:獲得經(jīng)血;取 所述經(jīng)血稀釋后獲得經(jīng)血稀釋液，與分離液混合、離心；收集上清液清洗后，再與培養(yǎng)基混 合，離心；收集沉淀，接種，培養(yǎng)。利用女性經(jīng)血作為干細(xì)胞采集來(lái)源，廢物利用，變廢為寶， 來(lái)源豐富；月經(jīng)血中富含宮內(nèi)膜干細(xì)胞的數(shù)量為骨髓的30倍有效成分含量豐富;采用經(jīng)血 保存液進(jìn)行保存，避免經(jīng)血在采集到分離的過(guò)程中受外界污染。本發(fā)明采用獨(dú)特配方的經(jīng) 血保存液對(duì)經(jīng)血進(jìn)行保存，顯著(P<〇.05)降低了經(jīng)血的污染率，同時(shí)保證了獲得的經(jīng)血源 宮內(nèi)膜干細(xì)胞的純度和活力。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下有益效果：
[0034] 1、利用女性經(jīng)血作為干細(xì)胞采集來(lái)源，完全是廢物利用，變廢為寶，對(duì)供者沒(méi)有任 何傷害，安全無(wú)痛;來(lái)源豐富，每位女性自月經(jīng)初潮至絕經(jīng)，在連續(xù)30多年的時(shí)間中，每個(gè)月 都有宮內(nèi)膜干細(xì)胞的大量生成；同時(shí)，月經(jīng)血中富含宮內(nèi)膜干細(xì)胞的數(shù)量為骨髓的30倍有 效成分含量豐富。
[0035] 2、本發(fā)明采用專(zhuān)門(mén)的經(jīng)血采集套裝采集經(jīng)血，本采集方法更能使供者接受，同時(shí) 能夠避免經(jīng)血污染。
[0036] 3、在采集經(jīng)血時(shí)，采用專(zhuān)門(mén)的經(jīng)血保存液進(jìn)行保存，避免經(jīng)血在采集到分離的過(guò) 程中受外界污染。
[0037] 4、本發(fā)明采用隔層離心管和細(xì)胞貼壁方法相結(jié)合對(duì)宮內(nèi)膜干細(xì)胞進(jìn)行分離，并利 用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)單，成本更低，同時(shí)可以得到純度較高、數(shù)量較多、分化能力較 強(qiáng)的經(jīng)血宮內(nèi)膜干細(xì)胞。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0039] 圖1示實(shí)施例1制備獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)觀察圖；其中，圖1(A) 示原代培養(yǎng)2天，40倍；圖1(B)示原代培養(yǎng)2天，100倍；圖1(C)示原代培養(yǎng)7天，40倍；圖1(D) 示原代培養(yǎng)7天，100倍；
[0040] 圖2示對(duì)比例制備獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)觀察圖；其中，圖2(A)示 原代培養(yǎng)2天，40倍;圖2(B)示原代培養(yǎng)2天，100倍;圖2(C)示原代培養(yǎng)11天，40倍;圖2(D)示 原代培養(yǎng)11天，1〇〇倍；
[0041] 圖3示實(shí)施例1制備獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的細(xì)胞流式鑒定結(jié)果;其中圖3(A) ~圖3(C)示對(duì)照組的細(xì)胞流式鑒定結(jié)果；圖3(D)~圖3(F)示樣品組的細(xì)胞流式鑒定結(jié)果；
[0042] 圖4示對(duì)比例制備獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的細(xì)胞流式鑒定結(jié)果；其中圖4(A) ~圖4(C)示對(duì)照組的細(xì)胞流式鑒定結(jié)果；圖4(D)~圖4(F)示樣品組的細(xì)胞流式鑒定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明公開(kāi)了經(jīng)血保存液及其應(yīng)用、經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替 換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方 法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和 范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0044] 本發(fā)明具體的實(shí)施方案如下：
[0045] 1.經(jīng)血采集套裝的準(zhǔn)備：
[0046] 包括一個(gè)無(wú)菌標(biāo)本保存瓶（內(nèi)含有5_15ml經(jīng)血保存液）、一個(gè)經(jīng)過(guò)滅菌的月事杯、 一對(duì)手套、一個(gè)巴氏吸管、一份說(shuō)明書(shū)。
[0047]經(jīng)血保存液為內(nèi)含有（2-5) X青霉素、（2-5) X鏈霉素、30-50μg/ml卡那霉素、30-50μg/ml枸櫞酸鈉、100U/ml肝素鈉的磷酸鹽緩沖液。